張 炫， 唐道邦， 程鏡蓉， 張友勝， 張業(yè)輝， 劉學銘*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州510610；2.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌330045）

響應面優(yōu)化超高壓提取雞血血紅蛋白的工藝

張 炫1，2， 唐道邦1， 程鏡蓉1， 張友勝1， 張業(yè)輝1， 劉學銘*1

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部功能食品重點實驗室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州510610；2.江西農(nóng)業(yè)大學 生物科學與工程學院，江西 南昌330045）

在單因素的基礎上，以Hb得率為響應值，應用響應面法優(yōu)化Hb的提取條件；通過高速均質(zhì)機處理Hb溶液評價超高壓對Hb特性中乳化性和起泡性的作用。結果表明：料液質(zhì)量體積比、提取時間及超高壓對Hb得率的影響是極顯著的；其最佳工藝參數(shù)：料液質(zhì)量體積比為1 g∶250 mL、提取時間為5.4 min、超高壓135 MPa。在上述條件下，Hb得率為6.697 g/dL，與模型值基本一致。經(jīng)超高壓處理，Hb的乳化性有明顯的提高，乳化穩(wěn)定性則下降，而起泡性和泡沫穩(wěn)定性有顯著的增強。

超高壓；料液比；響應面；乳化性；起泡性

雞血含大量的蛋白質(zhì)和豐富的氨基酸以及微量元素、維生素、酶類和其他一些生物活性物質(zhì)[1]。雞血營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，尤其是Hb。它是一種大分子物質(zhì)，其相對分子質(zhì)量約68 000，具有四級結構，由4個亞基組成，每個亞基是具有三級結構的多肽鏈，并含有一個血紅素和一個氧結合部位[2]。近年來Hb開發(fā)利用一直是關注的熱點問題，其廣泛應用于食品工業(yè)、醫(yī)療保健、飼料工業(yè)等領域。目前許多研究者利用生物酶水解Hb并從中分離出具有ACE抑制肽[3]、抗氧化肽[4]、抗菌肽[5]等具有生物活性的小肽分子，因此大規(guī)模提取Hb并將Hb資源高值化利用具有現(xiàn)實的經(jīng)濟效益。

目前，動物血中Hb的提取方法主要包括有機溶劑提取法、兩相萃取法、超濾法、乙酸鋅沉淀提取法、超聲波輔助超純水提取法等，這些方法普遍存在提取速度慢，投入高，安全性低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。路秀玲等[6]探索了將膨脹床吸附層析提取動物血中的Hb，該方法設備要求高、過程復雜。如周玲[7]以及赫玉蘭[8]等利用超聲波提取Hb，雖然提取率高、投入低，但是作用時間長。迄今為止沒有看到利用超高壓輔助超純水提取Hb的報道。

超高壓（UHP）亦稱高靜水壓（High Hydrostatic Pressure，HHP），利用液體（油或者水）作為壓力傳導介質(zhì)對樣品進行加壓（100～1 000 MPa）處理，引起食品中某些大分子物質(zhì)的離子鍵、氫鍵、疏水作用等非共價鍵的破壞或形成，使酶鈍化、蛋白質(zhì)改性、淀粉糊化，并殺死食品中的病毒、細菌、霉菌等微生物，從而達到食品保藏加工的目的[9]。趙謀明等[10]利用均質(zhì)機在60 MPa壓力下破碎紅細胞，使Hb溶出冷凍備用。作者利用超高壓作用于吸水的紅細胞使其加速漲破快速釋放出Hb這一技術，通過響應面（Response Surface Methodology，簡稱RSM）優(yōu)化其提取工藝，為大規(guī)模工業(yè)化提取Hb提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和主要試劑

新鮮雞血，購自燕嶺農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝路線 工藝路線如下所示。

1.2.2 技術要點

1）抗凝 向新鮮雞血中添加5 g/L的檸檬酸三鈉，取血時搖晃混勻即可；

2）離心 將含抗凝劑的雞血在4℃、12 000 r/ min離心20 min，棄上清液得血漿和紅細胞沉淀；

3）洗滌 用生理鹽水洗滌沉淀，去除沉淀中的小分子蛋白質(zhì)以及游離氨基酸等可溶性物質(zhì)，反復洗滌3次；

4）超高壓處理 按照下述單因素試驗的要求加適量的超純水，分別在低速均質(zhì)機中混勻1 min，裝入鋁箔袋封口，靜置5 min，分別用不同的超高壓處理；

5）二次離心 將處理樣品在4℃、8 000 r/min離心20 min，棄沉淀得上清液；

6）取樣 吸取處理樣品的上清液1 mL，按等濃度梯度稀釋100倍，備用；

7）冷凍干燥 將處理樣品的上清液冷凍，置真空冷凍干燥機中干燥稱重，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3 單因子試驗

1）料液質(zhì)量體積比的確定 取添加了抗凝劑的新鮮雞血100 mL離心，獲得血漿沉淀，生理鹽水洗滌，得血漿沉淀質(zhì)量與超純水體積比稱之為料液質(zhì)量體積比。在超高壓100 MPa、25℃、pH值為7條件下，分別對不同的料液質(zhì)量體積比處理5 min，考察不同的料液質(zhì)量體積比對快速提取Hb的影響。

2）提取時間的確定 在超高壓100 MPa、溫度為25℃、pH值為7的條件下，對料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL的樣品分別處理5、10、15、20 min，考察不同的提取時間對快速提取Hb的影響。

3）超高壓壓力的確定 在25℃、pH值為7條件下，對料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL的樣品分別采用100、150、200、250、300、400 MPa超高壓處理5 min，考察不同超高壓壓力對Hb得率的影響。

4）pH的確定 在超高壓100 MPa、溫度為25℃的條件下，對料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL的樣品分別處理5 min中，考察pH（4、5、6、7、8、9）對快速提取Hb的影響。

5）最適溫度的確定 在超高壓100 MPa、對料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL的樣品分別處理5 min中，pH值為7，考察不同的溫度（5、10、15、20、25、30、35℃）對快速提取Hb的影響。

1.2.4 響應面的設計 根據(jù)上述單因素的結果，得出影響Hb得率的最主要的條件，采用BOXBehnken試驗設計和響應面分析料液比、提取時間、超高壓對提取Hb的影響。

1.3 分析測定

1.3.1 Hb的測定 對上述經(jīng)過不同條件處理的樣品進行離心的上清液，將上清液稀釋100倍，使溶液中的Hb質(zhì)量濃度在3.6～200 mg/L范圍內(nèi)，取稀釋液0.15 mL與顯色劑混勻，37℃保溫20 min，510nm測吸光值；用Hb標準稀釋也將Hb標準液稀釋成不同的濃度：20、40、60、80、100、120、160、200 mg/ L，用紫外分光光度計測定OD值，繪制標準曲線如下圖1所示。

1.3.2 Hb乳化性及其穩(wěn)定性的測定 在測試管中分別加入15 mL 0.1 g/dL Hb溶液（pH 7.2～7.5）和5mL玉米油，乳液經(jīng)高速均質(zhì)機（20 000 r/min）處理1 min后，從測試管底部取出50 μL乳液，用0.1 g/ dL的SDS稀釋100倍后，于500 nm比色。乳化性指數(shù)（EAI，m2/g）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI，min）的計算公式如下[11]：

圖1 微量游離血紅蛋白（FHb）標準曲線Fig.1 Standard curve of trace free hemoglobin（FHb）

式中，DF為稀釋因子，DF=100；ρ為蛋白質(zhì)量濃度，g/mL；?為光程，?=0.01 m；θ為油相所占分數(shù)，θ= 0.25；A0、A10分別為0 min和10 min是的吸光度。

1.3.3 Hb起泡性及其穩(wěn)定性的測定 將2 g Hb溶于300 mL水中，置于500 mL量筒（口徑6 cm，高為20 cm），使用高速乳化均質(zhì)機以一定的轉(zhuǎn)速均質(zhì)40s，連續(xù)3次共計2 min，記錄均質(zhì)后液面高度記為V0，靜置30 min后記錄液面高度，記為V30min[12]。

起泡能力（Foaming capacity）的計算公式如下：

泡沫穩(wěn)定性（Foaming stability）的計算式如下：

2 結果與討論

2.1 不同料液質(zhì)量體積比對提取Hb的影響

如下圖2所示，在25℃經(jīng)過100 MPa處理5min后，料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL時，此時獲得的Hb達到最大值，此后料液質(zhì)量體積比值越小，Hb的得率增加不明顯，反而其上清液干重有增加的趨勢。這說明當料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL時，此時血漿中的紅細胞恰好能跟超純水全面接觸，使紅細胞在100 MPa的作用下迅速吸水漲破，釋放Hb。此后因為100 mL雞血中紅細胞數(shù)量的限制，隨著超純水的增加，對Hb的得率沒有影響。有文獻表明，蛋白質(zhì)的四級結構對壓力最為敏感，50～300 MPa的壓力能導致大多數(shù)寡聚蛋白質(zhì)解聚[13]。而上清液物質(zhì)干質(zhì)量的增加可能是因為在超高壓的作用下，一些蛋白質(zhì)解聚或疏水基團暴露出來，增加其溶解性[14]。

2.2 不同提取時間對提取Hb的影響

如下圖3所示，經(jīng)過100 MPa處理料液質(zhì)量體積比為1 g∶200 mL的樣品時，處理5 min時Hb得率已達到最大值；隨著提取時間的延長，Hb的得率并沒有增加，而上清液物質(zhì)干重有增加趨勢。這說明在此條件下，樣品處理5 min時，紅細胞已經(jīng)完全破碎，Hb被釋放出來，其得率并不會隨著時間的延長而增加。超高壓處理會使大分子蛋白子解聚成亞基單元，使暴露極性基團增多，疏水作用增強，從而提高其溶解性[15]。黃群[16]等人利用超高壓處理S-卵白蛋白，發(fā)現(xiàn)其結構有明顯的變化，S-卵白蛋白的溶解性等功能特性也隨壓力增加而明顯改善。然而干物質(zhì)量的增加可能是因為100 MPa長時間的作用下，改變某些物質(zhì)的結構使其溶解，導致干質(zhì)量增加。

圖2 不同料液質(zhì)量體積比對快速提取Hb的影響Fig.2 Affects of different solid-liquid ratio on rapid extraction Hb

圖3 不同提取時間對快速提取Hb的影響Fig.3 Effects of different extraction time on rapid extraction Hb

2.3 不同超高壓壓力處理對Hb得率的影響

如下圖4所示，在不同的超高壓處理料液質(zhì)量體積比1 g∶200 mL的樣品5 min，超高壓壓力為150 MPa時Hb得率最高，隨后隨著超高壓的增加，Hb的得率迅速降低，但是上清液物質(zhì)的質(zhì)量濃度一直在增加。這說明在100～150 Mpa壓力對Hb的分子結構影響不大，當超過150 MPa時，過高的壓力會使Hb分子的四級結構解聚成4個亞基，亞基的結構也發(fā)生變化，三級結構中血紅素卟啉環(huán)中的Fe2+的兩個配位鍵被破壞，致使Hb得率隨著壓力的升高而減少。然而由于血漿含有各種纖維蛋白、球蛋白和白蛋白等蛋白質(zhì)，壓力升高的同時會破壞它們的非共價鍵、離子鍵以及氫鍵等，引起蛋白質(zhì)解聚、暴露疏水基和分子結構伸張，增加它們的溶解性，因而使得上清液的質(zhì)量濃度隨著壓力的增加而顯著升高[17]。

圖4 不同壓力處理對Hb得率的影響Fig.4 Effects of different Ultra-high pressure on the yield of Hb

2.4 不同pH對Hb得率的影響

如下圖5所示，在其他條件不變的情況下，通過改變料液比的pH值，Hb的得率無明顯變化，上清液物質(zhì)的干重也無明顯的變化趨勢。研究表明，低的pH值使紅細胞膜通透性增加，利于吸水，高的pH可使紅細胞體積減小，而pH在7.4左右時紅細胞更接近于球形。pH值的不同會使紅細胞的形態(tài)、大小及膜的特性發(fā)生變化[18]。出現(xiàn)這種原因的可能是pH作用的時間較短，來不及改變細胞的形態(tài)紅細胞就已經(jīng)吸水漲破。因此，不選用pH值作為后續(xù)響應面考察的因素。

2.5 不同溫度處理對Hb得率的影響

下圖6所示，在其他條件不變的情況下，Hb得率和上清液的干重隨著溫度的升高逐漸增加，直至30℃時，其得率增加趨于平緩。這是因為熱脹冷縮的原理，紅細胞隨著溫度的升高更容易吸水漲破。雖然30℃Hb得率稍微比25℃多，但是超高壓在處理的過程中隨著保壓時間的延長會伴隨著溫度的升高，且血液在30℃時更容易滋生細菌，導致腐敗發(fā)臭。因此選用25℃比較合理，沒有必要對其進行優(yōu)化。

2.6 響應面優(yōu)化試驗

圖5 不同pH處理對Hb得率的影響Fig.5 Effects of different pH on the yield of Hb

圖6 不同處理溫度對Hb得率的影響Fig.6 Effects of different tempreture on the yield of Hb

表1 因素水平編碼表Table 1 Coding table of factors and levels

表2 BOX-Behnken試驗設計與結果Table 2 BOX-Behnken design matrix and extraction results of programme

2.6.1 BOX-Behnken試驗結果 根據(jù)上述單因素實驗結果，確定3個重要影響因素，分別記為變量X1、X2、X3，響應面試驗因子及水平見表1，設立了17個處理組，響應面試驗設計方案表1及其結果表2。

2.6.2 模型的建立與顯著性檢驗 利用 Design Expert8.0軟件對BOX-Behnken試驗結果進行多元回歸擬合分析，獲得自變量與Hb得率的回歸方程：Y=6.70+0.38A+0.34B-0.23C-0.31AB-0.065AC-0.36BC-0.34A2-0.76B2-0.57C2，由表3可知，模型的P值＜0.000 1，且失擬項P=0.102 4＞0.05不顯著，說明此模型回歸顯著；復相關系數(shù)R2=0.986 8，表明此模型的擬合程度較高，模型的校正系數(shù)R2Adj=0.9699，說明不利因素對本實驗結果的影響極小，實驗誤差小，可以用此模型分析和預測超高壓輔助提取Hb的工藝結果[19]。對該模型進行顯著性分析，結果如表3所示，由P值可知影響超高壓提取Hb的主次因素A＞B＞C，即料液比＞提取時間＞超高壓。模型中的一次項A、B、C以及交互項AB和BC對Hb得率的影響都是極其顯著的（P＜0.01），交互項AC對Hb得率的影響是不顯著的。

2.6.3 模型驗證試驗 在獲得回歸非線性模型和響應面之后，對此模型方程求一階偏導并使其等于0，可以得到曲面的最大值。求解次方程組得到最大Hb得率的最佳最佳工藝條件為：A=1 g∶250 mL，B= 5.38 min，C=135.34 MPa，Hb得率的預測值為6.863g/dL。應用響應面法得到最優(yōu)值后，在料液質(zhì)量體積比為1 g∶250 mL、提取時間為5.4 min、超高壓135 MPa試驗條件下進行驗證試驗，試驗3次，測定Hb得率的平均值為6.697 g/dL，實驗值與模型值相差0.166 g/dL，說明該模型能較好地預測實際Hb提取情況。

2.7 超高壓處理后Hb的有關特性分析

2.7.1 超高壓處理后對Hb乳化活性及其穩(wěn)定性的影響 未經(jīng)超高壓處理的對照組，其乳化活性比處理過的乳化活性低；而其穩(wěn)定性正好相反。這是因為經(jīng)超高壓處理后Hb暴露出更多的疏水基團，其親水親油發(fā)生改變導致乳化活性增強；但是隨著時間的延長，疏水基團發(fā)生凝聚導致其乳化穩(wěn)定性反而下降。

2.7.2 超高壓處理后對Hb起泡性及其穩(wěn)定性的影響 經(jīng)超高壓處理的Hb的起泡性及其穩(wěn)定性比對照組有明顯的提高。這可能的原因是超高壓力提高壓縮Hb分子，破壞其非共價鍵，蛋白質(zhì)解聚，分子結構伸展，液體變得更加粘稠，亞基之間的相互凝聚形成較小的氣泡，發(fā)泡能力增強，亞基之間的相互作用有利于泡沫的穩(wěn)定性。

表3 DH響應面結果的方差分析Table 3 ANOVA of RSM for DH

3 結語

通過單因素試驗從料液質(zhì)量體積比、提取時間、超高壓、pH值和溫度5個因素中選出影響Hb得率最主要的因素及最佳水平，利用BOX-Behnken試驗設計，應用響應面法優(yōu)化超高壓提取Hb的工藝參數(shù)。且經(jīng)超高壓處理后Hb的乳化性有明顯的提高，起泡能力和泡沫穩(wěn)定性有顯著的增強。與傳統(tǒng)的丙酮等[20]有機試劑提取相比較，利用超高壓提取Hb無試劑污染、提取時間短、Hb得率較高等特點，為進一步工業(yè)化提取提供數(shù)據(jù)的支持。

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中國毒理學會第八次全國毒理學大會

所屬學科：病毒與免疫學,醫(yī)學免疫學

開始日期：2017-10-15 結束日期：2017-10-18

所在城市：山東省 濟南市 具體地點：山東大廈會議中心

主辦單位：中國毒理學會 承辦單位：山東省醫(yī)學科學院、山東省毒理學會

聯(lián)系人：孔祥穎 聯(lián)系電話：010-66932387,010-68187038

E-MAIL：cst@chntox.org 會議網(wǎng)站：http://223.4.55.186:8088/chntoxWeb/cnaCN/index.asp?exhId=9

會議背景介紹：中國毒理學會第八次全國毒理學大會 （CSOT-VIII）暨第七屆全國會員代表大會將于2017年10月15-18日在山東省濟南市山東大廈會議中心召開。大會由中國毒理學會主辦，山東省醫(yī)學科學院和山東省毒理學會承辦。中國毒理學會是中國科學技術協(xié)會所屬國家一級學會，是國際毒理學聯(lián)合會（IUTOX）成員和亞洲毒理學會（ASITOX）創(chuàng)始成員。目前已有25個專業(yè)委員會，注冊會員達1萬5千余名。全國毒理學大會是中國毒理學領域最高層次學術盛會，已先后召開了7次，即1993年（第1次，北京）、1997年（第2次，西安）、2001年（第3次，南京）、2005年（第4次，沈陽）、2009年（第5次，貴陽）、2013年（第6次，廣州）、2015年（第7次，武漢）。這些會議，對于推動我國毒理學的發(fā)展與交流起到了十分重要的作用。2017年第八次全國毒理學大會將又是我國毒理學科技界的一次盛會。大會將邀請國內(nèi)、外知名專家學者就毒理學領域的最新研究進展、前沿理論與技術發(fā)展做大會報告。熱誠歡迎我國毒理學和相關領域的專家、學者、科技和教育工作者、管理人員、研究生以及相關企業(yè)工程技術人員等踴躍投稿、積極參加會議、展示學術成果。大會期間，將召開中國毒理學會全國代表大會，換屆選舉第七屆中國毒理學會理事會，產(chǎn)生新一屆領導機構。此外，大會期間還將舉辦與毒理學發(fā)展相關科技產(chǎn)品、試劑、儀器等科技展覽，歡迎生物、醫(yī)藥科技企業(yè)、廠家等參展。

Process Optimization of the Ultra-High Pressure Extraction of Hemoglobin from Chicken Blood by Response Surface Methodology

ZHANG Xuan1，2， TANG Daobang1， CHENG Jingrong1，ZHANG Yousheng1， ZHANG Yehui1， LIU Xueming*1
(1.Sericultural and Agri-Food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Food of Ministry of Agriculture/Key Laboratory of Agricultural Product Processing of Guangdong Province，Guangzhou 510610，China；2.College of Bio-Engineering，Jiangxi Agricultrural，Nanchang 330045，China）

This study was under taken to exploring the optimal process for ultra-high pressure extraction of chicken blood hemoglobin（Hb）and demonstrating the key process properties.To accomplish this，response surface analysis methodology（RSM）was used for optimizing ultra-high pressure extraction of Hb with Hb rate as the response.In the meanwhile，the role of ultra-high pressure in improving Hb functional properties by high speed homogenization，such as emulsifying properties and foaming capacity，were also revealed.Results showed that the technical parameters，including liquid ratio，extraction time and ultra-high pressure presented significant impact on Hb yield.The optimal extraction conditions were 1 g∶250 mL solid-liquid ratio，135 MPa for 5.4 min. Under these conditions，the yield of Hb was 6.697 g/dL.With ultra-high pressure treated，theemulsifying property of Hb was obviously improved while its emulsion stability decreased；both the foaming capacity and foaming stability presented enhanced trends.

ultra-high pressure，liquid ratio，response surface，emulsion，foaming capacity

S 873

：A

：1673—1689（2017）07—0743—07

2015-08-25

廣東省科技計劃項目（2014A020208046）；廣東省促進科技服務業(yè)發(fā)展計劃項目（2013B040400009）。

*通信作者：劉學銘（1967—），男，江西興國人，工學博士，研究員，主要從事畜禽水產(chǎn)加工研究。E-mail：xuemingliu@21cn.com

張炫，唐道邦，程鏡蓉，等.響應面優(yōu)化超高壓提取雞血血紅蛋白的工藝[J].食品與生物技術學報，2017，36（07）：743-749.