周海霞，李朝暉，趙景偉*

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.VIP病房；2.神經(jīng)外科，吉林 長春130033)

腦缺血再灌注后突觸后膜NMDA受體重塑性機制的研究

周海霞1，李朝暉2，趙景偉2*

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.VIP病房；2.神經(jīng)外科，吉林 長春130033)

目的探討腦缺血再灌注后神經(jīng)元突觸后膜NMDA受體發(fā)生遷移重塑的機制。方法實驗使用腦缺血再灌注Wistar大鼠模型，分為無缺血再灌注對照組(Ctrl)，缺血再灌注0.5 h組(I/R-0.5 h)，缺血再灌注4 h組(I/R-4 h)，缺血再灌注24 h組(I/R-24 h)。再灌注時間達到后將腦組織取出，并制成腦組織勻漿液(HOM)，利用差速離心法分離突觸后膜組分(SYN)和突觸外膜組分(EXTRA)，通過Western Blot分析Src蛋白激酶的表達分布及NMDA受體NR2A和NR2B的表達分布。結(jié)果Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注0.5 h后，突觸后膜組分Src蛋白激酶出現(xiàn)超激活狀態(tài)(P<0.01)，NR2A和NR2B在突觸外膜組分中的表達顯著降低(P<0.01)，而NR2A和NR2B在突觸后膜組分中的表達升高(P<0.05)；在再灌注4 h后，Src蛋白激酶激活程度更加明顯(P<0.01)，NR2A和NR2B在突觸外膜組分中的表達仍顯著下降(P<0.05)，但NR2A和NR2B在突觸后膜組分中卻出現(xiàn)不同程度的下降。結(jié)論腦缺血再灌注后神經(jīng)元突觸后膜出現(xiàn)Src蛋白激酶超激活狀態(tài)，并介導NMDA受體NR2A和NR2B的表達分布出現(xiàn)重塑性，NMDA受體從突觸周膜向突觸后膜轉(zhuǎn)移聚集。

缺血再灌注；Src蛋白激酶；NMDA受體；機制

(ChinJLabDiagn,2017,21:1423)

缺血性腦血管病占腦血管疾病80%-85%，在中老年群體中致死率和致殘率很高，隨著國內(nèi)醫(yī)學診療技術(shù)的明顯改善提高，血管搭橋外科手術(shù)治療及血管內(nèi)溶栓治療等技術(shù)的開展，缺血性腦血管病患者得到有效的治療[1]，但患者一旦發(fā)生缺血性腦卒中，由其引起的神經(jīng)功能障礙卻很難完全恢復，究其原因在于腦組織缺血再灌注后神經(jīng)元仍會發(fā)生延遲性死亡，導致臨床上的神經(jīng)功能障礙[2]。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注時Src蛋白激酶介導并強化NMDA受體活性在神經(jīng)元延遲性死亡中發(fā)揮重要作用[3]，但其中的機制仍不清楚。本實驗主要探討腦缺血再灌注后神經(jīng)元突觸后膜NMDA受體發(fā)生重塑性的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

成年雄性Wistar大鼠、呼吸機、麻醉機、顯微手術(shù)器械均來自美國Charles River實驗室，電泳儀、超聲儀、蛋白濃度測定試劑盒來自美國Bio-rad公司，抗Src-P(Y416)抗體、抗Src-P(Y527)抗體、抗NR2A抗體、抗NR2B抗體、anti-rabbit二抗均來自美國Calbiochem公司，顯影液來自美國Kodak公司。

1.2 制作大鼠腦缺血模型手術(shù)方法

Wistar大鼠實施麻醉后，分離尾動脈，并從尾動脈注射0.05 ml(150 IU/kg)肝素，然后分離雙側(cè)頸總動脈、分離右下肢股動脈，回抽血液至Wistar大鼠血壓降50 mmHg時，以動脈瘤夾夾閉雙側(cè)頸總動脈。至此，大鼠出現(xiàn)全腦缺血，控制缺血時間為10 min。缺血結(jié)束后，將抽出的血液回輸，縫合手術(shù)切口。

1.3 實驗分組及腦組織的分離方法

根據(jù)再灌注時間將實驗分為無缺血再灌注對照組(Ctrl)，缺血再灌注0.5 h組(I/R-0.5 h)，缺血再灌注4 h組(I/R-4 h)，缺血再灌注24 h組(I/R-24 h)。大鼠缺血再灌注到達時間點后將大鼠再次麻醉、氣管插管，以3%的異氟烷濃度維持麻醉；切開頭頂部皮膚，在切口中放置試管，將液氮反復灌注到試管中，使大鼠在活體麻醉狀態(tài)下極速冷凍腦組織；隨后將腦組織完整鑿出，放置于液氮中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 差速離心法

在液氮環(huán)境快速分離出丘腦背外側(cè)皮層腦組織，按照重量比1∶10加入勻漿緩沖液，勻漿器抽壓35次，制成腦組織勻漿液(Homogenate,HOM)，隨后在4℃ 條件下10 000 g離心10 min，去除上清，向沉淀部分中加入10倍體積的勻漿緩沖液，超聲擊打三次，每次5秒，然后在4℃ 條件下18 000 g離心20 min，沉淀部分即突觸后膜組分(Synaptic membrane fraction,SYN)，上清部分為突觸外膜組分(Extrasynaptic membrane fraction,EXTRA)。

1.5 Western blot檢測

神經(jīng)元組分總蛋白提取采用RIPA裂解液進行，總蛋白應用BCA法檢測蛋白濃度，水浴5 min，常規(guī)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，4℃下封閉過夜，室溫TBST洗滌3次，一抗2 h， TBST洗滌3次，二抗孵育2 h后漂洗，應用二氨基聯(lián)苯胺進行顯色。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件和Graphpad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為有差異統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血再灌注后神經(jīng)元Src蛋白激酶表達分布腦 組織勻漿后，將HOM采用差速離心的方法分離成SYN組分和EXTRA組分，Western Blot結(jié)果顯示同對照組比較，在SYN組分中，Src-P(Y416)的表達在I/R-0.5 h組中顯著增高(P<0.01)，I/R-4 h組達到高峰(P<0.01)，在I/R-24 h組出現(xiàn)下降趨勢；在EXTRA組分中，Src-P(Y416)也是在I/R-0.5 h組顯著增高(P<0.05)，其后逐步下降。相反，Src-P(Y527)在SYN組分中的表達在I/R-0.5 h組中顯著下降(P<0.01)。由于Y416增強Src蛋白激酶活性，Y527抑制Src蛋白激酶活性；因此，這些結(jié)果提示，腦缺血再灌注后突觸后膜Src蛋白激酶呈超激活狀態(tài)。見圖1。

2.2 腦缺血再灌注后神經(jīng)元NMDA受體表達分布 Western Blot分析NMDA受體亞基NR2A和NR2B的表達分布，結(jié)果顯示I/R-0.5 h組NR2A在EXTRA組分中的表達顯著降低(P<0.01)，隨后I/R-4 h組和I/R-24 h組NR2A表達也出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；與NR2A相似，NR2B的表達分布在EXTRA中顯著降低(P<0.01)；而在SYN組分中，NR2A和NR2B的表達分布在I/R-0.5 h組出現(xiàn)升高(P<0.05)，而在I/R-4 h組及I/R-24 h組中NR2A和NR2B卻出現(xiàn)不同程度的表達下降，其中I/R-4 h組NR2B表達下降具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，以上結(jié)果提示腦缺血再灌注后NMDA受體從突觸周膜向突觸后膜轉(zhuǎn)移聚集。見圖2。

3 討論

腦缺血卒中患者經(jīng)治療后缺血腦組織再灌注出現(xiàn)神經(jīng)元延遲性死亡并嚴重影響生活質(zhì)量及生命安全，其內(nèi)在的分子機制仍不明確。NMDA屬于谷氨酸離子型受體，是介導神經(jīng)毒性最主要的受體[4]。NMDA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與突觸后膜興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸介導的突觸后信號傳遞，而NMDA受體過度或持續(xù)激活可導致的細胞內(nèi)Ca2+超載，所產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒作用，可引發(fā)缺血性腦損傷、中風、癲癇等病理狀態(tài)下神經(jīng)元死亡[5]。因此，NMDA受體一方面參與神經(jīng)元正常生理功能，另一方面在非正常生理狀態(tài)下又可引起神經(jīng)元病理死亡，具有正反兩面雙重角色[6,7]。

圖1 腦缺血再灌注后神經(jīng)元Src蛋白激酶表達分布(**P<0.01，*P<0.05)

圖2 腦缺血再灌注后神經(jīng)元NMDA受體亞基NR2A和NR2B的表達分布(**P<0.01，*P<0.05)

新近研究認為：NMDA受體群在突觸間隙部位的激活，可引起與神經(jīng)生理活動相關(guān)的正常信號，而NMDA受體群在突觸周膜的激活則可介導細胞死亡的病理信號[8]。Src屬于酪氨酸蛋白激酶，是感知受體激活并向胞內(nèi)傳遞信號的核心蛋白激酶，參與神經(jīng)元的多方面生理活動，如增殖、分裂、存活及突觸可行性等[9]。由Src蛋白激酶介導的受體磷酸化可調(diào)節(jié)突觸后膜NMDA受體群的動態(tài)平衡和突觸間隙后膜上受體數(shù)量和組成成分，從而參與突觸可塑性變化[10]。但Src蛋白激酶介導調(diào)節(jié)NMDA受體活性及受體群重塑在神經(jīng)元延遲性死亡中發(fā)揮作用機制目前仍不清楚。

在本實驗中，我們采取大鼠雙側(cè)頸總動脈夾閉合并股動脈抽血降血壓法造成大鼠全腦缺血的動物模型，并采用差速離心法分離神經(jīng)元突觸的不同組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血再灌注0.5 h及4 h后在突觸后膜組分中Src蛋白激酶表達明顯升高，處于超激活狀態(tài)，而在NMDA受體調(diào)節(jié)亞基NR2A和NR2B的表達分布研究發(fā)現(xiàn)在突觸外膜組分中缺血再灌注0.5 h、4 h、24 h后NMDA受體表達明顯下降，在突觸后膜組分中缺血再灌注0.5 h后NMDA受體表達明顯升高，說明腦缺血再灌注后NMDA受體從突觸周膜向突觸后膜轉(zhuǎn)移聚集，此外本實驗發(fā)現(xiàn)突觸后膜組分中缺血再灌注4 h和24 h后NMDA受體表達沒有繼續(xù)升高反而出現(xiàn)下降趨勢，我們考慮在NMDA受體激活后NR2A和NR2B作為受體調(diào)節(jié)亞基與功能亞基NR1形成二或三異聚體，并成為谷氨酸的結(jié)合位點發(fā)揮功能，在此過程中NR2A和NR2B蛋白可能發(fā)生結(jié)構(gòu)域的變化，因而Western Blot分析結(jié)果出現(xiàn)下降趨勢。

總之，本實驗結(jié)果提示：腦缺血再灌注后神經(jīng)元突觸后膜NMDA受體發(fā)生遷移重塑的機制，與神經(jīng)元突觸后膜Src蛋白激酶首先超激活狀態(tài)并可介導NMDA受體重塑性，即NMDA受體從突觸周膜向突觸后膜遷移聚集有關(guān)。

[1]權(quán) 哲,宋 薇,韋 博,等.纖維蛋白膠介導大鼠內(nèi)皮祖細胞移植干預大鼠急性腦缺血的實驗研究[J].中國實驗診斷學,2017,21(1):145.

[2]李培培,彭俊陽,姚建華.頸動脈狹窄與腦梗死發(fā)生的相關(guān)性分析及干預措施[J].中國實驗診斷學,2016,20(4): 691.

[3]Kaur A,Kaur T,Singh B,et al.Curcumin alleviates ischemia reperfusion-induced acute kidney injury through NMDA receptor antagonism in rats[J].Ren Fail,2016,38(9): 1462.

[4]Suzuki Y,Takagi Y,Nakamuro R,et al.Ability of NMDA and nonnmda receptor antagonists to inhibit cerebral ischemia damage in rats[J].Bain Res,2003,964:116.

[5]Hardingham GE,Bading H.Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signaling: implications for neurodegenerative disorders[J].Nat Rev Neurosci,2010,11(10):682.

[6]Singh AP,Singh N,Bedi PM.Pioglitazone ameliorates renal ischemia reperfusion injury through NMDA receptor antagonism in rats [J].Mol Cell Biochem,2016,417(1-2):111.

[7]Mao XW,Pan CS,Huang P,et al.Levo-tetrahydropalmatine attenuates mouse blood-brain barrier injury induced by focal cerebralischemia and reperfusion: Involvement ofSrckinase[J].Sci Rep,2015,5:11155.

[8]Chittajallu R,Wester JC,Craig MT,et al.Afferent specific role ofNMDAreceptors for the circuit integration of hippocampal neurogliaform cells[J].Nat Commun,2017,8(1):152.

[9]Jiang X,Mu D,Biran V,et al.Activated Src kinases interact with the N-methyl- D-aspartate receptor after neonatal brain ischemia[J].Ann Neurol,2008,63(5):632.

[10]Scanlon DP,Bah A,Krzeminski M,et al.An evolutionary switch in ND2 enablesSrckinase regulation ofNMDAreceptors [J]Nat Commun,2017,8:15220.

ThemechanismstudyonpostsynapticNMDAreceptorremoldabilityaftercerebralischemiareperfusion

ZHOUHai-xia,LIZhao-hui,ZHAOJing-wei.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of neuronspostsynaptic NMDA receptorremoldability after cerebral ischemia reperfusion.MethodsIn this study,Wistar rats with global cerebral ischemia-reperfusion model divided into is the normal group (Ctrl),ischemia-reperfusion 0.5 h group (I/R-0.5 h),ischemia-reperfusion 4 h group (I/R-4 h) and ischemia-reperfusion 24 h group (I/R-24 h).After arriving reperfusion,the brain tissue is removed and the homogenization buffer (HOM) was prepared.Synaptic membrane fraction (SYN) and Extrasynaptic membrane fraction (EXTRA) are separated by differential centrifugation.Expression distribution of Src protein kinase and expression distribution of NMDA receptor NR2A and NR2B are analyzed by Western Blot.ResultsWestern Blot analysis results indicate that the Src protein kinase appeared hyperactive in the SYN after ischemia-reperfusion 0.5 h (P<0.01),meanwhile the expression of NR2A and NR2B is decreased significantly in EXTRA (P<0.01) and increased in SYN (P<0.05).After ischemia-reperfusion 4 h,the Src protein kinase activation degree more obvious (P<0.01),and the expression of NR2A and NR2B in EXTRA are still decreased significantly (P<0.05),but NR2A and NR2B in SYN reduced at different degrees.ConclusionAfter cerebral ischemia reperfusion,Src protein kinase super activated state in post synaptic membrane of neurons mediating theremoldability of NMDA receptor NR2A and NR2B expression distribution，the NMDA receptor is gathered from Extrasynaptic membrane to Synaptic membrane.

Ischemia reperfusion;Src protein kinase;NMDA receptor;Mechanism

吉林省科學技術(shù)廳青年科研基金項目(20140520015JH)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1423-04

R743

：A

2016-10-17)