成克倫 周永松 陳秀嬋 熊云剛 鄒陽強 姜 森 鄧劉丹

（1.貴州航天醫(yī)院病理科，貴州遵義563000；2.廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司技術部，廣東廣州510663）

FISH法對肺腺癌穿刺標本EML4-ALK融合基因的檢測

成克倫1周永松1陳秀嬋1熊云剛1鄒陽強1姜 森1鄧劉丹2

（1.貴州航天醫(yī)院病理科，貴州遵義563000；2.廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司技術部，廣東廣州510663）

目的 探討采用肺腺癌穿刺活檢標本檢測棘皮動物微管相關類蛋白4（EML4）與間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因（EML4-ALK）的可行性。方法 對20例肺腺癌經(jīng)皮肺穿刺標本應用熒光原位雜交（FISH）法檢測EML4-ALK融合基因。結果 20例標本中，19例通過FISH檢測成功，檢測成功率為95.00%。其中陽性2例，陽性率為10.00%。結論 肺腺癌穿刺活檢標本可用作檢測EML4-ALK融合基因，為靶向治療提供參考依據(jù)。

熒光原位雜交；肺腺癌；EML4-ALK融合基因；經(jīng)皮肺穿刺

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤之首，老年人發(fā)病比較多見。最常見的類型是鱗癌和腺癌，腺癌的發(fā)病率近年來有所上升，已占到60%左右[1]。腺癌的治療除手術和放、化療外，分子靶向藥物應用是目前的一個熱點，本研究通過FISH法，探索肺腺癌穿刺標本EML4-ALK檢測的可行性，為靶向治療作一參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料：收集2015年1月至6月在貴州航天醫(yī)院經(jīng)皮肺穿刺的肺腺癌活檢標本20例，鏡檢癌細胞數(shù)均＞50個。在20例患者中，男13例，女7例，年齡43～78歲，中位年齡61歲。實性為主性腺癌5例，腺泡為主性腺癌12例，黏液為主性腺癌2例，乳頭為主性腺癌1例。高分化腺癌6例，中分化10例，低分化4例。免疫組化標記CK7全部（+），TTF-1（+）17 例，ALK（+）3 例，EGFR（+）5 例，p63 和CK5/6全部（-）。有長期吸煙史8例。

1.2 試劑：EML4-ALK融合基因檢測探針試劑盒及輔助試劑均為廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司產(chǎn)品；免疫組化試劑為福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法：標本經(jīng)中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，厚4 μm。向coplin缸中加入50 mL的預處理液，加熱至80℃。用緩沖液稀釋蛋白酶IV，加入coplin缸中，37℃水浴。切片70℃烘烤1 h以上，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ脫水各5 min，室溫風干。放入預熱的預處理液中10 min，再浸于蒸餾水中5 min。放入預熱的蛋白酶溶液中20 min，再浸入蒸餾水中5 min，風干。把切片放入變性液中，設定變性溫度為73℃，時間5 min。將切片浸于70%、85%、無水乙醇中各1 min，風干。每張切片加10 μL探針液，蓋上蓋玻片進行雜交。雜交溫度設定37℃，時間24 h，注意保濕。將切片浸入洗脫緩沖液I中5 min，直至蓋玻片自動浮離，浸入預熱至75℃的洗脫緩沖液Ⅱ中5 min。室溫避光風干切片，加10 μLDAPI，蓋上蓋玻片，避光放置 1 min，熒光顯微鏡觀察。

1.4 判讀方法：油鏡下觀察至少50個腫瘤細胞。陽性細胞：紅色和綠色信號分開大于等于2個信號寬度或單獨的紅色信號。陰性細胞：紅色和綠色信號融合或分開小于2個信號寬度或只有單獨的綠色信號。計數(shù)50個腫瘤細胞，＜10%為陰性，＞50%為陽性。10%～50%之間則另計數(shù)50個腫瘤細胞，2次結果相加計算百分比，＜15%為陰性，≥15%為陽性。

2 結果

20例肺腺癌穿刺標本中，19例成功通過FISH檢測（3例為二次檢測成功），檢出成功率為95.00%，1例信號弱不能判讀，詳見圖1。其中EML4-ALK陽性2例，陽性率為10.00%，其余為陰性，詳見圖2。2例陽性患者為男性，平均年齡53歲，均為中-低分化實性為主性腺癌，免疫組化 ALK（+），EGFR（-），有吸煙史。

圖1 肺腺癌標本檢測圖

圖2 肺腺癌EML4-ALK檢測圖（FISH×1000）

3 討論

EML4為棘皮類動物微管相關蛋白樣蛋白家族成員，其結構由N端Basic區(qū)、疏水的棘皮動物微管相關蛋白區(qū)（HELP）以及WD重復區(qū)三部分構成。EML4基因在維持細胞的基本形態(tài)方面發(fā)揮著主要作用，三部分中Basic區(qū)的作用可能最為重要[2]。ALK是一種受體酪氨酸激酶，與白細胞酪氨酸激酶（LTK）屬于同一亞家族，均為胰島素受體（IR）超家族成員，由1620個氨基酸組成該蛋白的膜外部分、跨膜區(qū)域以及膜內(nèi)催化區(qū)域構成。ALK的正常生理功能尚未完全闡明，可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能有關[3]。EML4和ALK基因均定位于2號染色體短臂上的p21帶和p23帶，分布方向相反，發(fā)生融合時，其中一個需從染色體上斷裂，調(diào)轉(zhuǎn)方向與另一個發(fā)生融合。由于EML4具有多變的斷裂位點，所以與ALK發(fā)生融合可以形成多種不同的亞型，部分亞型與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[4]。最初人們將EML4-ALK融合基因看作是肺癌所特有，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，在部分乳腺癌、結直腸癌以及非霍奇金淋巴瘤中也有表達，但在肺腺癌中表達最高，可達15%左右[5]。EML4-ALK融合基因的變異導致癌細胞的酪氨酸激酶異常高表達，表明它是一個新的基因靶點，針對此靶點的酪氨酸激酶抑制劑如克唑替尼（Crizotinib）在臨床治療中已取得良好療效，所以對肺腺癌患者進行EML4-ALK融合基因檢測是很有必要的。EML4-ALK融合基因檢測的方法有多種，F(xiàn)ISH法是其中一種，為美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的標準方法，該檢測法對確診ALK陽性肺癌具有重要意義，缺點是不能識別融合位點，不能鑒別不同的融合變異亞型。

目前多采用手術標本對EML4-ALK進行研究，單獨針對小標本的臨床研究較少。本組20例肺腺癌小標本中，均經(jīng)過篩選全部滿足FISH方法檢測條件，即100.00%的標本可用于檢測。其中1例因FISH信號弱而未能獲得FISH結果，F(xiàn)ISH檢測成功率為95.00%。陽性率為10.00%，與報道的手術標本的陽性率相似，雖然只有2例陽性，但患者的主要臨床病理特征如年齡、病理類型和吸煙史等與有關研究符合，說明肺腺癌穿刺活檢標本可用于檢測EML4-ALK融合基因，尤其對中晚期腺癌更適用，因為大部分中晚期肺腺癌患者己失手術治療機會，無法取得手術標本。但對小標本先要進行篩選，HE切片上癌細胞數(shù)量＞50個才宜于FISH檢測。經(jīng)皮肺穿刺的肺癌活檢標本本身組織量少，經(jīng)過HE切片、免疫組化以及EGFR基因檢測后，量越來越少，因此一定要仔細認真合理使用標本不浪費，以保證EML4-ALK檢測的正常進行，腫瘤細胞越多，檢出率越高。對于肺穿刺小標本用于檢測EML4-ALK融合基因，現(xiàn)無統(tǒng)一的診斷流程。由于該基因一般不與EGFR、Kras基因突變共存，從檢測效能和成本的角度出發(fā)，理想的流程為對EGFR、Kras陰性的肺腺癌患者首先采用免疫組化（IHC）ALK（D5F3）抗體檢查，ALK的IHC中0分和3+者可暫不作FISH檢測，1+和2+者作FISH檢測更合適，必要時也結合臨床和病理特征作選擇。

肺穿刺小標本EML4-ALK融合基因的檢測成功率與嚴密的操作步驟密切相關，本實驗中有3例是二次檢測成功的也證明了這一點。由于目前檢測成本較高，所以每一步都要一絲不茍去做，爭取一次性成功檢測。

［1］ 梁小龍，王孟昭，張靜，等.檢測肺腺癌活檢標本間變性淋巴瘤激酶蛋白表達和基因融合［J］.中華腫瘤雜志，2014，36（7）：501-504.

［2］ 張邢松，魏萬里.肺癌組織中EML4-ALK基因表達的研究進展［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2014，22（5）：1226-1230.

［3］ 郭易楠，岳文濤.EML4-ALK融合基因在腫瘤中的研究進展［J］.國際腫瘤學雜志，2014，41（7）：484-487.

［4］ Sasaki T，Rodig SJ，Chirieac LR，et al.The biology and treatment of EML4-ALK non-small cell lung cancer［J］.Eur J Cancer，2010，46（10）：1773-1780.

［5］ 王夢，楊繼元，李軍川，等.EML4-ALK在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義［J］.臨床腫瘤學雜志，2013，18（8）：688-690.

［6］ Gridelli C，Peters S，Sgambato A，et al.ALK inhibitors in the treatment of advanced NSCLC［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（2）：300-306.

Detection of EML4-ALK Fusion Gene in Lung Adenocarcinoma Specimens By FISH

Cheng Kelun1Zhou Yongsong1Chen Xiuchan1Xiong Yungang1Zou Yangqiang1Jiang Sen1Deng Liudan2
（1.Department of Pathology，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi 563000，China；2.Department of Polytron Technologies Inc，Guangzhou LBP Medical Technology，Guangzhou 510663，China）

ObjectiveTo test the feasibility of detecting echinoderm microtubule related protein 4 （EML4）and anaplastic lymphoma kinase（ALK）fusion gene（EML4-ALK）in lung adenocarcinoma biopsy samples.Methods Fluorescence in situ hybridization（FISH）was performed for 20 lung adenocarcinoma biopsy samples to detect EML4-ALK fusion gene.Results FISH assay was successful for 19 of the 20 samples，with a success rate of 95%.2 of the 20 cases（10%）was positive for EML4-ALK fusion gene.Conclusion Lung adenocarcinoma biopsy specimens can be used for detection of EML4-ALK fusion gene，which provides references for targeted therapy of this disease.

Fluorescence in situ hybridization；Lung adenocarcinoma；EML4-ALK fusion gene；Percutaneous aspiration lung

R734.2

A 學科分類代碼： 32067

1001-8131（2017）04-0314-03

2017-02-04

中國航天科工集團公司醫(yī)療衛(wèi)生科研項目（2014-LCLX-009）