張珊珊 楊文忠

(云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學(xué)院)，昆明，650201)

張玉萍 高雪松 康洪梅

(昆明市瀕危動植物收容拯救中心) (云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學(xué)院))

基于SSR分析的富民枳樣本量對其遺傳多樣性指標(biāo)的影響1)

張珊珊 楊文忠

(云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學(xué)院)，昆明，650201)

張玉萍 高雪松 康洪梅

(昆明市瀕危動植物收容拯救中心) (云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學(xué)院))

為了對極小種群野生植物富民枳(Ponciruspolyandra)采取合理有效的保護措施，采用SSR分子標(biāo)記作為遺傳完整性檢測標(biāo)記，研究不同梯度的有效樣本量對微衛(wèi)星分析中遺傳多樣性指標(biāo)的影響。本研究利用5對SSR引物，對65份富民枳種質(zhì)材料進行遺傳完整性檢測，并對富民枳種植資源遺傳多樣性的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果表明：隨著有效樣本量的增加，有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)性信息量和Shannon信息指數(shù)等遺傳指標(biāo)均隨之增加，有效樣本量與遺傳多樣性指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。當(dāng)以有效等位基因數(shù)、多態(tài)性信息量(PI,C)和Shannon多樣性指數(shù)等來衡量時，有效樣本量29株為曲線的拐點，此時代表了95%以上的遺傳多樣性水平；而以觀測雜合度和期望雜合度來衡量時，有效樣本量為25株時，便達到了該總體遺傳多樣性水平的95%以上。綜合分析表明，富民枳的有效樣本量以25～29株較為合適，目前富民枳的種質(zhì)保存是合理有效的。

極小種群野生植物；富民枳(Ponciruspolyandra)；遺傳完整性；有效樣本量；遺傳多樣性指標(biāo)

遺傳完整性指在繁殖、保存過程中要使其群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到完全的保持，包括基因型頻率分布及等位基因頻率和原始群體一樣保持不變[1]。物種保護的關(guān)鍵和核心問題是維持物種的遺傳完整性、保持種群生存力及開展種群遺傳管理等[2-4]。影響遺傳完整性的因素有很多，其中樣本量大小的選擇尤為重要[5]。在群體遺傳學(xué)研究中，合理的取樣策略是研究的基礎(chǔ)，關(guān)系到種質(zhì)資源采集和生物多樣性保護是否合理有效，既不浪費人力物力，又保證采集的樣本能包含盡量多的遺傳變異[6-7]。

分子標(biāo)記分析遺傳參數(shù)變化法是用來確定樣本量的常用方法[5]。遺傳多樣性水平高低是評價各種保育措施是否有效的重要指標(biāo)[8]，也為進一步探討極小種群野生植物保護瀕危機制[9-10]，制定有效的取樣策略和相應(yīng)的保護措施提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)[11-12]。Shannon信息指數(shù)(I)和多態(tài)性信息量(PI,C)是度量遺傳多樣性的常用指標(biāo)[13-14]。趙茹等[15]用分子標(biāo)記對野生大豆居群遺傳多樣性估算與取樣策略的研究結(jié)果表明，當(dāng)樣本量為30～45株時，可以代表總體90%以上的遺傳多樣性。這與學(xué)者提出的“對于瀕危物種，保持其90%以上的遺傳多樣性才能稱之為“成功保護”[16-17]是一致的。

富民枳(Ponciruspolyandra)是蕓香科枳屬常綠植物，屬典型的極小種群野生植物，云南特有種，調(diào)查發(fā)現(xiàn)已野外滅絕[18]。目前，富民枳僅以實生苗或分蘗苗保存在于種質(zhì)資源收集圃，并在原分布地恢復(fù)建立了1個富民枳人工種群。但是目前富民枳的遺傳完整性如何、種質(zhì)保存及保護措施是否有效，都尚不清楚。

選取有效檢測手段對于開展影響遺傳完整性變化因素研究是很重要的工作。許多分子標(biāo)記包括簡單串聯(lián)重復(fù)序列SSR(簡單重復(fù)序列，simple sequence repeats)、SRAP(序列相關(guān)擴增多態(tài)性，sequence-related amplified polymorphism)和RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA，random amplified polymorphic DNA)被用來研究富民枳與其近緣屬植物間的親緣關(guān)系[19-21]，但是事實證明,SSR比其他分子標(biāo)記更具有更高的多態(tài)性，是研究遺傳完整性的理想標(biāo)記。因此，本研究采用SSR分子標(biāo)記對現(xiàn)存的65份富民枳有效樣本進行遺傳多樣性分析，并通過分析有效樣本量對有效等位基因數(shù)、期望雜合度、多態(tài)性信息量和Shannon信息指數(shù)等重要群體遺傳多樣性指標(biāo)的影響，以期為該物種種質(zhì)保存、合理利用、有效保護以及生物多樣性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

基于前期研究基礎(chǔ)，從昆明和富民現(xiàn)存的富民枳種質(zhì)資源收集地共采集65份有效葉片樣品，樣品及其繁殖來源(實生苗或分蘗苗)都不清楚。在詳細(xì)記錄植株編號的同時，于2016年春季采集健康幼嫩的葉片，用硅膠快速干燥并拍照，帶回實驗室，用75%的無水乙醇擦拭清洗，最后用液氮冷凍貯存以備提取DNA。

DNA提?。翰捎酶牧糃TAB法從葉片中提取富民枳全基因組DNA。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，紫外分光光度法檢測DNA濃度，合格樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。吸? mL DNA和6 mL 1×上樣緩沖液進行瓊脂糖凝膠電泳，300 V電壓下電泳12 min。

引物篩選：根據(jù)文獻分析得到的STR位點引物信息，篩選出適合擴增的位點不重復(fù)的51對引物[22-23]，然后用合成的51對引物作為初篩引物，進行PCR擴增，最后對數(shù)據(jù)進行Gene mapper軟件分析。根據(jù)分析結(jié)果，共篩選出5對具片段多態(tài)性的引物(表1)。

表1 引物信息及序列

在不同來源地選取一定比例的樣本，用選取的不同引物進行擴增。采用15 mL體系，即2×TaqMaster Mix 7.5 mL，正向引物1 mL(10 mmol·L-1),反向引物1 mL(10 mmol·L-1),模板DNA 1 mL，滅菌ddH2O 4.5 mL。引物信息見表1，F(xiàn)為上游引物，R為下游引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)程序，即94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將擴增好的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(2 μL樣品+6 μL溴酚藍)，300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖。根據(jù)膠圖確定是否擴增出目的DNA片段，選取了5對擴增條帶較好的引物準(zhǔn)備二次擴增。

用帶熒光染料的接頭引物和正向引物對一次擴增的產(chǎn)物進行二次擴增，擴增體系及條件與一次相同。將上步獲得的PCR產(chǎn)物進行電泳鑒定，獲取鑒定膠圖。

通過膠圖確定模板濃度，加水稀釋到電泳所需濃度。上機進行毛細(xì)管電泳，即按V(高度去離子甲酰胺)∶V(500 bp的內(nèi)標(biāo))=130∶1配成混合液；用國產(chǎn)96孔反應(yīng)板分裝混合液，每個孔中加入10 μL；對應(yīng)著在96孔板中加入0.5 μL樣品模板，離心到4 000 r·min-1即停；用金屬浴加熱器將混合板95 ℃加熱預(yù)變性5 min，拿出后立即放入-20 ℃；冷卻后拿出，4 000 r·min-1離心，解凍，混勻；上3730測序儀進行毛線管電泳；獲取下機結(jié)果并分析，篩選出多態(tài)性較好的位點。

用軟件Gene mapper 4.1進行數(shù)據(jù)準(zhǔn)確位點的分析，分析數(shù)據(jù)按照引物對應(yīng)關(guān)系的核心堿基重復(fù)數(shù)(例如，(AG)6)片段大小263 bp(應(yīng)加了M13F的18個堿基，所以大小實際為281 bp)來確定位點準(zhǔn)確大小。根據(jù)分析出來的位點信息來判斷檢測引物是否具有位點多態(tài)性，選取特異性高，多態(tài)性好的位點用于最終試驗測定。

數(shù)據(jù)分析：采用POPGENE Version 1.32對不同引物下的數(shù)據(jù)進行分析，計算有效等位基因數(shù)(Ne)、平均期望雜合度(He)、觀測雜合度(Ho)和Shannon信息指數(shù)(I)；先根據(jù)之前的分析結(jié)果計算出各個引物的等位位點數(shù)及頻率，然后利用PIC_Calc 0.6計算軟件計算各引物的多態(tài)性信息量(PI,C)。對65個富民枳有效樣本梯度取樣，分析不同樣本量組的Shannon信息指數(shù)，共取樣5次，計平均值作散點圖，為達到最好的回歸近似，利用Origin7.0軟件對有效等位基因數(shù)、期望雜合度、觀測雜合度、PI,C和Shannon信息指數(shù)隨有效樣本量增加的變化趨勢用S曲線進行擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效樣本量對有效等位基因數(shù)的影響

從已發(fā)表文獻中的51對柑橘屬引物篩選出5對多態(tài)性好的SSR引物(表1)。微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)一般較多，檢測的有效樣本量越大，檢測到的有效等位基因數(shù)也隨之增大。本研究中，不同有效樣本量之間的有效等位基因數(shù)變化趨勢如圖1所示。有效樣本量與所檢測出的5個微衛(wèi)星位點有效等位基因數(shù)都呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.886(表2)。其中，loci46位點檢測的有效等位基因數(shù)在不同有效樣本量條件下都最高，其次是loci3、loci17、loci27和loci44(圖1a)。利用不同有效樣本量下的5個位點的平均有效等位基因數(shù)擬合S型曲線(函數(shù)公式為y=1.925-6.14/(1+(exp(x+37.97)/12.87))(R2=0.961 9)(圖1b)，結(jié)果顯示，隨著有效樣本量的增加，有效等位基因數(shù)隨之顯著增加。當(dāng)有效樣本量等于29株時，Ne=1.89，占總等位基因數(shù)的98%，可以認(rèn)為已較好反映了該物種的遺傳多樣性；當(dāng)有效樣本量小于29株時，有效等位基因數(shù)增加幅度較大；當(dāng)有效樣本量大于29株時，有效等位基因數(shù)隨有效樣本量變化的幅度較小。

表2 樣本量與不同遺傳參數(shù)之間的相關(guān)性

注：** 表示在0.01水平上相關(guān)性極顯著(雙側(cè)檢驗)。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分別代表各微衛(wèi)星位點；虛線代表每個位點的擬合曲線；實線代表平均有效等位基因的擬合曲線。

2.2 有效樣本量對雜合度的影響

雜合度是指樣本中2個等位基因不相同的概率，期望雜合度主要是根據(jù)種群內(nèi)當(dāng)前優(yōu)勢等位基因的基于頻率來推算的。由圖2和圖3可知，觀測雜合度和期望雜合度隨有效樣本量的變化呈現(xiàn)出與有效等位基因數(shù)相同的趨勢。平均觀測雜合度和平均期望雜合度與有效樣本量之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.901和0.897，都呈顯著正相關(guān)(表2)。其中，loci27位點檢測的觀測雜合度在曲線趨于穩(wěn)定時數(shù)值最大，其次是loci3、loci17、loci44和loci46(圖2a)，擬合曲線公式為y=0.46-1.6/(1+(exp(x+22.77)/11.18))(R2=0.955 3)(圖2b)；而對于期望雜合度，擬合曲線公式為y=0.49-1.52/(1+(exp(x+25.58)/10.58))(R2=0.923 9)(圖3b)，loci46位點下在曲線趨于穩(wěn)定時數(shù)值最大，其次是loci3、loci17、loci27和loci44(圖3a)。當(dāng)有效樣本量超過25株后，兩者數(shù)值都趨于穩(wěn)定，波動較小。當(dāng)有效樣本量等于25株時，Ho=0.44，He=0.48。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分別代表各微衛(wèi)星位點；虛線代表每個位點的擬合曲線；實線代表平均觀測雜合度的擬合曲線。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分別代表各微衛(wèi)星位點；虛線代表每個位點的擬合曲線；實線代表平均期望雜合度的擬合曲線。

2.3 有效樣本量對多態(tài)性信息量的影響

對不同梯度有效樣本量和5個不同微衛(wèi)星位點下的多態(tài)性信息量進行統(tǒng)計分析表明，隨著有效樣本量的增加，PI,C逐步趨于穩(wěn)定(圖4)。loci27位點的多態(tài)性最低，loci46位點的多態(tài)性最高。從表2中可以很清楚地看出，平均PI,C與有效樣本量成顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.893。擬合曲線公式為y=0.38-1.52/(1+(exp(x+43.71)/15.36))(R2=0.965 6)(圖4b)。與平均有效等位基因數(shù)的變化趨勢一樣，當(dāng)有效樣本量為29株時，PI,C的擬合曲線出現(xiàn)拐點，此時PI,C數(shù)值為0.37。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分別代表各微衛(wèi)星位點；虛線代表每個位點的擬合曲線；實線代表多態(tài)性信息量平均值的擬合曲線。

2.4 有效樣本量對遺傳多樣性指數(shù)的影響

與多態(tài)性信息量對有效樣本量的響應(yīng)趨勢相同，遺傳多樣性指數(shù)也隨著有效樣本量的增加而升高，相關(guān)系數(shù)為0.873(表2)。loci27位點的Shannon信息指數(shù)最低，loci46位點的Shannon信息指數(shù)最高。當(dāng)有效樣本量為3～28株時，遺傳多樣性迅速增加；當(dāng)有效樣本量達到29株后，Shannon信息指數(shù)(I=0.691 0±0.002 0)趨于穩(wěn)定，不會隨著有效樣本量的增加而顯著增加。說明當(dāng)富民枳有效樣本量達到29株時，已經(jīng)能夠代表該物種的遺傳多樣性水平。根據(jù)此函數(shù)(y=0.691 67-0.062 27/(1+exp(x-16.957 44)/2.807 11)(R2=0.953 6))，當(dāng)樣本的Shannon信息指數(shù)達到該物種遺傳多樣性水平的90%(I=0.621 9)以上時，有效樣本量要大于10株(n=10.696 7)。

Loci3、loci17、loci27、loci44和loci46分別代表各微衛(wèi)星位點；虛線代表每個位點的擬合曲線；實線代表Shannon信息指數(shù)平均值的擬合曲線。

3 結(jié)論與討論

有效樣本量的大小會影響有效等位基因數(shù)、Shannon信息指數(shù)和期望雜合度等遺傳多樣性指標(biāo)[23-24]。已經(jīng)有研究表明，樣本大小與所觀測到的等位基因數(shù)和基因豐富度指數(shù)等遺傳多樣性指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，這些遺傳指標(biāo)均存在隨樣本量的增加而隨之變大的趨勢[6,25-26]。在本研究中，從65份有效樣本中抽取不同個體組成不同大小的樣本，共34組，每組5次重復(fù)，然后分別計算每一組遺傳多樣性指標(biāo)的平均值。結(jié)果顯示，隨著有效樣本量的增加，有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)性信息量和Shannon信息指數(shù)等遺傳指標(biāo)均隨之增加。

但是，應(yīng)用不同的遺傳指標(biāo)進行遺傳多樣性評估時所需有效樣本量不同[27]。有效樣本量的確定是群體遺傳多樣性研究的重點[5,28-29]，過多的樣本采集不僅會對有限的人力、財力和物力資源造成浪費，而且還會破壞研究對象[17]。在遺傳多樣性分析過程中，選擇有代表性的樣本量，使檢測到的遺傳多樣性具有較高的可信性[28]，尤其在對一些瀕危種群進行研究時，由于存在的個體很少，培育的苗木也很珍貴，取樣數(shù)量更是受到很大的制約，因此，在開展遺傳多樣性研究之前，確定有效樣本量十分重要。朱維岳等[30]研究大豆采樣策略時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以期望雜合度、Shannon多樣性指數(shù)等來衡量時，樣本量為27株便可達到該居群總體遺傳多樣性水平的95%。而以等位基因數(shù)來衡量時，需要樣本量達到52株。本研究中，由5種遺傳指標(biāo)與樣本量回歸擬合結(jié)果圖中的回歸擬合曲線可以看出，當(dāng)以有效等位基因數(shù)、多態(tài)性信息量(PI,C)和Shannon多樣性指數(shù)等來衡量時，有效樣本量29株為曲線的拐點，此時代表了95%以上的遺傳多樣性水平；而以觀測雜合度和期望雜合度來衡量時，有效樣本量為25株時，便達到了該總體遺傳多樣性水平的95%以上。這符合了Marshall et al.[31]提出的取樣策略。綜合理論推導(dǎo)和本研究的結(jié)果表明，不管是完善富民枳種質(zhì)保存地的資源配置，還是構(gòu)建人工重建的種群，有效樣本量以25～29株較為合適。因此，目前對富民枳開展的種質(zhì)保存工作基本維持了該物種的遺傳完整性，開展的保護工作是合理有效的。

富民枳幼苗培育、種質(zhì)資源保存和種群保護的指導(dǎo)建議：在現(xiàn)有種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上，采集包括足夠有效樣本量(25～29株)的繁殖材料，進行種子繁殖和扦插繁殖試驗，探索擴繁技術(shù)，擴大種苗供給能力；從65株有效樣本中選擇精選植株(或其復(fù)本)進行搭配，在保證有效樣本量的前提下，建立新的種質(zhì)資源保存地；在天然種群鄰近區(qū)域，利用之前利用有效樣本量(25～29株)的繁殖材料培育的幼苗，逐年回歸種植富民枳苗木，新建立天然種群2～3個。

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EffectsofPonciruspolyandraSampleSizeonGeneticDiversityIndexbySSRMarkers//

Zhang Shanshan, Yang Wenzhong
(Yunnan Provincial Key Laboratory for Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, P. R. China);
Zhang Yuping, Gao Xuesong
(Kunming Endangered Animal and Plant Asylum Save Center);
Kang Hongmei
(Yunnan Provincial Key Laboratory for Cultivation and Exploitation of Forest Plants, Yunnan Academy of Forestry)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(9)：35-39,44.

Plant with extremely small populations;Ponciruspolyandra; Genetic integrity; Effective sample size；Genetic diversity index

S722.8

1)國家自然科學(xué)基金項目(31460119和31660164)、科技基礎(chǔ)資源調(diào)查專項(2017FY100102)。

張珊珊，女，1984年10月生，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學(xué)院)，助理研究員。E-mail：zhang_ssl012@163.corn。

楊文忠，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室(云南省林業(yè)科學(xué)院)，研究員。E-mail：wzyang2004@126.com。

2017年4月7日。

責(zé)任編輯：任 俐。

In order to take reasonable and effective protection ofPonciruspolyandra, SSR markers was used as genetic integrity detection markers to study effective sample size of different gradient on genetic diversity index in microsatellite analysis. Five pairs of SSR primers were used to detect the genetic integrity of the 65 germplasm resources, and to analyze the genetic diversity of the germplasm resources. Results demonstrated that the effective sample size had significant positive correlation effects on genetic diversity index (effective number of alleles, observed heterozygosity, expected heterozygosity, polymorphic information content and Shannon’s information index) ofP.polyandraand the genetic diversity index increased with the increase of the effective sample size. When the effective number of alleles, polymorphic information content (PIC) and Shannon’s information index were measured, the effective sample size was 29, which represented more than 95% of the level of genetic diversity. When the effective sample size was 25, the total genetic diversity level was above 95%. The comprehensive analysis showed that the effective sample size of 25-29 was more suitable, and the germplasm conservation ofP.polyandrawas reasonable and effective.