石云 洪鍵

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.011[HT9.]

摘要：Ldhc基因僅在哺乳動物成熟的睪丸和精子中表達(dá)，并在哺乳動物的睪丸中普遍存在剪接體現(xiàn)象，但是Ldhc基因在肌肉和心臟組織中的表達(dá)情況以及與睪丸中該基因的表達(dá)豐度比較尚不清楚。因此，以小鼠為研究對象，首先檢測小鼠肌肉和心臟組織中Ldhc基因的表達(dá)類型，然后采用熒光定量和Western Blot比較分析3個組織中Ldhc基因和蛋白的表達(dá)豐度。結(jié)果表明，在小鼠肌肉和心臟組織中未檢測到cDNA全長，卻發(fā)現(xiàn)2種Ldhc剪接體，參照小鼠Ldhc基因結(jié)構(gòu)分析了選擇性剪接體的結(jié)構(gòu)；剪接體1包含完整酶的NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酶的活性中心，有可能表達(dá)蛋白；剪接體2缺失第4、7外顯子。對小鼠肌肉、心臟和睪丸組織乳酸脫氫酶（LDH）同工酶的電泳分析未檢測到潛在的Ldhc剪接體的表達(dá)。熒光定量檢測發(fā)現(xiàn)，Ldhc基因在睪丸組織中的表達(dá)量要顯著高于肌肉和心臟組織，而Western Blot僅在睪丸組織中檢測到LDHC4蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果表明，小鼠Ldhc基因的選擇性剪接機制也存在于肌肉和心臟組織中，推測可能是調(diào)控該基因在肌肉和心臟組織中沉寂的方式之一。

關(guān)鍵詞：小鼠；乳酸脫氫酶-C；肌肉；心臟

中圖分類號： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號：1002-1302（2017）13-0043-03[HS）][HT9.SS]

[HJ1.4mm]

收稿日期：2016-12-20

基金項目：江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程（編號：PPZY2015A097）；鹽城市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（編號：YK2013048）。

作者簡介：石云（1982—），女，吉林集安人，碩士，講師，主要從事天然藥用活性物質(zhì)研究。Tel：（0515）88233192；E-mail：shiyun210@163.com。[HJ]

[ZK）]

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，簡稱LDH）是一類四聚體寡聚酶，廣泛存在于脊椎動物、植物和細(xì)菌中[1]。在哺乳動物中，LDH存在3種類型的同工酶亞基：LDH-A（肌肉型）、LDH-B（心臟型）和LDH-C（睪丸型），分別由A、B、C基因編碼[1]。而由Ldhc基因編碼的乳酸脫氫酶-C4首先是在多種哺乳動物、鳥類成熟睪丸組織和精子中被發(fā)現(xiàn)[2-3]。研究表明，LDH-C4由4個C亞基以四聚體形式組成，編碼LDH-C4的C亞基基因也不同于編碼A、B亞基的基因，而且不與A、B亞基結(jié)合[4]。有關(guān)LDH-C4的基礎(chǔ)研究已有較多報道，涉及酶的活力與分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、免疫原性、細(xì)胞內(nèi)的定位、酶活性隨生長發(fā)育的變化等方面。

人、小鼠等哺乳動物L(fēng)dhc基因已經(jīng)被克隆，Ldhc基因由側(cè)翼5′端和3′端調(diào)控序列、外顯子以及內(nèi)含子區(qū)域共同組成，編碼區(qū)全長序列包括8個外顯子，編碼332個氨基酸[5]。然而，Koslowski等報道，在人的腫瘤細(xì)胞中共檢測到6種Ldhc剪接變異體，而這些變異體在正常細(xì)胞中是不存在的[6]。Coonrod等通過蛋白組學(xué)的分析方法，在鼠卵細(xì)胞和著床前的早期胚胎中也意外地檢測到了LDH-C4的表達(dá)，但是其功能尚不清楚[7]。筆者在以前的研究中從牦牛、狗和大鼠睪丸組織中均發(fā)現(xiàn)了4或5種Ldhc剪接體，并且在牦牛肌肉和心臟組織中還意外地檢測到Ldhc的2種剪接體[8-9]。Huang等在小鼠睪丸組織中檢測到了cDNA全長和Ldhc的多種剪接體[10]。因此，這些研究結(jié)果不僅改變了長期以來有關(guān)LDH-C4僅分布于睪丸和精子中的觀點，而且能夠為其進(jìn)一步的功能分析以及表達(dá)調(diào)控等方面研究提供新線索。這些研究結(jié)果同時提示，[WTBX][STBX]LDH-C4[WTBZ][STBZ]基因的選擇性剪接現(xiàn)象不但在不同物種中普遍存在，而且也極有可能在同一物種不同的組織中廣泛存在。雖然在小鼠睪丸組織中也檢測到了Ldhc基因的剪接體，但Ldhc基因在乳酸脫氫酶分布非常豐富的肌肉和心臟組織中是否也存在剪接體，并且其表達(dá)方式和豐度與睪丸中有什么不同都尚不清楚。本研究探討了小鼠肌肉和心臟組織中Ldhc基因的表達(dá)方式以及與睪丸組織中該基因的表達(dá)豐度比較。

1材料與方法

1.1材料

試驗所用成年雄性C57BL/6小鼠（n=6），購自揚州大學(xué)比較實驗動物中心。小鼠采用腹腔注射麻醉致死，采集腓腸肌、心臟和睪丸組織，樣品均保存于-70 ℃。

1.2方法

1.2.1小鼠肌肉組織總RNA的提取

將小鼠腓腸肌和心臟組織于液氮中研磨成粉，稱取40 g組織樣，用TRIzol試劑（Invitrogen公司）按操作說明從組織中提取總RNA。提取的總RNA按照RNA PCR Kit （AMV） Ver. 3.0（TaKaRa公司）試劑盒的操作反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2小鼠Ldhc cDNA的克隆

根據(jù)小鼠的Ldhc基因序列（GenBank登錄號為NM_013580）設(shè)計PCR引物，PCR正向、反向引物依次為：5′-CGGAGTCAGCAGTAAGGCTCAAC-3′、5′-AGCAGATTTCCGTTTGAGGTCAG-3′；引物由上海Invitrogen公司合成。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠純化試劑盒直接純化后，采用TaKaRa公司的pMD 19-T載體進(jìn)行克隆，宿主菌為大腸桿菌DH5α。挑取60個陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后，插入片段大小不同的克隆產(chǎn)物送上海Invitrogen公司進(jìn)行雙鏈測序，序引物為pUC系列載體的通用引物M13F和M13R。用VectorNTI軟件對克隆子的核酸序列進(jìn)行比對分析。endprint