楊勵 牛妍艷 劉楊 孫曉燕 馬小萍 張美芳（通訊作者）（.陜西省人民醫(yī)院皮膚科，陜西西安70068；.宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇宿遷800；.陜西省人民醫(yī)院中心實驗室，陜西西安70068）

·論 著·

2型單純皰疹病毒感染后HaCaT細胞分泌細胞因子的變化研究

楊勵1牛妍艷2劉楊3孫曉燕1馬小萍1張美芳1（通訊作者）
（1.陜西省人民醫(yī)院皮膚科，陜西西安710068；2.宿遷市第一人民醫(yī)院，江蘇宿遷223800；3.陜西省人民醫(yī)院中心實驗室，陜西西安710068）

目的 探討2型單純皰疹病毒（HSV-2）感染后人角質形成細胞分泌細胞因子的狀況。方法 采用非洲綠猴腎細胞株VERO細胞進行HSV-2病毒擴增，再以HSV-2感染HaCaT細胞，采用ELISA和熒光實時定量PCR檢測感染后24h、48h和72h時IL-10、IFN-γ、TGF-β的分泌和表達情況。結果 經HSV-2感染后HaCaT細胞分泌和表達的IL-10、IFN-γ、TGF-β與對照組相比有統計學差異，并呈時間相關性。結論 在HSV-2感染早期KC參與了免疫反應，其分泌和表達的細胞因子的偏移可能參與了HSV-2的病理機制。

生殖器皰疹；2型單純皰疹病毒；角質形成細胞；HaCaT；細胞因子

生殖器皰疹（Genital herpes，GH）是一種由單純皰疹病毒 2型（Herpes simplex virustype 2，HSV-2）引起的感染性疾病，主要通過性接觸傳染，該病發(fā)病率逐年增加[1]。HSV-2增加了人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV） 黏膜傳播的風險，加速了疾病的進展[2]，且復發(fā)難治性GH患者數量增多，引起對該病的研究關注。

HSV-2具有強的免疫原性，可以通過細微的裂隙感染角質形成細胞（Keratinocyte cell，KC）致表皮的KC發(fā)生水腫、變性和壞死，且真皮內不同程度的炎癥細胞浸潤，說明病毒可誘導機體在皮膚局部發(fā)生免疫反應。同時，感染后的角質形成細胞能夠分泌和表達多種細胞因子，利用其物理屏障作用成為抵抗HSV感染的機械性防線[3]。因此，了解HSV-2感染角質形成細胞后早期局部免疫應答的變化，在疾病的防治中能有針對性的進行干預，促進機體局部免疫功能而抑制或清除病毒。

本研究以人永生化角質形成細胞株（Human eternal cell line，HaCaT）作為實驗模型，在體外觀察HSV-2感染HaCaT的早期過程，檢測感染后白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）、轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）的表達。

1 材料與方法

1.1 一般材料：人永生化表皮細胞株HaCaT細胞由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院皮膚病研究所饋贈，非洲綠猴腎細胞株VERO細胞由陜西省人民醫(yī)院中心實驗室提供，HSV-2標準株購自中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：HaCaT細胞與VERO細胞均用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)（含10%胎牛血清，100 μ/mL青霉素和50 μ/mL鏈霉素）。維持37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞密度達到70%時進行消化傳代。

1.2.2 HSV-2病毒擴增：將VERO細胞培養(yǎng)至約90%密度，換用無血清的DMEM培養(yǎng)基，將病毒液和細胞培養(yǎng)基以1：100體積比在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24～48 h，觀察細胞形態(tài)，當達到70%細胞發(fā)生破碎后，收集全部細胞和培養(yǎng)基，凍存于-80℃。將凍存病毒液于室溫融化，再次復凍于-80℃，反復3次，使全部VERO細胞破裂，釋放病毒。將病毒液于室溫12000 r/min，離心15 min，保存上清液，用以病毒感染性測定。

1.2.3 病毒感染性的測定：將vero細胞懸液稀釋成1×105個/mL，每孔0.1 mL接種96孔細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。當細胞單層鋪滿后，將HSV病毒液按10倍遞次稀釋成10-1～10-8不同的濃度梯度，每個稀釋濃度設4個復孔，并設正常細胞對照組（不加病毒液）。37℃吸附1.5 h后棄上清、換液，每孔維持0.1 mL體積，置37℃、5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。每日觀察并記錄細胞病變程度（CPE），最終計算病毒的半數感染量（TCID50）。

1.2.4 HSV-2病毒感染HaCaT細胞：設立感染組，病毒液+HaCaT細胞；空白對照組，病毒滅活液（將病毒液于56℃水浴孵育2 h滅活）+HaCaT細胞；正常對照組，HaCaT細胞。將3×106個HaCaT細胞接種于培養(yǎng)皿，細胞單層鋪滿后加入病毒液，設定合適的終濃度，分別培養(yǎng)24、48和72 h。病毒感染后3 h需更換培養(yǎng)基。每次每組同時設定三個培養(yǎng)皿，共進行9次重復但完全獨立的實驗。在不同時間點收集感染后的HaCaT細胞，-80℃保存，待檢測細胞因子 IFN-γ、IL-10、TGF-β，并每個時間點的3個培養(yǎng)皿的全部細胞，獨立收集進行下一步RNA提取和反轉錄實驗。

1.2.5 熒光實時定量PCR：PCR反應體系中加入SYBR Green染料、正反向引物及cDNA，按照說明書進行熒光實時定量PCR反應，分別檢測IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 的表達量

1.2.6 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-10、TGF-β水平：按照ELISA說明書分別檢測培養(yǎng)上清中的 IFN-γ、IL-10、TGF-β 水平。

1.3 統計學處理：采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，計量資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HaCaT細胞與VERO細胞的形態(tài)學變化：VERO細胞作為病毒擴增細胞，在感染HSV-2后細胞變大、變圓，逐步變性壞死，HSV-2感染VERO細胞最佳效果時間在72 h內。使用10-2PFU濃度的HSV-2感染后，HaCaT細胞出現融合，但死亡細胞較少，詳見圖1、圖2。

2.2 病毒毒力測定結果：觀察CPE，按Reed-Muench兩氏法測得病毒的TCDI50為5.8。

圖1 HSV-2感染前、后VERO細胞形態(tài)

圖2 HSV-2感染前、后HaCaT細胞形態(tài)

2.3 HSV-2感染HaCaT細胞檢測：依文氏蘭襯染為紅色背景，綠色為病毒抗原著色，詳見圖3。

圖3 病毒感染細胞后24h的免疫熒光照片

2.4 經HSV-2病毒感染HaCaT細胞后培養(yǎng)液上清的 IFN-γ、IL-10、TGF-β 的水平：在 24 h、24～48 h、48～72 h，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

2.5 經HSV-2病毒感染后HaCaT細胞分泌的IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 的表達量：詳見表 2。

3 討論

KC是HSV-2入侵的第一防線[4]，被感染后，KC壞死的同時也能分泌或誘導大量細胞因子的產生[5]，細胞因子參與了免疫反應和炎癥反應，在免疫應答中起著重要作用，因此檢測HSV-2感染早期KC的細胞因子在免疫變化中作用是非常重要的。

表 1 IFN-γ、IL-10、TGF-β 的水平的比較

表 1 IFN-γ、IL-10、TGF-β 的水平的比較

時間 IFN-γ IL-10 TGF-β感染組 對照組 t值 P值 感染組 對照組 t值 P值 感染組 對照組 t值 P值24h 0.24±0.11 0.28±0.11 2.92 0.067 0.25±0.04 0.26±0.13 2.35 0.10 0.26±0.03 0.21±0.17 4.29 0.025 48h 0.31±0.17 0.26±0.14 4.12 0.034 0.21±0.13 0.27±0.15 4.75 0.017 0.31±0.19 0.23±0.13 7.45 0.005 72h 0.39±0.26 0.23±0.13 5.83 0.014 0.19±0.09 0.30±0.12 7.18 0.006 0.22±0.20 0.25±0.11 2.34 0.100

表 2 IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA 的表達量的比較 x±s

我們的研究選用不引起Hacat細胞損傷的HSV-2最大感染濃度，證實了HSV-2感染Hacat細胞后能產生不同的細胞因子。HSV-2具有嗜表皮性，感染后可引起KC的水腫、變性和壞死，而TGF-β是調節(jié)細胞的生長和分化的細胞因子[6]。實驗結果發(fā)現TGF-β的表達均高于對照組，其動態(tài)變化可能影響了KC的增殖。結果提示，在HSV-2感染造成的皮膚損傷中，動態(tài)監(jiān)測TGF-β變化可作為判斷組織損傷的依據。

實驗觀察到Hacat細胞被HSV-2感染破壞后48h內，Th1型細胞因子IFN-γ低于對照組水平，48h后升高。IFN-γ作為重要的免疫效應分子，直接反應了機體細胞免疫的水平[7]。發(fā)生變化可能有多種原因導致，比如HSV-2感染前48h，HSV-2有較強的侵襲性和破壞力，對Hacat細胞產生了破壞作用，致使Th1型細胞因子表達減少，細胞免疫功能部分受到非特異性抑制，難以控制病毒復制及擴散[8]；或是由于抗原特異性的Th1/Th2細胞因子發(fā)生偏移所致。因此我們進一步檢測了Th2細胞功能相關的IL-10，結果發(fā)現Th2型細胞因子IL-10呈相對緩慢下降趨勢，我們同時發(fā)現感染后TGF-β的表達水平在48h內較高，48h后緩慢下降，既往研究認為TGF-β是抑制性細胞因子，影響Th1/Th2型細胞因子間的相互作用[9]，在維持皮膚免疫平衡中起重要的作用。本研究結果認為在HSV感染早期，TGF-β的升高可能直接導致KC的免疫功能受到抑制，使IFN-γ的分泌水平降低，IL-10的改變也降低了其的分泌表達，但隨著疾病發(fā)展，逐步升高的IFN-γ限制了TGF-β負反饋，從而誘導向Th1型免疫方向發(fā)展。

本研究結果提示HSV-2感染的早期Th1型免疫反應相對較弱，在48h前KC分泌的細胞因子以促進局部Th2型免疫反應為主；而48h后KC向Th1型細胞免疫分化，KC對HSV-2感染的識別和抵抗誘導了Th免疫平衡的變化[10]。根據此結論，提示在感染早期可以考慮糾正這種平衡偏移的情況，誘導和增強皮膚對HSV-2的局部免疫防御可能對治療有重要意義，特別是抑制或清除病毒并提高KC的免疫防御能力可能是防止HSV-2擴散的新途徑。

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The Secretion and Expression of Cytokine in Keratinocyte with Herpes Simplex Virus Type 2 Infections

Yang Li1Niu Yanyan2Liu Yang3Sun Xiaoyan1Ma Xiaoping1Zhang Meifang1
（1.Department of Dermatology，Shaanxi Provincial People′s Hospital，Xi′an 710068，China；2.Department of Dermatology，Suqian First Hospital，Suqian 223800，China；3.Department of Center laboratory，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi′an 710068，China；）

ObjectiveTo probe the state of cytokine level in the HSV-2-infected human keratinocyte（KC）.Methods VERO cells were used for the propagation and titration of the HSV-2，and HaCaT cells were infected with HSV-2，then were harvested 24h，48h and 72h.Expression levels of IL-10，IFN-γand TGF-βwere detected by ELISA and Real-time PCR.Results We infected HaCaT cells with HSV-2，levels of IL-10，IFN-γand TGF-βchanged significantly in a time-dependent manner（P＜0.05）.Conclusion Keratinocytes participate in the immune response on the early stage of HSV-2 infection，the shift of antiviral cytokine may involved in this process.

Genital herpes；HSV-2；Keratinocyte；HaCaT；Cytokine

R752

A 學科分類代碼： 32047

1001-8131（2017）04-0301-03

2016-11-03

陜西省科學技術研究發(fā)展計劃項目（2009k18-01）