李淑娟+李長(zhǎng)慧+張英+劉艷霞

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE）技術(shù)對(duì)青海鵝觀草屬10個(gè)野生種質(zhì)資源進(jìn)行酯酶同工酶（EST）檢測(cè)和分析。結(jié)果表明，鵝觀草屬10個(gè)種質(zhì)的酯酶同工酶譜帶共有9條，形成4個(gè)區(qū)域（A、B、C、D），其中Rf值為0.198、0.469、0.630的這3條酶帶為共有帶，其余則為各份材料的特征帶；各種質(zhì)材料間的酯酶同工酶表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性，說(shuō)明鵝觀草屬10個(gè)種質(zhì)不同種及部分種的不同居群在遺傳本質(zhì)上是有區(qū)別的。聚類(lèi)分析表明，鵝觀草屬10個(gè)野生種質(zhì)資源可聚為3個(gè)類(lèi)群。

關(guān)鍵詞：鵝觀草屬；種質(zhì)資源；酯酶同工酶；聚類(lèi)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S543+.202文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A[HK]

文章編號(hào)：1002-1302（2017）13-0024-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-12-24

基金項(xiàng)目：青海省科學(xué)技術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃（編號(hào)：2014-ZJ-712）。

作者簡(jiǎn)介：李淑娟（1967—），女，青海貴德人，碩士，教授，主要從事牧草種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：lsjqhu@163.com。

[ZK）]

鵝觀草屬（Roegneria C. Koch）為小麥族（Trit-iceae Dumortier）近緣屬中植物種類(lèi)最多的多年生大屬，現(xiàn)有120多種，我國(guó)有70多種[1]。該屬許多物種是草原或草甸的組成成分，而且許多種類(lèi)可作為優(yōu)良牧草加以利用，也有部分種類(lèi)含抗逆基因，可作為麥類(lèi)作物培育新品種的寶貴資源。目前僅青海省鵝觀草屬植物就有23種、3個(gè)變種，廣泛分布于三江源、祁連山地的大部分地區(qū)。其中的多數(shù)種具有抗寒、耐旱、耐鹽堿、耐貧瘠等優(yōu)良特性，是高寒地區(qū)天然草場(chǎng)的重要組成成分和優(yōu)良的牧草，也是高海拔地區(qū)人工草地建設(shè)、草地改良、水土保持以及生態(tài)環(huán)境建設(shè)的首選草種。然而，鵝觀草屬植物種間由于形態(tài)特征較為相似，可作為分類(lèi)依據(jù)的器官結(jié)構(gòu)較為細(xì)微，其分類(lèi)在禾本科中一直屬于難度較大的屬。

同工酶是一種特異蛋白質(zhì)，是基因的直接產(chǎn)物，同工酶的差異反映基因的表達(dá)差異[2]。同工酶作為一種便捷的分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，如探討物種的起源進(jìn)化、了解植物居群的遺傳結(jié)構(gòu)、研究種內(nèi)遺傳多樣性等，在植物的種群、發(fā)育及遺傳研究中，尤其對(duì)其種間分類(lèi)及親緣關(guān)系的研究有重要意義[3-9]。采用同工酶分析技術(shù)對(duì)種間、品種間的分類(lèi)研究已比較廣泛，其方法、技術(shù)較為成熟。從目前的研究來(lái)看，尚未有學(xué)者對(duì)于分布在青海地區(qū)的鵝觀草屬植物從生化水平上進(jìn)行研究。本研究采用酯酶同工酶技術(shù)對(duì)分布于青海三江源區(qū)的鵝觀草屬10個(gè)野生種質(zhì)資源6種[玉樹(shù)鵝觀草（Roegneria yushuensis）、毛穂鵝觀草（Roegneria trichospicula）、短柄鵝觀草（Roegneria brevipes Keng）、曲芒異芒草（Roegneria abolinii var. divaricans Nevski）、紫穂鵝觀草（Roegneria purpurascens Keng）、肅草（Roegneria stricta Keng）]及部分種的4個(gè)居群進(jìn)行酶酯同工酶譜帶特征分析，從生化水平探討不同材料間的遺傳差異，為該屬材料的選擇利用及親緣關(guān)系判定提供科學(xué)依據(jù)，這也是對(duì)該生態(tài)草種進(jìn)行深入研究及合理開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

本試驗(yàn)所采用的鵝觀草屬10份野生種質(zhì)材料種子均采自青海三江源地區(qū)，于2015年5月種植于青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院草業(yè)科學(xué)系牧草試驗(yàn)田，待供試材料生長(zhǎng)至幼苗期采集幼葉作為試驗(yàn)材料。其編號(hào)、物種名稱(chēng)及采集地等信息見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1酶提取液制備分別稱(chēng)取10個(gè)試驗(yàn)材料的葉片（幼葉）各1 g，洗凈后用濾紙吸干水分，剪碎后置于預(yù)冷的小研缽中，加入少量提樣緩沖液，在冰浴中研磨勻漿，移入離心管中，10 000 r/mim、4 ℃，離心15 min，取0.5 mL上清液，加入等量的樣品處理液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（PAGE）電泳采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術(shù)[10]，分離膠濃度為7.5%，緩沖液pH值為8.8，濃縮膠濃度為3%，緩沖液pH值為6.8，凝膠厚度為1.5 mm。電極緩沖液為T(mén)ris-Gly緩沖液（pH值 8.3），上樣量每槽為20 μL。電泳時(shí)，電流20 mA，濃縮膠電壓為200 V，分離膠電壓為220 V，溫度4 ℃左右，恒壓電泳至溴酚藍(lán)遷移到距凝膠末端1.0 cm處為止。

1.2.3染色、固定及照相電泳結(jié)束后，采用醋酸萘酯-固蘭RR鹽染色法染色[11]，室溫下染色至酶帶清晰為止，用水漂洗終止染色，用7%冰乙酸固定5 min，清水漂洗后觀察結(jié)果并拍照記錄。

1.2.4酶帶分析及數(shù)據(jù)處理根據(jù)相對(duì)遷移率Rf繪制模式圖并標(biāo)定酶帶位置[12]：

Rf=酶帶的遷移距離/前沿指示劑（溴酚藍(lán)） 的遷移距離。

根據(jù)同工酶膠板上的譜帶分布確定帶的有無(wú)，并轉(zhuǎn)化成二項(xiàng)數(shù)據(jù)，在同一Rf值處，有譜帶的記為1，無(wú)譜帶的記為0。把同工酶譜信息處理為0、1數(shù)據(jù)后，采用NTSYSpc-2.10s 統(tǒng)[CM（25]計(jì)軟件用非加權(quán)組平均法（UPGMA）[13]分析10份材料的酯酶同工酶連鎖類(lèi)群，構(gòu)建酶譜聚類(lèi)樹(shù)狀圖，進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2結(jié)果與分析

2.1酶帶及酶譜分布特征

譜帶的數(shù)量、出現(xiàn)位點(diǎn)是判斷區(qū)分不同種和品種的直觀依據(jù)。由圖1、表2可知，供試的10個(gè)種質(zhì)材料的酯酶同工酶酶譜共55條酶帶，鵝觀草屬10個(gè)種質(zhì)的酯酶同工酶譜帶共有9條，形成4個(gè)區(qū)域（A、B、C、D），每份材料顯示的酶譜帶5～6條不等。把它們分成A、B、C、D 4個(gè)區(qū)，其中A區(qū)為慢速遷移區(qū)，有1條酶帶，Rf值為0.198；B區(qū)為中速遷移區(qū)，酶帶數(shù)2～3條不等，Rf值在0.259～0.469之間；C區(qū)為較快速遷移區(qū)，Rf值為0.630，也僅有1條酶帶；D區(qū)為快速遷移區(qū)，酶帶數(shù)1～2條不等，Rf值在0.765～0.889之間。endprint

由圖2可以看出，10 個(gè)種質(zhì)材料中種間酯酶同工酶酶譜具有一定的差異，主要表現(xiàn)在酶帶數(shù)、酶帶遷移率、酶帶的活性強(qiáng)度上。A、B、C區(qū)內(nèi)都有各自的公共帶，其中A1、B4、C1是10 個(gè)種質(zhì)材料的共有帶，酶帶相對(duì)穩(wěn)定，酶活性較強(qiáng)，其余酶帶則為各份材料的特征帶，說(shuō)明酯酶同工酶譜帶表現(xiàn)出較強(qiáng)的多態(tài)性。A區(qū)的公共帶Rf=0.198，B區(qū)的公共帶Rf=0469，C區(qū)的公共帶Rf=0.630。從總體趨勢(shì)看出，D區(qū)酶的活性最強(qiáng)，其次是B區(qū)，C區(qū)的活性最弱。

從同種的不同居群間酶譜來(lái)看，同為玉樹(shù)鵝觀草的R1、R5 2個(gè)居群各自的酶帶數(shù)、酶帶遷移率及酶帶的活性均大致相同，R2在B1位點(diǎn)表現(xiàn)有特征帶，與R1、R5的酶譜有差異，表明在遺傳上存在分化；同為短柄鵝觀草的R6、R9 2個(gè)居群的酶帶數(shù)相同，但酶帶的活性不同，R6僅D2 1條強(qiáng)帶，R9有2條強(qiáng)帶，其酶活性及含量均強(qiáng)于R6；曲芒異芒草R3、R7 2個(gè)居群酶帶數(shù)相同，R3有2條強(qiáng)帶，在D3位點(diǎn)有特征帶，R7只有1條強(qiáng)帶，R3、R7的酶譜有明顯差異?？梢钥闯?，各種間不僅酶帶總數(shù)不同，而且在各個(gè)區(qū)域分布的位點(diǎn)、帶級(jí)也明顯不同，而同一物種的不同居群間酶譜既具有較穩(wěn)定的相似性，又具有細(xì)微差異。

2.2酯酶同工酶酶譜相似系數(shù)聚類(lèi)

從表3可以看出，鵝觀草屬10個(gè)種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.167～1.000，其中R1與R5的相似系數(shù)最高，說(shuō)明它們的相似性最高，基本沒(méi)有遺傳分化；而R3與R9的相似系數(shù)最低，僅為0.167，說(shuō)明它們的相似性最低，二者的親緣關(guān)系很遠(yuǎn)。所有樣品在聚類(lèi)距離約0.65處可分支為3個(gè)類(lèi)群，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)；在第Ⅰ類(lèi)群中，R1、R2、R4、R5、R10親緣關(guān)系一致；在第Ⅱ類(lèi)群中，R6、R7、R9親緣關(guān)系較近；在第Ⅲ類(lèi)群中，R3、R8親緣關(guān)系較近（圖3）。

3討論與結(jié)論

魏秀華等利用同工酶技術(shù)研究鵝觀草屬的3個(gè)物種的生物系統(tǒng)關(guān)系，解決了這3個(gè)物種的劃分問(wèn)題[14]。本研究中鵝觀草屬的曲芒異芒草（R3）與玉樹(shù)鵝觀草（R2）、毛穗鵝觀草（R4）、短柄鵝觀草（R6）及紫穗鵝觀草（R10）在酯酶同工酶譜帶上存在不同程度的差異，各種間不僅酶帶總數(shù)不同，而且在各個(gè)區(qū)域分布的位點(diǎn)及帶級(jí)也明顯不同，其遺傳一致度較低（0.167～0.333）。玉樹(shù)鵝觀草的2個(gè)居群（R1、R5）及短柄鵝觀草的2個(gè)居群（R6、R9）的遺傳一致度很高（1000），但酶帶的活性具有一定的差異性。同為玉樹(shù)鵝觀草的R2居群則與其他2個(gè)居群（R1、R5）在譜帶分布上也有所不同，遺傳相似度為0.833。居群之間具有相同或不同的酶帶數(shù)，或者遷移率之間差異很小，可以認(rèn)為它們既有共同的遺傳基礎(chǔ)，而且隨著時(shí)空的變化又有變異的表現(xiàn)。這與前人的相關(guān)研究結(jié)果相似，即種子植物屬內(nèi)種間的遺傳一致度約為0.67，種內(nèi)居群間的遺傳一致度約為0.90[15]。

基于遺傳相似系數(shù)的酶譜樹(shù)狀聚類(lèi)結(jié)果顯示，種源相同、地理位置分布較近、海拔近似的鵝觀草屬植物如R1、R2、R4、R5、R10聚為一類(lèi)；曲芒異芒草的2個(gè)居群R3、R7并未聚在一起，而是海拔較高的R7（3 200 m）與R6、R9聚為一類(lèi)，海拔較低的R3（2 500 m）、R8（2 700 m）2個(gè)居群聚為一類(lèi)。說(shuō)明鵝觀草屬植物的聚類(lèi)與種源地、海拔、生境有一定關(guān)系，海拔差異小的居群遺傳距離也較小。

鵝觀草屬10個(gè)種質(zhì)資源的酯酶同工酶酶譜類(lèi)型豐富，酶帶數(shù)量、帶級(jí)、位點(diǎn)及活性強(qiáng)度等表現(xiàn)出一定差異，各自具有特征譜帶，且所具有的共有帶的帶級(jí)、酶含量、活性強(qiáng)度也不盡相同，說(shuō)明利用這些酶譜特征找出供試材料間的細(xì)微差異是可行的，由此表明，供試材料具有獨(dú)立的遺傳關(guān)系，之間有一定的遺傳分化，是進(jìn)行生化水平鑒定的有利指標(biāo)。酶譜分析作為揭示物種遺傳背景的方法，還受生理、發(fā)育狀態(tài)及人為等因素的干擾，所以應(yīng)該將其與其他方法包括形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方法結(jié)合起來(lái)才能得出更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果[16]。對(duì)該屬植物采用其他種類(lèi)酶[如過(guò)氧化物酶（POD）同工酶、細(xì)胞色素氧化酶]分析，尚待進(jìn)一步研究。

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