李萬玉， 晏子俊，2， 孫立力， 萬 坤， 羅見春， 張景勍*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2.攀枝花市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，四川 攀枝花 617067）

姜黃素固體脂質(zhì)納米粒在大鼠體腸中吸收的研究

李萬玉1， 晏子俊1，2， 孫立力1， 萬 坤1， 羅見春1， 張景勍*1

（1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥物高校工程研究中心，重慶 400016；2.攀枝花市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，四川 攀枝花 617067）

采用乳化-超聲法制得姜黃素固體脂質(zhì)納米粒 （Curcumin solid lipid nanoparticles，CNSLN），比較游離藥姜黃素（Curcumin，CRM）和CNSLN的在體腸中吸收情況。選用大鼠在體單向腸灌流模型 （Single-pass intestinal perfusion model，SPIP），以紫外分光光度法測定游離CRM和CNSLN通過腸液后CRM的減少量來確定藥物的吸收。結(jié)果：透射電鏡下觀察到CNSLN成圓形或橢圓形，平均粒徑為（120.7±5.4）nm，平均Zeta電位為（-41.90±1.81）mV，平均包封率為（91.12±0.42）%。游離CRM和CNSLN在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸4段的吸收速率常數(shù)（Ka）、有效滲透率（Peff）和百分吸收率（W）均存在顯著性差異（P＜0.01），CNSLN比游離CRM均提高了2倍以上，且CNSLN的最大吸收部位在結(jié)腸。在體腸吸收結(jié)果顯示，CNSLN的腸吸收比游離CRM高，CNSLN能明顯的提高大鼠對游離CRM的腸吸收。

姜黃素；固體脂質(zhì)納米粒；在體單向腸灌流模型；腸吸收

姜黃素（Curcumin，CRM）是我國傳統(tǒng)中藥材姜科植物姜黃的有效成分[1]。研究表明CRM有抗腫瘤、抗氧化、降低膽固醇、抑菌、抗炎和保護心肌等多種藥理作用。但研究中發(fā)現(xiàn)CRM存在不易溶于水、抗腫瘤活性低、口服生物利用度較低和代謝過快等缺點，限制了其臨床應(yīng)用[2-3]。

近來，Ghadiri等[4]和Suresh等[5]報道的固體脂質(zhì)納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）作為新型的藥物載體，其結(jié)合了納米乳[6]和脂質(zhì)體的優(yōu)點。Ghadiri等將SLN作為親水性藥物的載體，增加了親水性藥物的穩(wěn)定性；Suresh等將SLN作為洛伐他汀的載體，并由其體內(nèi)外研究結(jié)果可知，SLN可增加洛伐他汀體外的親水性、穩(wěn)定性、延長洛伐他汀在體內(nèi)的生物半衰期和提高洛伐他汀的生物利用度。因此，SLN具有增加載帶藥物的親水性、穩(wěn)定性、延長生物半衰期、提高生物利用度和定位釋藥等特點。

作者依據(jù)上述思路，以SLN為CRM的載體，制備得到姜黃素固體脂質(zhì)納米粒（Curcumin solid lipid nanoparticles，CNSLN），以增加CRM的水溶性，提高CRM的吸收率和生物利用度。作者選用在體單向腸灌流模型 （Single-pass intestinal perfusion model，SPIP），研究比較游離CRM和CNSLN在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料、試劑 CRM：西安帥諾生物科技有限公司產(chǎn)品；CNSLN制劑：作者所在實驗室自制，批號：130527，130529。

1.1.2 主要儀器與動物 AB 205電子分析天平：瑞士Mettler Toledo儀器科技有限公司產(chǎn)品；UVVIS 3160型紫外-可見分光光度計：日本島津 （中國）有限公司產(chǎn)品；H-7700型透射電子顯微鏡：日本日立科技公司產(chǎn)品；ZS90納米粒度電位儀：英國馬爾文（中國）公司產(chǎn)品；88-2型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器制造有限公司產(chǎn)品；KB 2300 A型超聲波清洗器：北京超聲儀器制造有限公司產(chǎn)品。

健康雄性清潔級SD大鼠：體重250±20 g，試驗前未使用過其他藥物，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-（渝）2014-0001。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

1）Krebs-Ringer營養(yǎng)液的配制 1 000 mL蒸餾水中含KH2PO40.16 g，CaCl20.35 g，NaHCO32.1g，KCl 0.35 g，NaCl 6.92 g，MgSO4·7H2O 0.29 g，右旋葡萄糖2.0 g，即得Krebs-Ringer營養(yǎng)液。

2）生理鹽水的配制 質(zhì)量分數(shù)0.9%的生理鹽水溶液。

3）CRM溶液的配制 精密稱取適量CRM，加入棕色容量瓶內(nèi)，無水乙醇定容，即得CRM溶液。

4）CNSLN溶液的配制 精密量取適量CNSLN，超聲（8 min），移至棕色容量瓶，無水乙醇定容，搖勻，即得CNSLN溶液。

5）空白固體脂質(zhì)納米粒溶液（KNSLN）的配制按CNSLN溶液的配制方法配制。

1.2.2 透射電鏡的測定 吸取CNSLN適量，用適量蒸餾水稀釋后，于透射電鏡下觀察CNSLN的形態(tài)。

1.2.3 粒徑和Zeta電位的測定 吸取CNSLN適量，用適量蒸餾水稀釋后，于粒徑電位儀下測定CNSLN平均粒徑和Zeta電位。

1.2.4 含量測定方法建立

1）檢測波長的確定 將配制好的KNSLN溶液、CNSLN溶液和CRM溶液，以無水乙醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描。

2）標準曲線的制備 精密稱取CRM 10.5 mg，加于100 mL棕色容量瓶內(nèi)，無水乙醇溶解后，定容，搖勻，即得0.105 mg/mL的CRM對照品溶液。精密量取 CRM對照品溶液 100，200，300，400，500，600，700 μL于10 mL棕色量瓶中，加無水乙醇稀釋，定容，搖勻，即得1.05、2.10、3.15、4.20、5.25、6.30、7.35 μg/mL的系列標準溶液。無水乙醇為空白對照，分別于432 nm處測定吸光度，以吸光度（A）對濃度（C）進行線性回歸。

3）精密度的測定 分別配制低、中、高3種質(zhì)量濃度（1.05、2.10、3.15 μg/mL）的對照品溶液，每個質(zhì)量濃度取5份，于一日內(nèi)測定5次，計算3種質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度；同樣條件下，連續(xù)測定5 d，計算3種濃度的日間精密度。

4）回收率的測定 分別配制低、中、高3種質(zhì)量濃度（1.05、2.10、3.15 μg/mL）的CRM對照品溶液各5份。分別在432 nm處測定吸光度后，計算出回收率。

1.2.5 包封率的測定 參照文獻[7]的方法測定CNSLN的包封率。

式中：XA為CNSLN中CRM的質(zhì)量；XB為CNSLN中CRM的投藥總質(zhì)量。

1.2.6 腸吸收

1）大鼠在體腸吸收 SD雄性大鼠，禁食12 h后，腹腔注射體積分數(shù)3%水合氯醛，麻醉后固定，沿腹中線剪開腹腔，在十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸兩端插管，用生理鹽水脫脂棉覆蓋保濕傷口，用紅外燈進行保溫，先用37℃生理鹽水灌洗腸內(nèi)容物，空氣排空腸內(nèi)生理鹽水。再用37℃恒溫的Krebs-Ringer液以0.4 mL/min流速循環(huán)15 min，平衡后將其排空。最后將4段進口分別放入裝有水浴恒溫至37℃的15 mL游離CRM循環(huán)液或CNSLN中，各出口處分別用25 mL的容量瓶接收流出液體，60 min后用Krebs-Ringer液洗滌各腸段內(nèi)殘留藥液，將灌流后流出液、沖洗液和剩余灌流液合并后，用營養(yǎng)液定容，實驗結(jié)束后處死大鼠，剪下各腸段，測量其腸段內(nèi)徑（r）與長度（L）[8-10]。

2）數(shù)據(jù)處理 根據(jù)以下公式計算藥物有效滲透率（Peff）、吸收速率常數(shù)（Ka）和吸收百分率（W）。計算公式如下：

式中：T為灌注時間 （min）；V為灌注藥物體積（mL）；X0為0時藥物量（μg）；Xt為灌流液中剩余藥物量（μg）；Q為流速（mL/min）；Xout和 Xin分別為流出和流入的藥物量 （μg）；L和r分別為灌流腸段的內(nèi)徑和長度。數(shù)據(jù)以Excel 2010軟件進行單因素方差分析[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡下的形態(tài)

CNSLN在透射電鏡下觀察到的形態(tài)見圖1，所制得的CNSLN在電鏡下為呈圓形或橢圓形。

2.2 粒徑和Zeta電位

馬爾文激光粒度電位儀測得CNSLN平均粒徑為（120.7±5.4）nm，Zeta電位為（-41.90±1.81）mV。

2.3 測定方法

2.3.1 檢測波長的確定 紫外吸收光譜顯示，CRM的最大吸收波長為432 nm，且432 nm波長處時，KNSLN沒有吸收。說明，可用紫外分光光度法測定腸液中的CRM，檢測波長為432 nm。

圖1 CNSLN的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopy image of CNSLN under TEM

2.3.2 標準曲線和線性范圍 在1.05～7.35 μg/mL范圍內(nèi)，CRM的吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=0.132 0X+0.031 0，r=0.999 3。

2.3.3 精密度的測定 低 （1.05 μg/mL）、中（2.10μg/mL）、高（3.15 μg/mL）3種質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD（n=5）值分別為0.69%、1.02%、0.95%；低（1.05 μg/mL）、中（2.10 μg/mL）、高（3.15 μg/mL）3種質(zhì)量濃度的日間精密度RSD（n=5）值分別為0.89%、0.64%、0.97%。表明該測定方法的日內(nèi)精密度及日間精密度良好，均符合測定要求。

2.3.4 回收率的測定 低 （1.05 μg/mL）、中（2.10μg/mL）、高（3.15 μg/mL）3種質(zhì)量濃度測定的平均回收率（n=5）分別為98．18%、100.27%、99.29%，RSD分別為0．54%、0．39%、0.78%。

2.4 包封率的測定

用excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果用均數(shù)±標準差表示。經(jīng)計算，CNSLN的平均包封率為（91.12±0.42）%（n=3）。

2.5 在體腸吸收結(jié)果

游離藥CRM和制劑CNSLN在各被考察腸段內(nèi)的吸收速率常數(shù)（Ka），如圖2所示；有效滲透率（Peff），如圖3所示；吸收百分率W（%）如圖4所示。

圖2 CRM以及CNSLN的吸收速率常數(shù)（Ka）（±s，n=6）Fig.2 Intestinal absorption rate constant（Ka）of CRM、CNSLN（±s，n=6）

圖3 CRM以及CNSLN的有效滲透率（Peff）（±s，n=6）Fig.3 Effective permeability（Peff）of CRM、CNSLN（±s，n=6）

圖4 CRM以及CNSLN的吸收百分率W（%）（±s，n=6）Fig.4 Intestinal absorption percentage W （%）of CRM、CNSLN（±s，n=6）

由圖3-5可知，CNSLN的Ka、Peff大小順序為：結(jié)腸＞十二指腸＞空腸＞回腸，與Ka、Peff相比，W（%）在回腸和空腸部位有所的不同，其順序為：回腸＞空腸；CRM的Ka、Peff大小順序為：十二指腸＞結(jié)腸＞空腸＞回腸，而W（%）則為：十二指腸＞空腸＞回腸＞結(jié)腸，以上結(jié)果說明CNSLN的最大吸收部位在結(jié)腸，CRM則在十二指腸。由圖3～5也可知，CNSLN與CRM在十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的Ka、Peff、W（%）均存在顯著性差異（P＜0.01），且CNSLN均為CRM的2倍以上?？梢?，CNSLN能明顯的提高CRM在大鼠小腸的吸收。

3 結(jié)語

CRM（C21H20O6）是分子質(zhì)量小且略帶酸性的黃色多酚類化合物，其水溶性和口服吸收均較差，使CRM不能很好發(fā)揮藥理活性[12]。選用乳化-超聲法制備得到的CNSLN[13-14]，其采用單硬脂酸甘油酯和卵磷脂為載體，將CRM包裹于類脂核中，使CNSLN結(jié)合了納米乳和脂質(zhì)體的優(yōu)點，而CNSLN可增加CRM在腸部的吸收，原因可能主要有：CRM須經(jīng)過黏膜細胞才可被小腸吸收，而SLN的結(jié)構(gòu)與黏膜細胞的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)較相似，擾亂了脂質(zhì)雙分子層的正常排列，從而增加并提高了CRM通透性和吸收率[15]；表面張力較低的微乳容易透過腸壁的水化層，使載帶的CRM能直接接觸腸道上皮細胞，從而增加了CRM的吸收[16]。

由于灌流方式的差異，常見的在體腸灌流模型方法，可以分為：在體循環(huán)灌流、在體振動灌流和SPIP等。SPIP的實驗條件與口服藥物后的腸環(huán)境較相似，具有穩(wěn)定的吸收速率和很好的相關(guān)性。因此，國外現(xiàn)已多采用SPIP，且SPIP是FDA認同的研究吸收代謝的模型[12]。

作者在此基礎(chǔ)上選用SPIP，對游離CRM和CNSLN的小腸吸收進行研究比較，并采用紫外分光光度法測定樣品中CRM的含量，此法重現(xiàn)性好，簡便易行，結(jié)果準確可靠。游離CRM和CNSLN的Ka、Peff和W進行比較，均表明CNSLN能顯著增加CRM的小腸吸收，與張繼芬等[15]研究的CRM脂質(zhì)體相比較，作者制備的CNSLN在大鼠腸中各段均有很好的吸收，其中結(jié)腸吸收最好?？梢?，SLN較脂質(zhì)體能顯著提高CRM在腸中的吸收，特別是結(jié)腸。而大鼠口服給予本試驗制備的CNSLN后的藥時曲線下面積 （Area under concentration-time curve，AUC0-t）為（798.00±64.44）μg·h·L-1，藥時曲線下總面積 （Total area under concentration-time curve，AUC0-∞）為（939.49±114.18）μg·h·L-1，峰濃度（Peak concentration，Cmax）為（93.84±5.66）μg·L-1和達峰時間（Peak time，Tmax）為（0.75±0.00）h，AUC0-t、AUC0-∞、Cmax和 Tmax分別是游離 CRM的 7.34、7.40、1.30和3.00倍[13]。由大鼠口服CNSLN后血藥動力學(xué)數(shù)據(jù)可知，CNSLN能明顯提高CRM在大鼠體內(nèi)的生物利用度[13-14]，CNSLN的大鼠腸吸收情況和藥動學(xué)情況均顯示了SLN作為難溶性藥物給藥載體的優(yōu)越性。

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Intestinal Absorption of Curcumin Solid Lipid Nanoparticles in Rats

LI Wanyu1， YAN Zijun1，2， SUN Lili1， WAN Kun1， LUO Jianchun1， ZHANG Jingqing*1
(1.Engineering Research Center in University，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2. Pharmacy of Panzhihua Central Hospital，Panzhihua 617067，China）

To prepare the curcumin solid lipid nanoparticles（CNSLN）with emulsion-ultrasonic and compare the intestinal absorption of free curcumin （CRM）and CNSLN.Single-pass intestinal perfusion（SPIP）model was used to study the intestinal absorption and Ultraviolet spectrometric assay was used to determine the content of CRM.The CNSLN presented as small round or oval under transmission electron microscope（TEM）with the diameter of about（120.7±5.4）nm，zeta potential was（-41.90±1.81）mV，average entrapment efficiency was（91.12±0.42）%.The absorption rate constant（Ka），effective permeability（Peff），percent absorption rate W（%）of CRM and CNSLN in duodenum，jejunum，ileum and colon both were significant difference（P＜0.01），and CNSLN was more than 2 times as much as CRM.The maximum segments of CNSLN absorption was colon.The results indicated that the absorption of CNSLN in rats is better than CRM，and CNSLN could obviously enhance the absorption of CRM in rats.

curcumin，solid lipid nanoparticles，SPIP，intestinal absorption

R 91

：A

：1673—1689（2017）07—0733—05

2015-06-23

重慶市科委重點項目（CSTC2012JJB10027）。

李萬玉（1960—），女，重慶人，副教授，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。E-mail：627332357@qq.com

*通信作者：張景勍（1973—），女，重慶人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。E-mail：zjqrae01@163.com

李萬玉，晏子俊，孫立力，等.姜黃素固體脂質(zhì)納米粒在大鼠體腸中吸收的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（07）：733-737.