徐怡+秦波+曹紅云+張曉南+劉慧+游燕

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定黃草烏中滇烏堿和草烏甲素含量的高效液相色譜方法。方法采用Waters XTerra MS C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相為0.025mol/L磷酸二氫鉀溶液（1000ml加1ml磷酸）-乙腈：四氫呋喃（25：15）為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1 ml/min，柱溫 30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。結(jié)果滇烏堿和草烏甲素分別在5.27～421.6μg/ml、5.02～401.6μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.7%～104.3%、96.8%～99.3%，RSD分別為1.34%、0.82%。結(jié)論經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本法可用于同時(shí)測(cè)定黃草烏中滇烏堿、草烏甲素的含量，為該藥材的質(zhì)量控制和臨床用藥安全提供了有力的分析手段。

關(guān)鍵詞：黃草烏；滇烏堿；草烏甲素；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：R927.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）09-0070-03

黃草烏Aconitum vilmorr-ianum Kom.毛茛科植物的塊根。主要含有滇烏堿、草烏甲素，二者均具有鎮(zhèn)痛抗炎藥理活性，滇烏堿的毒性最強(qiáng)，草烏甲素次之。因此本試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃草烏中的2種主要二萜類生物堿的含量，為黃草烏藥材的質(zhì)量控制和臨床用藥安全提供參考，也為進(jìn)一步合理開發(fā)草烏甲素原料植物資源提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器及試劑美國(guó)Agilent1100高效液相色譜儀（四元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、智能化柱溫箱及Agilent化學(xué)工作站）；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TC-6 KA型電子天平；DFY-500型粉碎機(jī)；SK-3200LH型超聲清洗儀（功率250W，頻率59KH）；乙腈（色譜純，默克公司）、四氫呋喃（色譜純，默克公司）；其余為分析純；水為自制超純水。

1.2試藥黃草烏藥材購(gòu)自昆明菊花園中藥材市場(chǎng)，其產(chǎn)地為昭通，經(jīng)云南省藥物所究所天然藥物資源研究中心正高級(jí)工程師高麗鑒定經(jīng)鑒定系毛茛科植物黃草烏Aconitum vilmorrianum Kom.的干燥塊根。草烏甲素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品生物檢定所，純度≥98%），滇烏堿為本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)純度測(cè)定，其純度為98.1%。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱Waters XTerra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.025 mol/L磷酸二氫鉀溶液（每1000 mL加磷酸1ml）為流動(dòng)相A，乙腈：四氫呋喃（25：15）為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；進(jìn)樣量10 μL。見表1。

2.2對(duì)照品溶液制備取滇烏堿對(duì)照品和草烏甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含100μg的混合溶液，即得。見圖1。

2.3供試品溶液制備精密稱取黃草烏藥材（過(guò)三號(hào)篩）約5 g，置具塞錐形瓶中，加5%鹽酸5 mL，精密加入甲醇-異丙醇（1：1）50 mL，稱定重量，密塞，超聲處理（功率250W，頻率59KH）30 min，放冷，再稱量，用甲醇-異丙醇（1：1）補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過(guò)，濾液用氨水調(diào)節(jié)至中性。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜? mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4線性關(guān)系考察精密量取混合對(duì)照品貯備液（滇烏堿：421.6 μg/mL、草烏甲素：401.6 μg/mL），分別用甲醇稀釋成滇烏堿：421.6、210.8、105.4、84.32、42.16、21.08、10.54、5.27 μg/mL，草烏甲素：401.6、200.8、100.4、80.32、40.16、20.08、10.04、5.02 ug/mL的對(duì)照品溶液，照確定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以含量及相應(yīng)峰面積得線性方程和相關(guān)系數(shù)。見表2，圖2～3。

線性方程：Y=1603.5X+0.5324，r=0.9999，滇烏堿在5.27～421.6 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

線性方程：Y=1608.7X+7.7093，r=0.9999，草烏甲素在5.02～401.6 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度考察取同一混合對(duì)照品溶液（滇烏堿105.45 μg/mL、草烏甲素100.35 μg/mL），按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD分別為1.32%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已制備好的供試品溶液按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、6、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣體積10μl，以峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD=1.2%（n=5），所得的樣品中滇烏堿、草烏甲素含量基本一致，說(shuō)明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取黃草烏藥材6份，按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，測(cè)定滇烏堿和草烏甲素含量，測(cè)得滇烏堿和草烏甲素平均含量分別為187.13 μg/g，58.76 μg/g，RSD分別為0.98%、1.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)取已知含量的黃草烏藥材（滇烏堿：187.13 μg/g和草烏甲素：58.76 μg/g）9份，每份2.5 g，精密稱定，以1：0.5，1：1，1：1.5分別精密加入對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法制備，測(cè)定滇烏堿和草烏甲素含量，計(jì)算回收率，回收率分別為99.7%～104.3%、96.8%～99.3%；RSD分別為1.34%、0.82%。表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.9耐用性試驗(yàn)

2.9.1不同色譜柱考察選用不同品牌的3根色譜柱：Waters XTerra MS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），WatersSymmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Shiseido MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）（日本 資生堂），對(duì)供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果3根色譜柱保留時(shí)間與峰形略有差異，但滇烏堿和草烏甲素的峰都能完全分離，分離度均達(dá)到1.5以上，且所測(cè)得的滇烏堿和草烏甲素含量只是略有差異。表明色譜柱型號(hào)對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響不大。endprint

2.9.2柱溫變化考察改變柱溫，其他條件不變，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定供試品溶液，記錄色譜圖，結(jié)果表明柱溫在20℃～40℃變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果影響不大。

2.9.3不同色譜儀考察選用不同品牌的3臺(tái)高效液相色譜儀：Agilent 1100，Waters 2695，Shimadzu LC 2010，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果表明在儀器的品牌、型號(hào)有變動(dòng)時(shí)，對(duì)照品的峰能夠完全分離，且進(jìn)樣濃度有小的波動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果影響不大，在儀器穩(wěn)定的情況下，仍可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量測(cè)定。

2.10樣品測(cè)定取不同批次的樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分的含量。見表4。

3討論

試驗(yàn)中的黃草烏中均含有滇烏堿。部分不含草烏甲素，可能與藥材的產(chǎn)地和生長(zhǎng)年限相關(guān)。二者均為二萜類生物堿，由于這類成分本身具有較強(qiáng)的藥理活性和毒性，因此，對(duì)其精確地控制尤為重要。本研究不僅為黃草烏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)，也為精確控制云南產(chǎn)草烏類藥材的安全性和有效性提供依據(jù)。

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