巫建華，吳中俠，王媛花，馮英娜，*，顏志明，蔡善亞，王全智，孫 穎

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400； 2.江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212400； 3.睢寧縣高作鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇 徐州 221200)

水楊酸和脯氨酸對鹽脅迫下生菜相關(guān)基因表達的影響

巫建華1，2，吳中俠3，王媛花1，2，馮英娜1，2，*，顏志明1，2，蔡善亞1，王全智1，2，孫 穎1

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400； 2.江蘇現(xiàn)代園藝工程技術(shù)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212400； 3.睢寧縣高作鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，江蘇 徐州 221200)

為了探明水楊酸(SA)和脯氨酸(Pro)在緩解植物鹽脅迫中的作用，以生菜品種 ‘美國大葉速生’為材料，采用營養(yǎng)液水培方式，分別使用鹽脅迫水培液以及鹽脅迫水培液中分別添加SA和Pro 2種外源物質(zhì)處理生菜幼苗，并且測定相關(guān)形態(tài)指標、生理指標以及處理后與鹽脅迫逆境相關(guān)基因的表達量。研究表明，與對照相比，在鹽脅迫下加入0.2 mmol·L-1SA和0.2 mmol·L-1Pro處理24 h時，生菜的形態(tài)指標緩解效果明顯。半定量PCR與熒光定量PCR研究結(jié)果基本一致，同時相關(guān)抗逆基因LSNCED1、LSNCED2、LSP5CS的表達量在鹽脅迫下都有不同程度的上升。結(jié)果表明，添加0.2 mmol·L-1SA和0.2 mmol·L-1Pro處理24 h能夠緩解鹽脅迫對生菜造成的傷害。

鹽脅迫；生菜；生理性狀；鹽脅迫相關(guān)基因；基因表達

隨著設(shè)施蔬菜的發(fā)展，過量施用化肥常造成土壤鹽分的積累和次生鹽漬化的形成。生菜是設(shè)施栽培的主要蔬菜之一，土壤鹽漬化對生菜優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)帶來不利影響。近年來，通過外源物質(zhì)，如一氧化氮(nitric monoxide，NO)、CaCl2、Pro、SA、5-氨基乙酰丙酸等[1-2]，來緩解鹽脅迫對作物的傷害，已經(jīng)成為一種克服土壤鹽漬化的有效途徑。鹽脅迫對植物的傷害是多方面的，它可以使植物光合作用受阻、生物產(chǎn)量下降、活性氧過量導致膜完整性的破壞、蛋白質(zhì)變性、核酸斷裂、甚至細胞死亡。研究結(jié)果表明，植物受到鹽脅迫時體內(nèi)會合成較高含量的脯氨酸，這些積累的內(nèi)源脯氨酸可以減輕鹽脅迫對植物的傷害。水楊酸(salicylic acid，SA)是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類化合物，是細胞信號分子，也是一種內(nèi)源性激素，參與調(diào)節(jié)植物的許多生理過程。一些研究結(jié)果表明，水楊酸具有誘導植物抗病性，提高植物對非生物逆境的抗性，如緩解重金屬對植物的毒害作用、提高植物鹽脅迫能力等作用[3-4]。

生菜(LactucasativaL.)又名葉用萵苣，屬菊科萵苣屬，可生食，脆嫩爽口，略甜，深受人們喜愛，已成為我國蘇南地區(qū)重要栽培蔬菜之一。近年來土壤鹽漬化對生菜的生產(chǎn)造成了不同程度的損失。目前關(guān)于生菜鹽脅迫后的營養(yǎng)生理、干旱方面已有不少研究[5-6]，而有關(guān)鹽脅迫相關(guān)基因的研究較少。本研究通過對鹽脅迫以及鹽脅迫后添加外源脯氨酸(proline，Pro)和SA后水培液中生菜的生理狀態(tài)以及相關(guān)基因表達的研究，探究外源物質(zhì)Pro和SA對鹽脅迫下生菜的作用機制，旨在為緩解生菜鹽害提供理論和技術(shù)依據(jù)，同時為解決生菜在栽培和育種實踐中綜合逆境因子的傷害提供新思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所利用的植物材料是生菜品種‘美國大速生’。試驗于2015年4月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院園藝實驗基地連棟溫室內(nèi)進行。試驗期間溫度20～25 ℃，濕度60%～70%，光照5 000～7 000 lx。

1.2 營養(yǎng)液配方

試驗共設(shè)置5個處理(T1、T2、T3、T4、T5)，以Hoagland營養(yǎng)液作為對照(CK)。生菜幼苗定植于栽培槽中，待生菜培養(yǎng)35 d左右進行如下處理：T1，Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol·L-1NaCl；T2，Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1Pro；T3，Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1SA；T4， Hoagland營養(yǎng)液+100 mmol·L-1NaCl+0.2 mmol·L-1SA+0.2 mmol·L-1Pro；T5，Hoagland營養(yǎng)液+0.2 mmol·L-1SA+0.2 mmol·L-1Pro。均采用氣泵間歇通氣培養(yǎng)，每2 d換一次營養(yǎng)液。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同處理的營養(yǎng)液配方對生菜形態(tài)指標的影響

在營養(yǎng)液中處理1、2、6、12、48 h時分別取以上5種處理和對照測定生菜的株高、葉片數(shù)、最大葉長、最大葉寬以及根長。測定方法參照《萵苣種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[7]。

1.3.2 不同處理的營養(yǎng)液配方對生菜生理指標的影響

分別測定不同處理以及對照的POD、脯氨酸、丙二醛，使用南京建成生物研究所研發(fā)的試劑盒進行測定。

1.3.3 不同處理的營養(yǎng)液配方對耐鹽相關(guān)基因表達量的影響

采用半定量方法對生菜鹽脅迫相關(guān)基因進行檢測，最終篩選出3個相關(guān)基因分別是9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因(LSNCED1， GenBank登錄號AB120107；LSNCED2 ，GenBank登錄號AB120108)、吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(LSP5CS， GenBank登錄號AJ715852)。為了進一步驗證半定量篩選基因的準確性，采用實時定量的方法進一步準確描述基因的表達量。根據(jù)NCBI中公布的基因序列，分別設(shè)計幾個基因以及內(nèi)參基因(ACTIN)半定量和熒光定量的引物(表1)。

生菜總RNA提取、消化采用MiniBEST Plant RNA Extraction試劑盒。以總RNA為模板，采用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并保存在-20 ℃。

MiniBEST Plant RNA Extraction、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis、熒光染料均購自TaKaRa公司。半定量PCR反應(yīng)：先用ACTIN基因作為內(nèi)參，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈cDNA為模板進行PCR擴增，使不同樣品所擴增的ACTIN的量一致(以電泳條帶的光密度值計量)，進一步確定所需的單鏈cDNA的模板量，然后進行樣品的半定量PCR反應(yīng)。半定量擴增采用20 μL反應(yīng)體系，其中PCRmix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，共29個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。實時熒光定量PCR：應(yīng)用ABI Step OnePlus 實時定量PCR儀，使用SYBR GreenⅠ(TaKaRa)試劑，擴增體系20 μL包括1 μL cDNA，上、下游引物各0.8 μL，10 μL反應(yīng)MIX，7.4 μL ddH2O。反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s ，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s ，40個循環(huán)。試驗設(shè)置3次重復，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及熔解曲線[11-12]。試驗數(shù)據(jù)用ΔΔCt法分析[13]，采用Excel2010繪制柱狀圖。

表1引物序列及PCR擴增片段大小

Table1Sequence of primers and sizes of PCR amplified products

基因名稱CodeNo.引物序列(5'-3')Sequence(5'-3')用途Use參考文獻ReferenceLSNCED1GTTGCTCGGTTGGCTTTATTTTTGACGACGGAGTTATCCTTATTTG定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR[8]LSNCED2AGAACGAGCTATCGGGAAACCTGGTTCACTTCACAAAGGCAAA定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR[8]P5CSCGGGCACCATCACAAAATCGAGGAGAAAACATAGGAGCCAAAA定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR[9]ACTINLSNCED1LSNCED2P5CSACTINTTTGCTGGAGATGATGCTCCGTGGTACGACCACTGGCATATGCTCTACAGTCTTCTCCCTTACCGACTTCCCTCCGTCTTTCAACGGCTGACCCAAATGTTTTGTTCACCATCCCTGCTTACTGAAAGGAGGGAAAGAAGCTCACTCGTGGTCCAGAAAATAGTTTGCTGGAGATGATGCTCCGTGGTACGACCACTGGCATA定量RT-PCRQuantitativeRT-PCR半定量PCRSemiquantitativePCR半定量PCRSemiquantitativePCR半定量PCRSemiquantitativePCR半定量PCRSemiquantitativePCR[10][8][8][9][10]

2 結(jié)果與分析

2.1不同處理的營養(yǎng)液配方對生菜形態(tài)指標的影響

T1處理下，生菜的各個形態(tài)指標都比CK組有所下降，其中最大葉寬的變化最明顯，在24 h時，最大葉寬為11.20 cm，比對照減少了15.98%；其次是根長，在處理24 h時，根長為23.63 cm，比CK減少了10.15%。與CK相比較， T2處理1～6 h時各指標增加不明顯，甚至有的指標出現(xiàn)降低現(xiàn)象；在處理12～24 h，各個指標都有不同程度的增加(表2)，其中處理24 h時增幅較明顯的是根長和葉片數(shù)，分別比CK增加了9.77%和34.09%。T3處理1～2 h時，各生菜形態(tài)指標與CK相比幾乎沒有變化；處理6～12 h時，根長、最大葉寬和葉片數(shù)稍微增加，其他指標沒有變化；處理24～48 h時，各個指標比對照都有明顯增加，處理24 h時，各個指標增加呈現(xiàn)顯著性差異，其中增幅最大的是株高，比對照增加了12.62%，其次是最大葉寬，比對照增加了10.51%。T4處理下，生菜生長狀況與CK相比未有明顯變化，在處理12～24 h時，生菜各個生長指標都比對照有顯著增加，而且在處理24 h時，各個生長指標增幅達到最大；隨著處理時間的延長(48 h時)，各個生長指標增幅下降。T5處理下，生菜各個生長指標與CK相比變化不大。

2.2不同處理的營養(yǎng)液配方對生菜生理指標的影響

與CK相比，T1處理1～2 h時，生菜內(nèi)脯氨酸含量逐漸升高；在處理6 h時脯氨酸含量最低，隨著處理的延長脯氨酸含量保持著動態(tài)平衡。POD活性在處理1～6 h增加緩慢，隨后又逐漸降低，可能是剛受到鹽脅迫時，生菜體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)造成POD活性逐漸升高，隨后顯著降低。在處理1～12 h時，T1處理的丙二醛含量變化不大；在處理24～48 h時，丙二醛含量驟然上升，表明處理時間的延長造成生菜鹽脅迫危害嚴重。T2處理下，脯氨酸含量高于同期的CK；處理6 h后POD活性顯著高于CK，表明外源脯氨酸能夠提高POD活性；丙二醛含量在處理1～12 h逐漸降低隨后稍微增加，表明脯氨酸能夠在一定程度上阻礙膜脂的氧化。T3處理12～48 h時，生菜內(nèi)脯氨酸含量顯著高于對照，表明水楊酸能夠一定程度上緩解鹽脅迫。T4處理12～48 h時脯氨酸含量逐漸升高；POD活性隨著處理時間的延長逐漸升高，在處理24 h時達到最高值；丙二醛在同期處理中含量逐漸降低，在處理12 h時含量最低，表明在這個處理時間段膜脂氧化程度減少。T5處理下，POD活性與MDA含量與CK相比幾乎無變化，說明添加外源脯氨酸和水楊酸對未受到鹽脅迫生菜無影響。

表2不同處理及不同處理時間對生菜形態(tài)指標的影響

Table2Lettuce morphological index in different treatment time

指標Indexes處理Treatment處理時間Treatmenttime/h126122448株高T111.20±0.15b11.20±0.15b5.55±0.82b9.56±0.03b11.47±0.58bc11.35±0.61bcPlantT211.93±0.37ab11.93±0.37ab6.37±0.49b11.57±0.68b12.87±0.67abc13.07±0.34abheight/cmT313.33±0.47ab13.33±0.47ab6.86±0.68b11.16±0.64b15.03±0.54a12.45±0.75abT412.37±0.23a12.37±0.23a5.90±0.20b10.39±0.75b14.00±1.80a14.35±1.53aT512.30±0.12ab12.30±0.12ab10.9±1.01a11.33±0.46b11.03±1.03c10.50±0.87cCK13.60±1.04a13.60±1.04a10.46±1.01a14.43±0.78a13.56±0.74ab12.96±0.58ab葉片數(shù)T112.00±0.58a12.00±0.58a14.00±0.58a14.00±0.33b15.00±0.67b15.00±1.00bLeafT212.00±0.67a12.00±0.67a14.00±0.58a13.00±0.00b16.00±0.88b15.00±1.53bnumberT312.00±0.33a12.00±0.33a15.00±0.88a13.00±0.67b15.00±1.00b14.00±0.33bT412.00±0.67a12.00±0.67a14.00±0.33a14.00±0.33b15.00±0.33b15.00±0.88bT512.00±0.33a12.00±0.33a13.00±0.66a13.00±0.33b15.00±0.58b16.00±0.58bCK12.00±3.33a12.00±3.33a14.00±2.87a16.00±2.65a26.00±3.84a22.00±2.02a最大葉長T113.46±0.18b13.46±0.18b12.90±0.95c13.03±0.28c13.50±0.42b13.60±0.47bThelargestT215.40±0.58a15.40±0.58a14.83±0.60ab14.25±0.60bc14.30±0.55ab14.50±0.48ableafT314.65±3.56ab14.65±3.56ab14.03±0.24abc14.20±0.30bc14.16±0.17ab14.20±0.21ablength/cmT415.27±3.49a15.27±3.49a14.20±0.70abc14.56±0.67b13.90±0.72ab14.05±0.75abT514.90±3.71ab14.90±3.71ab13.40±0.15bc13.53±0.18bc14.00±0.40ab13.83±0.15bCK16.06±3.68a16.06±3.68a15.33±0.60a16.00±0.55a15.00±0.71a15.14±0.74a最大葉寬T112.25±0.43bc12.25±0.43bc10.05±1.06c12.17±1.01ab10.50±1.04c10.87±0.94cThelargestT212.20±0.32bc12.20±0.32bc11.81±0.77ab12.80±1.02ab11.83±0.67bc12.55±0.78bleafT313.13±0.54ab13.13±0.54ab12.20±0.30ab12.50±0.06ab12.46±0.03b12.53±0.12bwidth/cmT411.50±0.29c11.50±0.29c11.30±0.25bc11.33±0.44b11.79±0.25bc11.77±0.39bcT511.65±0.25bc11.65±0.25bc10.75±0.62bc11.57±0.30b11.85±0.43bc11.67±0.33abcCK13.90±0.40a13.90±0.40a13.10±0.58a13.51±0.58a14.53±0.95a14.71±0.77a根長T122.80±0.60ab22.80±0.60ab22.30±1.08ab23.50±1.30ab22.63±2.25ab23.25±1.65abRootT224.50±0.60a24.50±0.60a18.43±3.70bc18.95±2.30cd18.86±0.55bc18.9±1.22bLength/cmT319.10±5.00b19.10±5.00b25.45±4.98a25.40±4.87a26.20±5.07a25.65±6.36aT419.45±1.48b19.45±1.48b17.05±1.58c17.00±1.49d18.85±1.47c18.93±1.58bT520.95±0.56ab20.95±0.56ab20.57±0.38bc19.55±0.56bcd18.56±0.52bc18.36±0.19bCK21.70±4.30ab21.70±4.39ab22.33±3.90ab22.46±4.06abc22.90±4.75ab24.5±4.71a

同一指標同一列數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values of the same index in the same column without the same lowercase letters indicate the significant difference at the level of 0.05. The same as below.

2.3不同處理的營養(yǎng)液配方對耐鹽相關(guān)基因表達量的影響

2.3.1 鹽脅迫對生菜9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因(LSNCED)表達的影響

滲透脅迫是鹽脅迫作用最先產(chǎn)生的方式[14]，最直接的表現(xiàn)是營養(yǎng)液滲透壓增大，導致細胞失水，同時破壞細胞內(nèi)外滲透壓，損壞膜結(jié)構(gòu)，組織細胞分裂和增殖，阻礙生長。NCED基因最初是在玉米(Zeamays)的ABA缺失突變體viviParousj4(vPj4)中克隆得到[15]，其可以特異地氧化裂解9-順式紫黃質(zhì)和9-順式新黃質(zhì)而產(chǎn)生黃質(zhì)醛，而并不催化其他種類的類胡蘿卜素氧化裂解。隨后在擬南芥、番茄、豇豆、菜豆、柑橘、草莓等植物中均克隆到這個基因，NCED基因是一個多基因家族，在植物界中普遍存在并高度保守；在結(jié)構(gòu)上無內(nèi)含子，氨基酸序列的N-端有典型的葉綠體靶向轉(zhuǎn)運肽，而C-端高度同源，并且有4個保守的組氨酸結(jié)構(gòu)[16]。NCED基因在干旱和鹽脅迫誘導下都能表達，且其表達趨勢與植物體內(nèi)ABA含量一致[17]。

表3生菜不同處理時間生理指標

Table3Lettuce physiological indexes in different treatment time

指標Indexes處理Treatment處理時間Treatmenttime/h126122448脯氨酸T1218.70±4.48ab274.64±22.29ab118.64±0.41b144.96±0.74c326.31±35.14abc383.58±35.31ab/(U·mgT2271.57±35.50a284.33±16.73ab371.92±68.97a226.33±19.23b260.38±9.86bc510.50±20.04aprot-1)T3268.14±27.03a257.04±19.36ab114.12±5.52b352.06±7.39a362.12±4.69ab376.91±6.68bT4211.29±13.33ab198.06±11.44c113.52±1.35b213.76±18.49b412.65±60.24a442.79±3.82abT5152.70±20.09b242.78±13.90bc124.38±11.38b226.33±22.19b224.89±19.99c504.20±51.53abCK240.48±0.63a319.01±19.01a122.54±15.39b176.04±8.88b296.19±63.25bc187.02±19.08cPOD/T10.025±0.003ab0.027±0.005ab0.085±0.006a0.073±0.003a0.287±0.073a0.045±0.001b(U·mgT20.028±0.002ab0.014±0.002b0.059±0.003ab0.054±0.002ab0.249±0.029a0.030±0.001bprot-1)T30.016±0.002b0.030±0.001a0.068±0.004ab0.072±0.008a0.071±0.006b0.067±0.004bT40.021±0.000b0.022±0.001ab0.050±0.002b0.061±0.007a0.266±0.025a0.151±0.023aT50.040±0.008a0.030±0.006a0.057±0.002ab0.072±0.005a0.233±0.025a0.054±0.002bCK0.037±0.007a0.029±0.004a0.082±0.001ab0.024±0.001b0.308±0.080a0.133±0.006a丙二醛/T10.011±0.002b0.006±0.001de0.033±0.001ab0.014±0.001a0.012±0.003bc0.019±0.002ab(nmol·mgT20.012±0.001bc0.013±0.001cd0.011±0.001d0.001±0.001c0.013±0.002abc0.016±0.002bprot-1)T30.015±0.004a0.030±0.003a0.003±0.001e0.009±0.001b0.014±0.002ab0.026±0.003abT40.004±0.001c0.019±0.001bc0.031±0.002b0.012±0.002ab0.008±0.002d0.037±0.002aT50.007±0.002b0.025±0.002ab0.025±0.001c0.009±0.001b0.010±0.001c0.023±0.002abCK0.009±0.002b0.004±0.001e0.037±0.001a0.015±0.003a0.015±0.001a0.022±0.001ab

生菜在受到鹽脅迫后，體內(nèi)LSNCED1的表達量發(fā)生一定的變化(圖2)，在T1處理下，LSNCED1基因的表達量始終高于CK，隨著處理時間的延長，LSNCED1基因表達量先升高后降低。這與生菜受到鹽脅迫后體內(nèi)POD活性變化相一致，可能是LSNCED1表達間接地影響POD的產(chǎn)生。在T2處理下，LSNCED1基因表達量呈現(xiàn)波浪式增加，在處理24 h表達量最大，與生菜形態(tài)指標增幅相一致，可能是外源脯氨酸在處理24 h促進LSNCED1基因的表達。在T3處理下，LSNCED1基因表達在處理1～6 h始終受到抑制，處理12～48 h時基因的表達量升高，在48 h表達量達到最大，這與在該處理下生菜體內(nèi)脯氨酸含量變化相一致。在T4處理下，LSNCED1基因在處理1～6 h與對照相比幾乎沒有變化，在處理12～48 h表達量升高，處理24 h基因表達量最大，隨后稍微降低，這與在該處理下生菜內(nèi)POD活性的變化相符。在T5處理下，LSNCED1基因表達量與CK相比幾乎沒有變化，生菜的形態(tài)指標和生理指標變化幾乎與基因表達量相一致(圖2)。

在鹽脅迫條件下，生菜的LSNCED2基因的表達量變化如圖3，與對照相比，隨著時間的延長，T1處理的LSNCED2基因表達量在處理1～6 h時高于對照，在處理12～48 h時基因表達量受到抑制，且LSNCED2基因的表達量與生菜體內(nèi)脯氨酸含量的變化大致相符。T2處理在1～6 h時基因的表達與對照相比幾乎沒有變化；在處理12～48 h時，基因表達量明顯上調(diào)，尤其是在處理24 h表達量最大，這與生菜在該處理下各個形態(tài)指標變化相似。T3處理的LSNCED2基因表達量先降低隨后逐漸升高，在處理24 h時表達量最大，這與生菜POD活性變化類似，可能是因為在鹽脅迫下外源水楊酸可以促進POD生成從而清除鹽脅迫細胞內(nèi)活性氧自由基的含量，抑制膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化作用，提高生菜的抗鹽脅迫能力。T4處理的LSNCED2基因在處理1～6 h與對照相比沒有變化；在處理12～48 h時，基因表達量驟然升高；在處理24 h時表達量呈現(xiàn)顯著差異，與生菜形態(tài)指標變化相符，可能是LSNCED2間接影響生菜表型的變化。T5處理的LSNCED2基因表達量與對照相比沒有多大變化，同時生菜的形態(tài)指標和生理指標也未發(fā)生較大改變(圖3)。

圖2 LSNCED1基因在不同處理時間的表達Fig.2 LSNCED1 genes expression in different treatment time

2.3.2 鹽脅迫對生菜吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因表達的影響

脯氨酸作為植物體內(nèi)最重要的胞質(zhì)滲透調(diào)節(jié)劑，在細胞受到滲透脅迫時通過大量積累脯氨酸保持細胞與外界環(huán)境的滲透平衡[18]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成限速酶，決定植物體內(nèi)脯氨酸的積累速度[19]。前人通過P5CS基因轉(zhuǎn)化的煙草[20]、水稻[21]、馬鈴薯[22]、擬南芥[23]等轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量比對照高幾倍，對干旱、高鹽及重金屬等逆境脅迫的抗逆性及耐受性顯著增強。

生菜在受鹽脅迫條件下，體內(nèi)的LSP5CS基因的表達量變化如圖4，在T1處理下，LSP5CS基因表達量在處理1～12 h高于CK，處理24～48 h基因的表達量明顯受到抑制，這與該處理下生菜體內(nèi)脯氨酸含量變化一致。生菜受到鹽脅迫后，體內(nèi)自身合成的脯氨酸維持不了原來的滲透壓平衡。在T2處理下，LSP5CS表達量始終高于對照，尤其在處理24 h基因表現(xiàn)出超表達，與生菜體內(nèi)脯氨酸含量變化一致，表明外源脯氨酸促進鹽脅迫生菜體內(nèi)脯氨酸的積累。在T3處理下，LSP5CS基因表達量在處理1～12 h時與CK相比幾乎沒有變化，處理24～48 h基因的表達顯著高于對照，而且在處理24 h表達量最大，這與生菜在該處理下形態(tài)指標的變化趨勢相同。在T4處理下，LSP5CS基因在處理1～6 h表達處于抑制狀態(tài)，在處理12～48 h時，基因的表達量升高，并且在處理24 h表達量最大，隨后稍微降低，與該處理下生菜的形態(tài)和生理指標的變化一致。在T5處理下，LSP5CS基因表達量與CK相比沒有變化，同時生菜的形態(tài)和生理指標也未發(fā)生較大變化，表明在未受到鹽脅迫條件下，外源物質(zhì)的添加對生菜的生長沒有影響(圖4)。

圖3 LSNCED2基因在不同處理時間的表達Fig.3 LSNCED2 genes expression in different treatment time

圖4 LSP5CS基因在不同處理時間的表達Fig.4 LSP5CS genes expression in different treatment time

3 討論

由9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因(NCED)催化的順-環(huán)氧類胡蘿卜素向黃養(yǎng)素的轉(zhuǎn)化是高等植物中ABA合成的限速酶[15，24-25]。吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是脯氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶[26]。大多學者對外源物質(zhì)對鹽脅迫生菜緩解上的研究還停留在生理水平，而對鹽脅迫過程生菜相關(guān)基因調(diào)控研究較少。本試驗通過對鹽脅迫生菜相關(guān)基因的表達和生理指標測定比較分析，得出LSNCED1、LSNCED2基因均在T2處理24 h時表達量最高，說明外源脯氨酸在處理24 h對生菜受到鹽脅迫有顯著的緩解作用，這與田亞然等[27]、李康等[28]的研究相一致。在T3處理下，LSNCED1基因在處理1～6 h時始終受到抑制，處理12～48 h時基因的表達量升高，在48 h表達量達到最大；LSNCED2基因表達量先抑制隨后逐漸升高，在處理24 h時表達量最大。這可能是外源水楊酸促進鹽脅迫生菜體內(nèi)脯氨酸積累間接地影響基因表達，同時也表明了LSNCED1、LSNCED2基因?qū)ν庠次镔|(zhì)的刺激表現(xiàn)得非常靈敏[29]。在T4處理中，LSNCED1、LSNCED2基因在處理1～6 h時，與CK相比沒有變化，在處理12～48 h時，LSNCED1、LSNCED2基因表達量驟然升高，同時在處理24 h表達量最大，表明生菜在鹽脅迫下加入外源脯氨酸和水楊酸能夠顯著得到緩解，在這5個處理中，T4處理24 h時，生菜的生理指標、形態(tài)指標和相關(guān)基因表達優(yōu)于其他處理的各個時期，可能水楊酸和脯氨酸能夠誘導鹽脅迫生菜中POD等抗氧化酶活性增加，同時也對抗氧化酶相關(guān)基因水平有調(diào)控作用。外源水楊酸和脯氨酸能夠增加根系長度，說明外源水楊酸和脯氨酸能通過根系生長促進地上部分生長。P5CS基因在T2、T3、T4處理過程中隨著處理時間的延長，基因的表達上調(diào)，但在各個時間段上調(diào)的幅度不同，與報道的大豆[30]、菜豆[31]、甘蔗[32]中P5CS表達特性相同，進一步說明了生菜體內(nèi)存在著滲透脅迫后脯氨酸積累的適應(yīng)機制，脯氨酸代謝受P5CS基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控。

從形態(tài)和生理指標來看，在鹽脅迫下(T1)，生菜株高、最大葉長、最大葉寬、葉片數(shù)、根長隨著處理時間延長，均未增長，這與祁向玲[1]對鹽脅迫生菜研究的結(jié)論一致。加入外源脯氨酸和水楊酸(T2、T3、T4)后，各個生長指標都有相應(yīng)增長，表現(xiàn)最明顯的是在根上，說明外源物質(zhì)首先促進根的生長，進而作用于地上部分[33-34]。在受到鹽脅迫時，脯氨酸含量和POD活性隨著處理時間延長逐漸降低，而MDA含量明顯升高。在未受到鹽脅迫生菜營養(yǎng)液里加入脯氨酸和水楊酸(T5)，生菜各個形態(tài)指標變化不明顯，沒有明顯的增長趨勢。從生理指標變化來看，外源物質(zhì)脯氨酸和水楊酸的加入隨著時間的延長明顯能提高體內(nèi)脯氨酸含量和POD活性，降低MDA的積累，表明生菜受到鹽脅迫時，能夠利用外源物質(zhì)促進體內(nèi)脯氨酸和POD的生成，維持細胞的滲透平衡，清除體內(nèi)的自由基，提高抗氧化能力[35-36]。綜合基因表達分析，進一步對生理指標的驗證，發(fā)現(xiàn)二者體現(xiàn)出一致性，也體現(xiàn)了基因表達分析可以成為探索外源物質(zhì)對鹽脅迫生菜緩解的一項依據(jù)。下一步將繼續(xù)對鹽脅迫下添加水楊酸和脯氨酸相關(guān)基因的互作、時空表達等進行研究，并對鹽脅迫下生菜生長保護劑進行進一步試驗和發(fā)掘。

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(責任編輯張 韻)

Effectofsalicylicacidandprolineongeneexpressionprofilesinresponsetosaltstressinlettuce

WU Jianhua1，2， WU Zhongxia3， WANG Yuanhua1，2， FENG Yingna1，2，*， YAN Zhiming1，2， CAI Shanya1， WANG Quanzhi1，2， SUN Ying1

(1.JiangsuPolytechnicCollegeofAgricultureandForestry，Zhenjiang212400，China; 2.JiangsuEngineeringandTechnologyCenterforModernHorticulture，Zhenjiang212400，China；3.SuiningCountyGaozuoTownAgriculturalTechnologyExtensionServiceCenter，Xuzhou221200，China)

In order to investigate the role of salicylic acid (SA) and proline (Pro) in alleviating salt stress in plants， a lettuce cultivar ‘Meiguodayesusheng’ was used in this study. The lettuce seedlings were grown in hydroponic system under salt stress， and SA and Pro were added to the nutrition solution， respectively. In determination of the morphological and physiological indexes related to salt stress， the results showed that the growth of lettuce seedlings under salt stress was significantly alleviated when treated with 0.2 mmol·L-1SA and 0.2 mmol·L-1Pro for 24 hours. The expression levels of the genes related to salt stress were analyzed by RT-PCR and qRT-PCR，and the expression ofLSNCED1，LSNCED2 andLSP5CSwere remarkably up-regulated under salt stress. These results indicated that 0.2 mmol·L-1SA and 0.2 mmol·L-1Pro could reduce the injury to lettuce caused by salt stress to some extent.

salt stress; lettuce; physiological characteristic; salt-stress related gene; gene expression

S636.2

：A

：1004-1524(2017)09-1489-09

巫建華，吳中俠，王媛花，等. 水楊酸和脯氨酸對鹽脅迫下生菜相關(guān)基因表達的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(9)： 1489-1497.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.10

2017-03-04

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程(SXGC[2015]311)；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目 (PPZY2015B173) ；青藍工程

巫建華(1965—)，男，安徽宣城人，博士，推廣研究員，主要從事園藝生產(chǎn)和園藝植物分子生物學研究。E-mail: 932465017@qq.com

*通信作者，馮英娜，E-mail: 503735727@qq.com