龐 欣，程 遠(yuǎn)，郭勤衛(wèi)，鄭佳秋，萬紅建，*

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215008； 2.浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021； 3.衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 衢州 324000； 4.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002)

辣椒紫色酸性磷酸酶基因家族的鑒定與表達(dá)特征

龐 欣1，程 遠(yuǎn)2，郭勤衛(wèi)3，鄭佳秋4，萬紅建2，*

(1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215008； 2.浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021； 3.衢州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 衢州 324000； 4.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 鹽城 224002)

紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatases，PAPs)屬于金屬磷酸酯酶家族，參與了植物大量的生理反應(yīng)，特別是磷素的吸收與利用。本研究利用已經(jīng)發(fā)表的辣椒基因組數(shù)據(jù)，采用同源比對(duì)方法對(duì)辣椒PAP基因家族進(jìn)行鑒定與表達(dá)分析。通過鑒定發(fā)現(xiàn)辣椒基因組中至少含有25個(gè)PAP基因成員，氨基酸序列長度在264～639 aa，具有1～12個(gè)內(nèi)含子，不均勻地分布在12條染色體上，僅發(fā)現(xiàn)1對(duì)基因以串聯(lián)重復(fù)的形式存在。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，辣椒、擬南芥和水稻PAP基因家族成員可以分為3個(gè)家族，8個(gè)亞家族，每個(gè)家族成員的數(shù)目是變異的，而且存在6對(duì)直系同源基因和20對(duì)旁系同源基因，這表明PAP基因家族的存在早于辣椒、擬南芥和水稻的分化?；赗NA-seq數(shù)據(jù)庫和qRT-PCR方法，對(duì)辣椒PAP基因的組織表達(dá)及果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期進(jìn)行分析，結(jié)果表明PAP家族基因具有組織表達(dá)特異性和發(fā)育時(shí)期表達(dá)特異性。

辣椒；紫色酸性磷酸酶；基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

紫色酸性磷酸酶(purple acid phosphatases，PAPs)是一種普遍存在于動(dòng)、植物體內(nèi)的金屬磷脂酶蛋白，能在酸性條件下催化磷酸酯或酸酐水解成無機(jī)磷酸根[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在PAPs 羧基端具有一個(gè)由5個(gè)基序組成的保守結(jié)構(gòu)域，且含有7個(gè)金屬配對(duì)氨基酸殘基(DXG/GDXXY/GNH(D/E)/VXXH/GHXH；粗體代表金屬配對(duì)殘基)，此外還有一個(gè)金屬離子的雙核中心[2]。根據(jù)蛋白的分子量，植物中的PAPs一般分為兩類，高分子量PAPs(約55 ku)和低分子量PAPs(約35 ku)。高分子量PAPs通常以同源二聚體的形式存在，包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域)，與真菌和分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的PAPs同源性較高。低分子量蛋白以單體形式存在，僅包括一個(gè)結(jié)構(gòu)域(C端結(jié)構(gòu)域)，與動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的PAPs更相似[3]。

目前，PAP已在許多植物中鑒定出來，并具有多種功能，如磷素的吸收與利用[4-7]、氧化還原反應(yīng)[8-11]、花的發(fā)育[12]和細(xì)胞壁的合成[13-15]等。隨著越來越多植物基因組測序的完成，在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)了29個(gè)PAP基因，并分析了低磷脅迫下7個(gè)基因的表達(dá)模式，其中AtPAP11和AtPAP12被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)[2]。隨后，相繼在水稻、大豆和玉米全基因組水平上也鑒定出PAP基因，其中部分基因也受低磷脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)[16-19]。

辣椒是我國最重要的蔬菜植物之一，然而辣椒基因組中的PAP基因家族未有報(bào)道。最近，辣椒全基因組的測序已經(jīng)完成[20]，為我們通過生物信息學(xué)方法鑒定PAP基因家族提供了機(jī)會(huì)。本研究利用辣椒基因組信息，鑒定辣椒PAP 基因家族，通過生物信息學(xué)等方法分析PAP基因家族成員序列結(jié)構(gòu)特征、基因染色體定位、基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和組織特異性表達(dá)模式等，為揭示辣椒PAP基因家族成員的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)中，三個(gè)物種(辣椒、擬南芥和水稻)的PAP基因家族成員被鑒定。辣椒(CapsicumannuumL.)PAP基因家族信息來自于已經(jīng)公布的辣椒基因組數(shù)據(jù)庫(http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp)；擬南芥PAP基因序列和蛋白序列來源于TAIR(http://www.arabidopsis.org)；水稻PAP基因序列和蛋白序列來自水稻基因組注釋項(xiàng)目網(wǎng)站(http://rice.plantbiology.msu.edu)。

1.2 辣椒PAP基因家族的鑒定

分別以擬南芥和水稻基因組中的PAP氨基酸序列為模板，對(duì)辣椒全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp程序搜索，將其結(jié)果進(jìn)一步通過PFAM網(wǎng)站(http://pfam.janelia.org)進(jìn)行鑒定是否含有保守基序(DXG/GDXXY/GNH(E/D)/VX2H/GHXH)，篩選出辣椒基因組中的CaPAPs候選基因序列。利用在線網(wǎng)站ExPASy Bioinformatics Resource Portal(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測其分子量和等電點(diǎn)。

1.3辣椒PAP基因家族成員的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

采用網(wǎng)站GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn)在線工具預(yù)測PAP基因家族成員外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征[21]。然后，通過Clustal X軟件對(duì)擬南芥、水稻和辣椒PAP基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)[22]，利用MEGA 5.0軟件的鄰接法對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，各參數(shù)設(shè)定為：P-distance、pairwise deletion和Bootstrap值(1 000次重復(fù))[23]，分析PAP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.4 辣椒PAP基因的染色體定位及表達(dá)分析

利用MapDraw V2.1軟件進(jìn)行辣椒PAP基因染色體定位分析。在NCBI GEO數(shù)據(jù)庫下載辣椒根、莖、葉、花、花蕾及果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的RNA-seq測序數(shù)據(jù)，利用MeV軟件分析PAP基因的表達(dá)模式。

以辣椒“0028”為材料用于定量表達(dá)分析驗(yàn)證，通過Trizol法提取根、莖、葉、花、嫩果、成熟綠果、轉(zhuǎn)色期果實(shí)和紅果不同組織的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一鏈。利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PAP熒光定量引物(表1)，選取UBI-3為內(nèi)參基因[24]，qRT-PCR的反應(yīng)體系為：10 μL SYBR Green I，1 μL上游引物(5 μmol·L-1)，1 μL 下游引物(5 μmol·L-1)，1 μL cDNA，7 μL ddH2O。qRT-PCR循環(huán)程序?yàn)椋?5 ℃，3 min；94 ℃，30 s，58 ℃，25 s；72 ℃，20 s，共35個(gè)循環(huán)。設(shè)計(jì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒PAP基因家族的鑒定

以擬南芥和水稻已經(jīng)公布的PAP基因家族成員為靶序列，在辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blasp檢索，共鑒定了25個(gè)辣椒PAP基因家族成員(CaPAP01～CaPAP25)。經(jīng)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其中23個(gè)CaPAPs序列的COOH羧基端具有5個(gè)基序組成的保守結(jié)構(gòu)域，只有CaPAP01和CaPAP03缺少1個(gè)基序(表2)，由于其與PAP的同源性較高，依然歸為CaPAP基因家族。由表2可以看出，這些基因的氨基酸長度在264 aa(CaPAP15)～639 aa(CaPAP12)；分子量大小30.3～72.5 ku。辣椒PAP基因的等電點(diǎn)位于5.41～8.64，大部分為酸性蛋白。

2.2辣椒PAP基因聚類及內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)分析

表1辣椒PAP基因特異引物信息

Table1Specific primer for PAP gene in pepper

基因Gene正向引物(5'～3')Forwardprimer(5'～3')反向引物(5'～3')Reverseprimer(5'～3')片段大小Size/bpCaPAP01ACCAGAACCAATGTGTGAACTCAGAAAATGCTGTAAGCTTGACGAACCC172CaPAP02ATTTATGGGCGGATTCTGTTGTCTCATTTTTCACCTCG137CaPAP03GGAGGATGAAAGAGTATGGTATCCATTTTTCGCTCTCCAC153CaPAP04GGATTTGTTTGCGTTCTTTCGACTTTCGGTATCACTTATG355CaPAP05GGGTCCGAAGGGAGGACAACTCCAGGATCACGCCATCCAA109CaPAP06CTATGAAAGGACCAACAGAGTGTCCAATCGCCATCTTCTC103CaPAP07CGTTGTCTTTGCTGGTCATGCTTGGCTGTGGTTGTGTCAT181CaPAP08CTGAAATGGGGATGATGAAGCCAGTTTCCATACCCTCCAT150CaPAP09TAAGCAAAGGGATAGCAGGTATGCTGAGTCTAAATCCTTC195CaPAP10GCTTTCCCTGTGCAAGTTGTGATTGAGATTGCAGAGGCTGTGGGT111CaPAP11CAGAGGAAATGTAGAAGCGCCCTATGCTTCTAATGGCGTG292CaPAP12GCCTTCTTCTCTGGTGGTTTGGCGACAAATGGAACAGCCTCGT175CaPAP13GTGGCTGTTTGTTGTTGTGCTTTCCTCCATCACCAATCGT253CaPAP14GGTGGAAATCTTGAAGGCCTAGCGCCTCGCGGAATGCAGAGTA71CaPAP15TATTGTTTTTGCGGGTCATGTATTTCCTCCATCACCAACG141CaPAP16TCATGGAGGGAGAAAGTTTGCGAAGGCGCTGATTTATCCGGTACT173CaPAP17AACCCTGTGGGACTCGTTCGTGGTTGCCCTGAGTCACCAT78CaPAP18CAAGGTGAAGGTGACGACATTTCTCTATTTCCTCCATCGC175CaPAP19ACATGGAAGCGACTTGATGATGAACGGGCACTCACACTGAACACC134CaPAP20GCCAATGGATATCTTTCTCAGTGGGATGTCTGAGCCAGGACACCACA170CaPAP21GCAGCTTCGGCCATGGGATAGCAGCTGCAATGTCCAACACC199CaPAP22AACCCTGTGGGACTCGTTCGTGGTTGCCCTGAGTCACCAT78CaPAP23TTCAAATGCCAACACCTGCTCGCTCTTCATCCATTCATAC127CaPAP24AAGGTGAACAGAGAGAAAACCTGTTTTATCTGGCACGGG242CaPAP25ATGATGCCACCTCAGCAGCAAGCAGCACCGTATTGTTGCG99

利用MEGA5.0軟件對(duì)辣椒25個(gè)PAP基因家族成員的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析(圖1)。辣椒全基因組PAP基因家族成員分為三大類(Ⅰ～Ⅲ)，第I類基于高的Bootstrap重復(fù)次數(shù)，進(jìn)一步分為2個(gè)亞類，Ia和Ib。每類里分別包括5～7個(gè)不等的PAP基因。我們進(jìn)一步構(gòu)建了辣椒PAP基因家族成員的結(jié)構(gòu)模式圖(圖1)。發(fā)現(xiàn)辣椒CaPAP基因家族成員之間內(nèi)含子數(shù)目變異大，CaPAP05含有最多的內(nèi)含子(12個(gè))，CaPAP10含有最少的內(nèi)含子(1個(gè))。此外，還可以看出，所有的辣椒PAP基因都不含5′和3′非編碼區(qū)(5′-UTR和3′-UTR)。

2.3辣椒、擬南芥和水稻PAP基因家族比較分析

為了分析辣椒PAP基因家族的進(jìn)化關(guān)系，將其與擬南芥和水稻進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。共有80個(gè)PAP基因參與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(辣椒25個(gè)、擬南芥29個(gè)和水稻26個(gè))(圖2)。它們可分為3個(gè)家族(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)，借助于高的Bootstrap值，可進(jìn)一步分為8個(gè)亞家族(Ⅰa-1、Ⅰa-2、Ⅰb-1、Ⅰb-2、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲa和Ⅲb)，除Ⅲa外，每個(gè)亞家族都包含有來自這3個(gè)物種的成員。基因數(shù)目最多的為Ⅱb亞家族，含有17個(gè)PAP基因，最少的為Ⅰa-1和Ⅱa亞家族，分別只含有4個(gè)PAP基因。

此外，我們從來自辣椒、擬南芥和水稻共80個(gè)PAP基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中，分析發(fā)現(xiàn)52個(gè)PAP基因具有同源關(guān)系，占基因總數(shù)目的65%(52/80)。物種間存在6對(duì)直系同源基因(CaPAP18和AtPAP18、CaPAP21和AtPAP23、AtPAP29和CaPAP19、CaPAP07和AtPAP12、AtPAP10和OsPAP10a、AtPAP16和CaPAP08)。而物種內(nèi)存在20對(duì)旁系同源基因，8對(duì)來自辣椒(CaPAP17和CaPAP22、CaPAP02和CaPAP06、CaPAP16和CaPAP24、CaPAP13和CaPAP14、CaPAP23和CaPAP03、CaPAP12和CaPAP01、CaPAP05和CaPAP20、CaPAP11和CaPAP04)，6對(duì)來自擬南芥(AtPAP21和AtPAP22、AtPAP11和AtPAP19、AtPAP6和AtPAP25、AtPAP2和AtPAP9、AtPAP24和AtPAP27、AtPAP8和AtPAP3)，6對(duì)來自水稻(OsPAP20a和OsPAP20b、OsPAP21b和OsPAP21c、OsPAP10b和OsPAP10c、OsPAP27a和OsPAP27b、OsPAP1d和OsPAP1c、OsPAP3c和OsPAP3b)。

2.4 辣椒PAP基因的染色體定位

利用MapDrawV2.1軟件進(jìn)行辣椒PAP基因染色體定位，發(fā)現(xiàn)除2號(hào)染色體外，25個(gè)PAP基因定位于辣椒11條染色體(1、3、4、5、6、7、8、9、10、11及12號(hào))上，并且大多分布在染色體的兩端(圖3)。0號(hào)染色體含有4個(gè)PAP基因，1、3、5和8號(hào)染色體上分布有3個(gè)PAP基因，9號(hào)和11號(hào)染色體分別含有2個(gè)PAP基因，剩下的染色體中，每條染色體僅分布1個(gè)PAP基因。此外，8號(hào)染色體上的CaPAP14和CaPAP15集中分布在染色體的末端，以串聯(lián)復(fù)制形成基因簇結(jié)構(gòu)。

2.5 辣椒PAP基因的組織特異性表達(dá)分析

為了揭示辣椒PAP基因組織特異性表達(dá)模式，我們利用已發(fā)表的辣椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析PAP基因的表達(dá)模式(圖4)。結(jié)果表明，CaPAP11基因僅在花和花蕾中表達(dá)量較高，在根、莖、葉和果實(shí)不同發(fā)育階段幾乎不表達(dá)；CaPAP16在花蕾中的表達(dá)量相對(duì)于根、莖、葉、花的組織中表達(dá)量要高；而CaPAP09正好與其相反，除在花蕾中表達(dá)量低外，在其余組織中表達(dá)量均較高，此外，CaPAP09在果實(shí)發(fā)育早期特異性表達(dá)，表達(dá)量較高，而在果實(shí)成熟之后表達(dá)量較低；CaPAP07在各組織器官中葉的表達(dá)量相對(duì)較高。CaPAP05、CaPAP10、CaPAP18、CaPAP19、CaPAP24和CaPAP25在5個(gè)不同組織和9個(gè)果實(shí)發(fā)育時(shí)期都有較高的表達(dá)量，說明這些基因可能參與了辣椒生長發(fā)育過程中多種生理生化變化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。另外，CaPAP02未在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中找到表達(dá)數(shù)據(jù)；7個(gè)PAP基因家族(CaPAP06、CaPAP08、CaPAP13、CaPAP15、CaPAP17、CaPAP21和CaPAP22)的表達(dá)量較低或未表達(dá)。

為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可靠性，我們利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)CaPAP的25個(gè)成員引物，對(duì)辣椒不同組織(根、莖、葉、花)和果實(shí)不同階段(幼果、綠熟果、轉(zhuǎn)色果、紅果)的進(jìn)行定量表達(dá)分析(圖5)。結(jié)果表明，25個(gè)基因在RNA-seq和qRT-PCR的表達(dá)結(jié)果基本相同。其中CaPAP02、CaPAP08、CaPAP13、CaPAP15、CaPAP17和CaPAP22這6個(gè)基因經(jīng)定量分析不表達(dá)或表達(dá)量太低而無法檢測。

表2辣椒PAP基因家族信息

Table2General information about the 25CaPAPs genes

基因編號(hào)Gene基因名稱Proposedname保守基序Motif氨基酸長度Predictedproteinlength分子量PredictedSize(kDa)等電點(diǎn)PICapana01g000037CaPAP01GDMGGDITY FAAHGHVH57164.86.31Capana01g002627CaPAP02GDLGGDVTYGNHEATWHGHVH36441.46.00Capana01g002736CaPAP03HDPGGDISYGNHEVGLH33637.86.41Capana03g001595CaPAP04GDMGGDNFYGNHDVVGHGHDH33138.06.10Capana03g002050CaPAP05GDMGGDICYGNHEFLAHGHVH60768.16.06Capana03g004346CaPAP06GDLGGDVTYGNHEATWHGHVH54862.06.63Capana04g000279CaPAP07GDLGGDLSYGNHEVLMHGHVH46753.76.09Capana05g000061CaPAP08ADLHGDVIYGNHDIFWHGHNH40045.16.34Capana05g000873CaPAP09GDMGGDNFYGNHDVVGHGHDH33438.45.66Capana05g001052CaPAP10GDMGGDISYGNHEFQGHGHVH49155.76.42Capana06g000820CaPAP11GDMGGDNFYGNHDVLGHGHDH33337.96.62Capana07g000560CaPAP12GDMGGDLPYGNHEFAAHGHVH63972.56.62Capana08g002585CaPAP13GDLGGDISYGNHEVVVHGHVH47854.76.81Capana08g002594CaPAP14GDLGGDLSYGNHEVLVHGHVH46953.77.01Capana08g002595CaPAP15GDLGGDLSYGNHDFYQHGHVH26430.36.86Capana09g000041CaPAP16GDLGGDLSYGNHEVLMHGHVH47454.78.64Capana09g002383CaPAP17GDLGGDLSYGNHEVLVHGHVH37141.96.31Capana10g000017CaPAP18GDLGGDLSYGNHEVLFHGHVH46652.86.31Capana11g000145CaPAP19GDGKGDNIYGNHDAYFHGHDH36039.66.30Capana11g001954CaPAP20GDMGGDIVYGNHEFLAHGHVH61169.07.56Capana12g001817CaPAP21GDLGGDITYGNHEAAWHGHVH58165.75.77Capana00g000211CaPAP22GDLGGDLSYGNHEVLVHGHVH36441.26.18Capana00g001068CaPAP23HDPGGDISYGNHEFTGHGHVH36441.05.41Capana00g002861CaPAP24GDLGGDLSYGNHEVLMHGHVH45552.47.31Capana00g004184CaPAP25GDLGGDLSYGNHEVLFHGHVH74683.45.45

圖2 辣椒、擬南芥和水稻PAP蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationships of PAP protein with pepper， Arabidopsis and rice

圖3 辣椒PAP基因的染色體定位Fig.3 Chromosome mapping of CaPAPs in pepper

3 討論

眾所周知，植物營養(yǎng)元素磷不僅是核酸等在生物細(xì)胞內(nèi)的重要化合物分子，而且還參與了植物許多重要的生理生化過程[24]。但植物所需的無機(jī)磷，其在土壤中的含量卻非常有限，在將土壤富含的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化成無機(jī)磷的過程中，酸性磷酸酶起到了重要的作用。而紫色酸性磷酸酶是酸性磷酸酶的一種，按功能可將其分為細(xì)胞內(nèi)和分泌型兩種，細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶(IAP)主要利用植物體內(nèi)儲(chǔ)存的有機(jī)磷，分泌型酸性磷酸酶(SAP)主要降解體外的有機(jī)磷供植物吸收。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)PAP在植物的抗逆境、抗衰老、細(xì)胞發(fā)育和代謝等過程中，也扮演著重要的作用[15，25-27]。因此，挖掘和鑒定植物PAP基因，對(duì)進(jìn)一步揭示其在植物細(xì)胞組成以及各種生理生化活動(dòng)中均具有重要意義。2014年，辣椒全基因組序列的公布為我們鑒定PAP基因家族成員的數(shù)目、結(jié)構(gòu)等信息奠定了基礎(chǔ)。本研究從辣椒基因組數(shù)據(jù)庫中共鑒定得到25個(gè)PAP基因，分為3大類和4個(gè)亞類，其家族成員數(shù)量與擬南芥(125 Mb)29個(gè)和水稻(466 Mb)26個(gè)相似。盡管辣椒的基因組較大(3.48 Gb)，但并未獲得更多的PAP家族成員，其數(shù)量與基因組大小并不成正比關(guān)系，這說明植物中所含PAP基因可能具有較高保守性。

圖4 辣椒PAP基因表達(dá)圖譜Fig.4 The expression profile of PAP genes in pepper

圖5 辣椒PAP基因的定量表達(dá)分析Fig.5 qRT-PCR expression analysis of PAP genes in pepper

本研究以擬南芥、水稻和辣椒共80個(gè)PAP基因構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，這些基因被分成了3個(gè)家族，并且在每個(gè)家族中均存在AtPAP、OsPAP和CaPAP基因。這說明可能在單子葉和雙子葉植物分化前，PAP基因家族成員的基本特征就已形成。此外，我們還發(fā)現(xiàn)在辣椒、擬南芥和水稻中，共存在6對(duì)直系同源基因和20對(duì)旁系同源基因，其數(shù)目占基因總數(shù)的65%(52/80)，表明這些基因家族成員在單子葉和雙子葉植物分化之后，以物種特異的方式進(jìn)行了擴(kuò)展。目前，這種現(xiàn)象在其他植物基因家族的研究中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[28-30]。另外，由于PAP基因的高度保守性，具有相似功能的PAP可能被聚集到同一類，這為預(yù)測辣椒該基因家族的功能提供了依據(jù)。以前研究表明，AtPAP10基因是擬南芥根表面主要的酸性磷酸酶，超表達(dá)AtPAP10能增加植株的生長和磷吸收能力[31-32]；AtPAP12和AtPAP26兩個(gè)基因的單突變體植株中，缺磷誘導(dǎo)的酸性磷酸酶活性下降，在細(xì)胞和植株培養(yǎng)液中檢測到AtPAP12和AtPAP26蛋白，均受缺磷誘導(dǎo)[26，33]；水稻OsPAP10a基因在地上部分和根部的表達(dá)均受缺磷誘導(dǎo)，而OsPAP10c只在根部受缺磷特異誘導(dǎo)表達(dá)[34]，以上基因都是缺磷條件下的分泌型酸性磷酸酶，參與了磷代謝途徑。而這些基因均被聚類到Ia家族，故此基因家族的辣椒基因也可能具有相似的功能。

基于RNA-seq和qRT-PCR分析，本研究探討了辣椒PAP基因家族在不同組織和果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況，結(jié)果顯示有些基因的表達(dá)具有一定的組織特異性，如CaPAP11在花和花蕾組織，CaPAP07在葉組織，推測這些基因在組織發(fā)育過程中起到了重要的作用；CaPAP09和CaPAP14基因的表達(dá)量隨著果實(shí)的發(fā)育成熟而降低，這表明這兩個(gè)基因可能參與果實(shí)發(fā)育的相關(guān)調(diào)控過程；CaPAP05、CaPAP10、CaPAP18、CaPAP19、CaPAP24和CaPAP25在不同組織和果實(shí)發(fā)育不同階段都有較高的表達(dá)量，這表明它們與辣椒植株正常生理生化活動(dòng)聯(lián)系緊密。

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(責(zé)任編輯張 韻)

Genome-wideidentificationandexpressionanalysisofpurpleacidphosphatasesgenesinpepper

PANG Xin1， CHENG Yuan2， GUO Qinwei3， ZHENG Jiaqiu4， WAN Hongjian2，*

(1.SuzhouPolytechnicInstituteofAgriculture，Suzhou215008，China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，InstituteofVegetables，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.QuzhouAcademyofAgriculturalSciences，Quzhou324000，China; 4.JiangsuCoastalAreaInstituteofAgriculturalSciences，Yancheng224002，China)

Purple acid phosphatases (PAPs) are members of the metallo-phosphoesterases involved in a variety of physiological functions， especially phosphate acquisition in plants. In this paper， genome-wide identification and analysis of PAP gene family members in pepper were performed with homologues alignment method. These results found that the whole pepper genome contains at least 25 PAP genes with protein sequence length varying from 264 to 639 aa. Number of introns ranged from 1 to 12. They are distributed unevenly on 12 chromosomes， only had one tandem duplication. Phylogenetic relationships showed that PAP genes from three plants species (pepper， Arabidopsis and rice) can be separated into 3 groups， 8 subgroups， and the number of each group is variable. Six and twenty pairs of orthologous and homologous genes were found， indicating that the diversity of PAP genes occurred before the split of pepper， Arabidopsis and rice. Based on the RNA-seq database and qRT-PCR method， the expression analysis of different tissues and fruit development stages indicated that these genes had tissue and development stages specificity.

pepper; purple acid phosphatases; gene family; bioinformatics; expression analysis

S641.3

：A

：1004-1524(2017)09-1498-08

龐欣，程遠(yuǎn)，郭勤衛(wèi)，等. 辣椒紫色酸性磷酸酶基因家族的鑒定與表達(dá)特征[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(9)： 1498-1505.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.09.11

2017-01-13

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(BK20140277)；蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用基礎(chǔ)研究(SYN201418)；蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年教師科研能力提升計(jì)劃資助項(xiàng)目(PPN201308)；浙江省自然科學(xué)基金(LQ15C150002)；國家自然科學(xué)基金 (31501749)；國家自然科學(xué)基金青年人才培養(yǎng)計(jì)劃 (2015R23R08E07, 2015R23R08E09)；國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目 (2010DS700124-KF1517)

龐欣(1985—)，女，黑龍江哈爾濱人，博士，講師，從事蔬菜遺傳育種與分子生物學(xué)研究。E-mail: pxtracy916@163.com

*通信作者，萬紅建，E-mail: wanhongjian@sina.com