李亞平，吳 瑤，張娟娟，張麗超，蘇 靜*

(1.吉林省人民醫(yī)院 皮膚科，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，吉林 長春130021)

S1通過調(diào)節(jié)糖代謝途徑抑制黑色素瘤B16細胞生長作用的體內(nèi)外研究

李亞平1，吳 瑤2，張娟娟2，張麗超2，蘇 靜2*

(1.吉林省人民醫(yī)院 皮膚科，吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)系，吉林 長春130021)

目的通過體內(nèi)外實驗研究探討B(tài)H3-only模擬物S1抑制小鼠黑色素瘤B16細胞生長的機制。方法體外實驗分為對照組、S1組(5 μmol/L)，MTT法檢測細胞存活率；Hoechst 33342染色法檢測細胞核形態(tài)變化；生化試劑盒檢測細胞葡萄糖消耗量及乳酸生成量。體內(nèi)實驗將B16細胞種植于BALB/C小鼠腋下，14天后腹腔注射S1(0.6 mg/kg)，隔天給藥，共計28天。實驗分為對照組、S1組。免疫組化法檢測移植瘤糖代謝相關(guān)蛋白HK2、PKM2的表達變化。結(jié)果與對照組相比，S1組B16細胞生存率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；凋亡核明顯增多；葡萄糖攝取減少，乳酸分泌減少。與對照組相比，S1組移植瘤中HK2、PKM2蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論S1在體內(nèi)和體外均可抑制小鼠黑色素瘤B16細胞生長，可能是通過抑制葡萄糖代謝誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抑瘤作用。

黑色素瘤；細胞凋亡；葡萄糖代謝

(ChinJLabDiagn,2017,21:1411)

黑色素瘤作為常見的皮膚惡性腫瘤，由于缺乏有效的臨床治療藥物，患者五年生存率極低[1,2]。腫瘤細胞具有異于正常組織細胞的代謝模式，因此糖代謝通路已成為抗腫瘤治療的新靶點[3]。BH3-only蛋白模擬物S1是大連理工大學(xué)精細化工國家重點實驗室自主設(shè)計的針對Bcl-2家族抗凋亡蛋白的靶向藥物，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)其可通過影響線粒體功能在多種腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤效果[4,5]。腫瘤細胞異常的糖代謝模式與其線粒體生物學(xué)特性改變密切相關(guān)，但S1是否通過影響糖代謝發(fā)揮抑瘤作用尚不清楚。因此，我們以小鼠黑色素瘤B16細胞為研究對象，以期通過體外、體內(nèi)實驗研究進一步深入探討S1抗腫瘤作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

B16細胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系保存，10%FBS+IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。BALB/C 小鼠購自吉林大學(xué)動物實驗中心；S1 由大連理工大學(xué)精細化工國家重點實驗室設(shè)計并提供；葡萄糖檢測試劑盒、乳酸含量檢測試劑盒購于南京建成公司；anti-PKM2 抗體、anti-HK2抗體購自美國Santa Cruz公司；羊抗鼠 IgG-HRP 和羊抗兔IgG-HRP 購自碧云天公司。

1.2 MTT法檢測細胞生存率

B16細胞以5×103/孔接種于96孔板中，細胞貼壁狀態(tài)良好，細胞融合度50%-60%時，加入S1(5 μmol/L )分別作用24 h、48 h后每孔加入10 μl MTT(10 μmol/L)，孵育4-6 h后，棄液后加入DMSO溶解甲臜顆粒， 多功能酶標(biāo)儀490 nm檢測各孔吸光度值。(處理組OD值平均值/對照組OD值平均值)×100%=細胞存活率。

1.3 Hoechst 33342染色法觀察B16細胞的核形態(tài)

B16細胞以2×104/孔接種于24孔板中，細胞融合度50%-60%時，加入S1(5 μmol/L)作用24 h。PBS輕輕沖洗3遍，3 min/次；多聚甲醛200 μl/孔固定細胞15 mim；PBS沖洗3次；Hoechst染料(0.5 μg/ml)200 μl/孔，作用時間5 min；PBS沖洗；熒光顯微鏡下觀察、記錄。

1.4 培養(yǎng)液中葡萄糖含量檢測

利用葡萄糖檢測試劑盒。收集對照組、S1處理組培養(yǎng)液上清，對細胞進行計數(shù)。培養(yǎng)液中葡萄糖濃度檢測工作液的配制:按試劑一(R1)：試劑二(R2)按照 1∶1 的比例進行配制，配好后 4℃保存。操作流程見表1。37℃孵育10分鐘，檢測505 nm波長處的吸光度值。葡萄糖濃度=校準(zhǔn)液濃度×(樣本吸光度值-空白吸光度值)/(校準(zhǔn)吸光度值-空白吸光度值)。

表1 培養(yǎng)液中葡萄糖濃度檢測工作液的配制

1.5 培養(yǎng)液中乳酸含量檢測

利用乳酸含量檢測試劑盒。分別加入樣本、酶工作液、顯色劑；漩渦混勻，37℃孵育10分鐘；加入終止劑終止反應(yīng)；檢測530 nm波長處的吸光度值。乳酸濃度=校準(zhǔn)液濃度×(樣本吸光度值-空白吸光度值)/(校準(zhǔn)吸光度值-空白吸光度值)。

1.6 小鼠黑色素瘤B16細胞皮下移植瘤模型的建立

將對數(shù)生長期的B16細胞按1×107個細胞/小鼠注入腋下，共10只。隨機分為2組，每組5只。對照組腹腔注射生理鹽水，治療組腹腔S1 0.6 mg/kg。28天后麻醉處死小鼠，手術(shù)切除腫瘤組織。

1.7 免疫組化染色

按試劑盒說明書操作。免疫組化染色以出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性,染色強度分為0-3級，陰性為0，弱陽性為1，中度陽性為2，強陽性為3；陽性細胞率分為三級：無陽性細胞為0；1%-10%為1；11%-50%為2；51%以上為3；兩者之和即為某蛋白表達的免疫組化評分。

2 結(jié)果

2.1 S1對小鼠黑色素瘤移植瘤生長的影響

對照組和S1處理組瘤重分別為(5.36±0.49) g和(3.41±0.37) g，兩者相比，有顯著性差異(P<0.05)。提示S1對小鼠黑色素B16移植瘤的生長有抑制作用。

2.2 MTT法檢測S1對小鼠黑色素B16細胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示，同對照組(100%)相比，S1分別處理24 h、48 h后，B16細胞生存率明顯降低，24 h為(58.4±4.5)%，48 h為(24.6±3.7)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 Hoechst 染色法觀察S1對B16細胞核形態(tài)的影響

Hoechst 33342染色法結(jié)果見圖1，S1作用24 h， B16細胞核固縮、核碎裂、核染色增強明顯增多。提示S1可能促進B16細胞凋亡。

圖1Hoechst33342染色觀察細胞核，對照組(左)，S1處理組(右)。Bar：100μm；箭頭：部分形態(tài)發(fā)生變化的細胞核

2.4S1對B16細胞葡萄糖攝取和乳酸分泌的影響

結(jié)果顯示同對照組相比，S1(5 μM)處理組能夠抑制B16細胞葡萄糖攝取和乳酸分泌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示S1可能抑制B16葡萄糖代謝途徑。見圖2。

2.5 S1對糖代謝相關(guān)蛋白HK2、PKM2的表達水平的影響

免疫組織化學(xué)法檢測對照組和S1治療組移植瘤組織內(nèi)糖代謝相關(guān)蛋白HK2、PKM2表達的影響。結(jié)果顯示，同對照組相比，S1處理組糖代謝相關(guān)蛋白HK2、PKM2表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 檢測S1作用24h對B16細胞葡萄糖消耗(左)、乳酸生成(右)的影響

圖3 免疫組化檢測移植瘤組織HK2、PKM2蛋白表達(200×)

3 討論

黑色素瘤惡性度高，發(fā)病機制不清。易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差。亟待尋求新的黑色素瘤治療靶點和治療策略[6]。本研究中以小鼠黑色素B16細胞以及其移植瘤為研究對象，探討S1對抗腫瘤作用及其機制[10]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，S1能夠明顯抑制體內(nèi)B16移植瘤生長以及體外實驗中B16細胞生存率，細胞核染色結(jié)果顯示S1能夠引起B(yǎng)16細胞核固縮、核碎裂，提示S1能夠誘導(dǎo)B16細胞凋亡。

腫瘤細胞同正常細胞相比，存在代謝異常。在有氧條件下，腫瘤細胞依然通過糖酵解產(chǎn)生能量，既瓦伯格效應(yīng)(Warburg effect)。近年研究表明有氧糖酵解能夠通過在很多方面促進腫瘤細胞增殖[7,8]。此外已有以葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glut)、己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)等諸多糖代謝關(guān)鍵酶為靶點進行腫瘤細胞治療研究策略[9-11]。我們在研究中發(fā)現(xiàn)S1能夠使黑色素B16細胞葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)量下降，提示S1能夠抑制B16細胞葡萄糖代謝。在移植瘤免疫組化實驗中我們觀察到同對照組相比，應(yīng)用S1治療組使得葡萄糖代謝關(guān)鍵酶HK2、PKM2蛋白表達下降，己糖激酶是糖酵解途徑中第一個反應(yīng)的限速酶,在多種人腫瘤組織中表達升高,HK2與線粒體外膜結(jié)合后可促進Warburg效應(yīng),并可能抑制線粒體誘導(dǎo)的細胞凋亡來促使腫瘤生長[12]。丙酮酸激酶M2型(PKM2)催化上游底物磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸；以兩種形式存在:一種為有活性的四聚體，一種是活性較弱的二聚體形式。在腫瘤細胞中多以二聚體的形式存在，在葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸后抑制其進入線粒體功能，轉(zhuǎn)向參與生物合成過程[13,14]。我們的研究表明葡萄糖代謝可能是S1誘導(dǎo)B16細胞凋亡以及抑制腫瘤生長作用靶點之一。

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S1inhibitthegrowthofmelanomaB16cellsbyregulatingglucosemetabolismpathwayinvitroandvivo

LIYa-ping,WUYao,ZHANGJuan-juan,etal.

(People’sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of BH3-only mimetic S1 in the inhibition of melanoma B16 cells growth.MethodsIn vitro,the experiment was divided into control group and S1 group (5 μmol / L),MTT assay was used to detect cell viability.Hoechst 33342 staining method was used to detect the morphology changes of the nucleus.The biochemical kit was used to detect glucose consumption and lactic acid production.In vivo experiments,B16 cells were implanted in BALB/C mice,The mice were treated with S1 (0.6 mg / kg) for 14 days and killed after 28 days.The expression of HK2 and PKM2 were detected by immunohistochemistry.ResultsCompared with the control group,the cell viability of B16 cells in S1 group was significantly lower than the control group (P<0.05).The apoptotic nuclei of B16 cells in S1 group were significantly increased; the glucose uptake and lactate secretion of B16 cells in S1 group decreased.Compared with the control group,the expression of HK2 and PKM2 protein in S1 group was significantly lower (P<0.05).ConclusionS1 can inhibit the growth of melanoma B16 cells in vivo and in vitro,and may be related to the inhibition of glucose metabolism.

melanoma; apoptosis; glucose metabolism

國家自然科學(xué)基金面上項目(81472419,81272876)

*通訊作者

1007-4287(2017)09-1411-04

R739.5

：A

2017-04-17)