張由芹，王 穎，朱明珠，王集會(huì)

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355 )

發(fā)酵天龍粉中總多糖的含量測(cè)定方法研究

張由芹1，王 穎1，朱明珠1，王集會(huì)2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東濟(jì)南250355 )

[目的] ：創(chuàng)建發(fā)酵天龍粉中多糖含量測(cè)定方法。[方法]：發(fā)酵天龍粉中的多糖的提取采用超聲水提取的方法，發(fā)酵天龍粉多糖的含量的測(cè)定采用紫外分光光度法。[結(jié)果] ： 測(cè)得發(fā)酵天龍粉中多糖含量為13.4628 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(RSD)為4.19%(n=5)[結(jié)論]： 發(fā)酵天龍粉多糖的含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，不僅操作簡(jiǎn)單，而且準(zhǔn)確度高，可用來(lái)測(cè)定天龍粉中多糖的含量。

發(fā)酵天龍粉；總多糖；含量測(cè)定；超聲水提取法；紫外分光光度法

壁虎科蹼趾壁虎(Gekko Chinensis Groy),或同屬它科壁虎的干燥體，亦名守宮、天龍，廣東地區(qū)又稱其為"鹽蛇"。江、浙、皖等省均有產(chǎn)。味咸，性寒，有小毒。入心、肝二經(jīng)[1]。具有祛風(fēng)定驚、止咳平喘、解毒散結(jié)、通絡(luò)止痛等功效，臨床常用于非小細(xì)胞肺癌、肝癌、胃腸道癌等惡性腫瘤的治療，療效確切[2]。多糖(polysaccharides,PS)是由10個(gè)以上的單糖聚合而成的生物高分子，多糖包含均多糖(homosaccharide)和雜多糖(heterosaccharide),前者是由同一單糖組成，后者則是兩種以上不同的單糖組成[3]。近年來(lái)，針對(duì)中藥多糖的藥理活性研究成為熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)中藥多糖具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗應(yīng)激、抗輻射及抗衰老等多種生物活性，對(duì)促進(jìn)機(jī)體特異性免疫與非特異性免疫都有廣泛的影響[4]。糖的定量、定性測(cè)定是糖研究的一個(gè)重要基礎(chǔ)工作[5]。目前，國(guó)內(nèi)植物多糖的提取較多，對(duì)于蟲類中多糖的提取和含量的測(cè)定的報(bào)道較少，為此，筆者通過超聲水提取的方法進(jìn)行提取，紫外分光光度計(jì)法測(cè)定其含量，效率較高，成本低，這為今后蟲類中總多糖的研究具有一定的意義。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；LDZ4-0.8型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海梅香儀器有限公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；UV9100B型可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)。

1.2 試劑

吐溫-80、化學(xué)對(duì)照品蘆丁( 中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司)、苯酚、濃硫酸、 D-無(wú)水葡萄糖為分析純，所用水為重蒸水。

1.3 藥材

天龍購(gòu)自安徽亳州，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系高德民老師鑒定為無(wú)蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther。發(fā)酵天龍粉，批號(hào)20150801，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。白僵菌孢子粉(100億/g,山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所自篩菌株——桃5)。

2 方法與結(jié)果

2.1 發(fā)酵天龍粉的制備

稱取(精確稱量)定量干燥的天龍粉，然后取1.00 g白僵菌孢子粉，加入少量定量的吐溫-80，用滅菌水稀釋成為每毫升含1×108個(gè)孢子的混懸液，取其適量，然后拌勻潤(rùn)濕，在25～28 ℃，濕度為95 %的條件下，恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵8天左右，待長(zhǎng)滿菌絲后停止發(fā)酵。

2.2 發(fā)酵天龍粉中總多糖供試品溶液的制備

取發(fā)酵天龍粉約0.5 g，精密稱定，置于50 mL燒杯中，按料液比1:30加入15 mL蒸餾水，超聲提取10 min,抽濾，保留殘?jiān)步崛?。將抽濾后的上清液合并，定容至50 mL，即為測(cè)總多糖的供試品溶液。

2.3 總多糖含量的測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.00 mg，放置在燒杯中，加適量水溶解，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度線，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL葡萄糖溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0,1,1.5,2,2.5,3 mL分別置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，分別量取2 mL置15 mL具塞試管中，然后再精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5mL，充分搖勻，放置1 0min，然后置于40℃水浴中保溫15 min，取出,冷卻至室溫。搖勻后，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各樣品吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性回歸方程為：Y=15.06X+0.004,r=0.9990，范圍為 0～0.03 mg/mL 。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精確吸取已制備好的測(cè)總多糖的樣品液2 mL于 10mL容量瓶中，定容，重復(fù)取樣5次，每次2 mL，用紫外可見分光光度法在波長(zhǎng) 510 nm下連續(xù)5次測(cè)定吸光值，吸光度分別為0.4268 、0.4292 、0.4286、0.4282、0.4297，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=0.26%(n=5)，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確吸取已制備好的測(cè)總多糖的樣品液2 mL于10 mL容量瓶中，定容， 每次取稀釋好的的試樣液2 mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在2、4、6、8、10 h的吸光值，吸光度分別為0.4192 、0.3893 、0.4178 、0.3835 和0.3892結(jié)果在10 h多糖含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=4.31%(n=5)，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性較好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵天龍粉樣品5份,每份約0.5 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取和制備溶液,重復(fù)測(cè)定5次，分別用紫外可見分光光度測(cè)定吸光值。吸光度分別為0.4064、0.4297、0.4285、0.4028和0.4282，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=3.16%(n=5)，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已測(cè)知總多糖含量的發(fā)酵天龍粉樣品5份,每份約0.5 g,各加入8.00 mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品,按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取和制備溶液, 分別用紫外可見分光光度測(cè)定吸光值，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為98.95% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差RSD=2.33%。結(jié)果表明該方法符合回收率在95%～105%的要求。

2.3.7 樣品測(cè)定

精密量取已經(jīng)制備好的測(cè)總多糖的樣品液2 mL于 10mL容量瓶中，定容后，量取2mL置于具塞試管中，按照“2.3.2”項(xiàng)下方法在490 nm 處測(cè)定吸光度，通過回歸方程計(jì)算總多糖的濃度，然后總多糖的含量，結(jié)果見表1。

3 討論

(1)多糖為天然產(chǎn)物，來(lái)源廣泛，具有毒副作用小、無(wú)殘留、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，因而備受研究者重視[4]。多糖廣泛存在于自然界中，是多種中藥的有效成分之一，而且具有很多生物活性, 多糖類藥物的研制已成為當(dāng)今世界新藥的發(fā)展方向之一[6]。發(fā)酵天龍粉中多糖的含量明顯高于未發(fā)酵天龍中多糖的含量[7]，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量，實(shí)驗(yàn)過程中，影響紫外吸收的因素有很多，待測(cè)物質(zhì)有混懸顆粒、待測(cè)溶液中有干擾的吸收物質(zhì)等，需要排除影響因素。采用分光光度法測(cè)定多糖的含量精密度、穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性都符合實(shí)驗(yàn)要求，可以用來(lái)測(cè)定發(fā)酵天龍粉中總多糖的含量。

表1 發(fā)酵天龍粉中總多糖的含量

(2)將中藥天龍粉作為固體培養(yǎng)基，球孢白僵菌作為發(fā)酵藥用真菌，采用固體發(fā)酵炮制方法所產(chǎn)生的發(fā)酵天龍粉，是傳統(tǒng)中藥炮制技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)的完美結(jié)合。對(duì)蟲類中的原有物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，增強(qiáng)其攻毒散結(jié)的作用。但是蟲類中藥的發(fā)酵炮制制藥目前的研究報(bào)道并不多見，應(yīng)該引起人們的足夠重視[8]。天龍的治療疾病作用顯著，其中所含有的多糖成分又是其中發(fā)揮作用的重要組成部分，因此對(duì)總多糖對(duì)其提取以及含量的測(cè)定具有積極的作用，對(duì)于臨床用藥具有一定的促進(jìn)作用。

[1] 朱良春. 蟲類藥的臨床應(yīng)用——守宮[J]. 江蘇醫(yī)藥, 1977(8) ：20-22.

[2] 劉玉軍,李 剛,馬 睿,等.天龍抗腫瘤研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2011, 17(7):262-264.

[3] 徐曉飛,陳 健.多糖含量測(cè)定的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2009, 30(21):443-448.

[4] 郭浩杰, 楊嚴(yán)格,安 樂,等. 中藥多糖的分子修飾及其藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2015, 46(7):1074-1080.

[5] 李計(jì)萍. 中藥新藥研究中多糖含量測(cè)定方法探討[J].中國(guó)中藥雜志,2014(17):3392-3394.

[6] 田庚元,馮宇澄,林穎. 植物多糖的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志, 1995 , 20 (7) :441-444.

[7] 王 穎,馬明珠,王立娜,等. 發(fā)酵前后天龍粉水溶性活性物質(zhì)含量對(duì)比研究[J]. 湖南中醫(yī)雜志,2016(09):166-168.

[8] 王 穎,王立娜,劉春雨,等. 發(fā)酵天龍粉中總黃酮含量測(cè)定方法研究[J]. 山東化工,2017,46(02):64-65,67.

(本文文獻(xiàn)格式：張由芹，王穎，朱明珠，等.發(fā)酵天龍粉中總多糖的含量測(cè)定方法研究[J].山東化工，2017，46(16)：87，94.)

Study on the Determination Method of Total Polysaccharides Content in the Fermented Gekko Powders

Zhang Youqin1, Wang Ying1,Zhu Mingzhu1, Wang Jihui2

(1. The pharmacy college , Shandong University of Traditional Chinese Medicine,jinan 250355,China;2.The experiment center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine ,Jinan 250355,China)

Objective: To establish the method for determining the contents of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders. Methods: Total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders were extracted by ultrasonic water extraction. UV-VIS spectrophotometry was adopted to determine the content of total polysaccharides.Results:The polysaccharides contents of the fermented Gekko powders was 13.4628mg/g,RSD was 4.19%(n=5).Conclusion: The determination of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders use the UV-VIS spectrophotometry , the method is simple and accurate. So the method can be used to determine the content of total polysaccharides in the ferrmented Gekko Powders.

fermentation of Gekko powders; total polysaccharides; content determination;ultrasonic water extraction;UV-VIS spectrophotometry

R284

：A

：1008-021X(2017)16-0087-01

2017-06-01

山東中醫(yī)大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2016055)

張由芹(1995—)，女，山東沂水人，本科在讀，研究方向：制藥工程;通訊作者：王集會(huì)(1962—)，副教授，研究方向：蟲類中藥發(fā)酵及活性成分研究。