邱立朋， 曹 瑩， 朱夢琴， 趙 麗，陳敬華

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

葡聚糖-兩性霉素B的制備及其抑菌活性研究

邱立朋， 曹 瑩， 朱夢琴， 趙 麗，陳敬華*

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

通過高碘酸鈉氧化，合成了3種氧化度的葡聚糖衍生物（D-CHO），并利用D-CHO醛基和兩性霉素B（AmB）氨基的席夫堿反應，制備了水溶性葡聚糖-AmB（D-CHO-AmB）共軛物。多角度激光光散射凝膠色譜儀結(jié)果表明，隨著葡聚糖的相對分子質(zhì)量隨著氧化度的增大而降低。不同D-CHO-AmB的載藥量在18.9%-36.7%之間，且氧化度越高，載藥量越大。D-CHO-AmB的溶血作用比AmB注射劑顯著性降低，且具有較好的抑菌效果。

兩性霉素B；葡聚糖；溶血；抑菌作用

兩性霉素B（Amphotericin B，AmB）是一種優(yōu)良的大環(huán)多烯類抗生素，具有廣譜抗真菌作用，對多種真菌、原生病原菌都有良好的抑制效果，而且不易對菌株產(chǎn)生耐藥性[1-2]。但是AmB的水溶性差，導致它口服利用度較低，限制了其口服給藥的應用[3]。因此，通常改變AmB的劑型來提高它在非腸道給藥時的療效。目前臨床上使用的是用去氧膽酸鈉作為增溶質(zhì)制成的AmB注射劑[4-5]。近年來，AmB脂質(zhì)體等新型制劑的上市，在一定程度上降低了AmB的副反應，提高了療效，但該脂質(zhì)體劑型在人體內(nèi)的消除速率很慢，易在人體內(nèi)積聚[6-7]。多糖具有毒性小、生物可降解等特點，作為藥物載體材料已引起了研究者的重視[8]。其中，葡聚糖來源豐富，其作為載體材料在體內(nèi)具有類似聚乙二醇的 “隱形”特點[9-11]。此外，葡聚糖可以在體內(nèi)被葡聚糖酶降解，具有較好的生物可降解性，因此常作為藥物載體材料使用[12-13]。作者選擇具有良好生物相容性的葡聚糖，合成氧化葡聚糖（D-CHO）后，與AmB鏈接制備水溶性較好的葡聚糖-兩性霉素B（D-CHO-AmB）共軛物，為后續(xù)安全有效的AmB注射劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

兩性霉素B：購于上海生工生物工程股份有限公司；葡聚糖：（相對分子質(zhì)量40 000）、高碘酸鈉（NaIO4）、氫氧化鈉（NaOH）、二甲亞砜（DMSO）和葡萄糖等：國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；蛋白胨、酵母膏提取物：Sigma-Aldrich公司。

AVANCEⅢ型核磁共振儀：瑞士Bruker公司產(chǎn)品；UV-2550型紫外分光光度計：日本島津儀器有限公司產(chǎn)品；FreeZone型冷凍干燥儀： 美國Labconco公司產(chǎn)品；5804R型冷凍高速離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；MALS/GPC型凝膠色譜系統(tǒng)：美國Wyatt公司產(chǎn)品。

試驗菌株：白色念珠菌，作者所在實驗室保存。

1.2 D-CHO的合成及結(jié)構(gòu)確證

制備氧化度 （Oxidation Degree，OD）分別為50%，75%，100%的葡聚糖。稱取一定量的葡聚糖溶于適量去離子水中，加入不同量的高碘酸鈉溶解攪拌，室溫避光反應4 h。得到的溶液去離子水透析3天除去雜質(zhì)，凍干得D-CHO產(chǎn)物，1H-NMR譜確認其結(jié)構(gòu)。如無特別說明，OD值指理論值，得到的產(chǎn)物分別標記為D-CHO50，D-CHO75，D-CHO100。

1.3 D-CHO相對分子質(zhì)量的測定

通過多角度激光光散射凝膠色譜聯(lián)用儀測量3種不同氧化度D-CHO的相對分子質(zhì)量。首先精確配制質(zhì)量濃度梯度為0.5，1，2，3，4，5 mg/mL的葡聚糖樣品，依次進樣測定（dn/dc）值。然后選擇型號分別為Shodex OHpak SB-803和SB-804的兩根色譜柱串聯(lián)連接，0.2 mol/L氯化鈉-質(zhì)量分數(shù)0.01%疊氮鈉溶液為流動相。配制樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL，0.22 μm濾膜過濾后，進樣，采集數(shù)據(jù)，計算相對分子質(zhì)量。

1.4 D-CHO氧化度的測定

稱取0.1 g D-CHO溶解于25 mL鹽酸羥胺溶液中，室溫攪拌6 h。然后用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定。OD值按下列公式計算：

其中，Mw為D-CHO單元平均相對分子質(zhì)量，VNaOH為消耗氫氧化鈉的體積（mL），CNaOH為氫氧化鈉的摩爾濃度（mol/L），m為樣品的質(zhì)量（g）。

1.5 D-CHO-AmB的合成及結(jié)構(gòu)確證

根據(jù)文獻報道[14]，稱取不同氧化度的D-CHO和AmB溶解于25 mL四硼酸鈉緩沖液中，室溫條件下，避光攪拌3 h。反應液去離子水透析3 d，除去雜質(zhì)，凍干得黃色產(chǎn)物，標記為D-CHO50-AmB、DCHO75-AmB、D-CHO100-AmB。

合成產(chǎn)物通過紫外可見吸收光譜的吸收峰情況進行表征。將藥物共軛物、AmB、葡聚糖、D-CHO分別溶于甲醇-水溶液中，用紫外分光光度計進行全波長掃描。

1.6 載藥量的測定

1.6.1 AmB標準曲線的測定 稱取5 mg AmB于100 mL容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容至刻度，得到50 μg/mL的母液。然后量取適量的AmB母液，稀釋成質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 μg/mL系列溶液，用紫外分光光度計在383 nm處測得吸光度，以吸光度值A(chǔ)對濃度C進行線性回歸，得標準曲線。

1.6.2 精密度和回收率 按上述方法配制2、6、10μg/mL的AmB溶液，重復測定5次吸光度計算日內(nèi)精密度，連續(xù)測定5天吸光度計算日間精密度。

取AmB適量，精密稱定，置于10 mL容量瓶內(nèi)，配成2、6、10 μg/mL的溶液，分別測定吸光度，按照標準曲線計算回收率。

1.6.3 載藥量的測定 分別稱取D-CHO50-AmB、D-CHO75-AmB和D-CHO100-AmB溶于甲醇溶液中，配成一定質(zhì)量濃度的溶液后，于383 nm處測量吸光度。根據(jù)AmB標準曲線，計算樣品中AmB的質(zhì)量濃度。

1.7 D-CHO-AmB溶血性考察

取適量健康志愿者血液加入生理鹽水洗滌并配成體積分數(shù)10%的紅細胞混懸液 （Red blood cell，RBC）。分別取2.5 mL D-CHO-AmB樣品溶液后，加入2.5 mL紅細胞懸液，使AmB終質(zhì)量濃度為50、100、250、500和1 000 μg/mL，37℃水浴2 h，3000 r/min離心5 min，收集上清液，用紫外分光光度計于545 nm處測量吸光度，計算樣品溶血性。

按照市售AmB注射劑處方，配制對照組溶液。稱取10 mg AmB和8.2 mg脫氧膽酸鈉溶于40 mL生理鹽水中，加入紅細胞懸液，使AmB終質(zhì)量濃度在5、10、25、50和100 μg/mL之間，其余操作同上。

1.8 D-CHO-AmB抑菌活性評價

1.8.1 最小抑菌濃度 （Minimal inhibitory concentration，MIC） 采用微量基稀釋法檢測抗真菌藥物的敏感性[15]。配制質(zhì)量濃度為1.2～640 μg/mL的DCHO-AmB溶液及0.06-32 μg/mL的AmB溶液，分別取100 μL加入96孔板每排的1～10孔內(nèi)，第11孔加100 μL培養(yǎng)基作為生長對照，第12孔加200 μL培養(yǎng)基作為空白對照。然后，將白色念珠菌懸液100 μL加入每排的1-11孔中，置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，通過視覺法判定MIC值終點，即與生長對照孔比較，菌體生長完全被抑制，培養(yǎng)基清亮孔所對應的藥物濃度為MIC。

1.8.2 抑菌圈實驗 采用管碟法測定D-CHO100-AmB的抑菌活性。將白色念珠菌混懸液與培養(yǎng)基混合后，加注到底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動平板，使其均勻鋪開。將小鋼管均勻放置在雙層培養(yǎng)基上，并加入200 μL不同樣品，35℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。每個平板放3個小鋼管，分別加入AmB終質(zhì)量濃度為2 mg/mL的D-CHO50-AmB溶液和AmB懸浮液，同時加入無菌用水作為空白對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-CHO的合成

高碘酸鈉與葡聚糖按不同摩爾比反應，得到不同氧化度的D-CHO，合成反應原理如圖1。高碘酸根離子進攻葡聚糖單元相鄰的兩個羥基，使C3-C4或者C2-C3間的C-C鍵斷裂，氧化成兩個醛基。C3位的醛基與鄰近的羥基可進一步發(fā)生氧化反應，C3從葡聚糖單元中斷開，形成甲酸。據(jù)Joao等人[16]的報道，C3-C4鍵的斷裂速率大約是C2-C3鍵的7.5倍，因此，C3-C4間的氧化最具代表性。通過DCHO的1H-NMR譜圖（圖2）可以看出，δ 3.46-3.67處葡聚糖環(huán)2，3，4位的H峰消失，而δ 9.22處出現(xiàn)了新的醛基特征峰，這表明D-CHO制備成功。

圖1 葡聚糖氧化示意圖Fig.1 Schematic of dextran oxidation

2.2 D-CHO相對分子質(zhì)量的測定

相對分子質(zhì)量是聚合物的一個重要性質(zhì)，它與聚合物的溶解性、粘度和體內(nèi)清除率等性質(zhì)都密切相關(guān)。作者采用多角度激光光散射凝膠色譜儀測得葡聚糖的（dn/dc）值線性方程為y=0.136 4x+0.000 01（r=0.999 1），線性擬合良好。葡聚糖及其氧化產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布如圖3所示，氧化后的葡聚糖出峰時間延長，即相對分子質(zhì)量變小。由表1看出，與葡聚糖相比，氧化葡聚糖的相對分子質(zhì)量明顯變小，且氧化度越高，相對分子質(zhì)量越小，表明該氧化反應導致葡聚糖的降解。

圖2 葡聚糖和D-CHO的1H-NMR譜圖Fig.21H-NMR spectra of dextran and D-CHO

表1 葡聚糖及其氧化產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量Table 1 Molecular weight of dextran and D-CHO

2.3 D-CHO氧化度的測定

鹽酸羥胺法是測定葡聚糖氧化度的一個經(jīng)典方法，該方法反應迅速，2 h內(nèi)即有80%以上的醛基反應[17]。D-CHO氧化度的測定結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，鹽酸羥胺測得的OD比理論OD低，這可能是被氧化葡聚糖形成的醛基與本身未反應的羥基易發(fā)生半縮醛反應，形成穩(wěn)定的六元環(huán)，阻止醛基與鹽酸羥胺反應，使測得的結(jié)果偏低。

圖3 葡聚糖（a）、D-CHO50（b）、D-CHO75（c）和D-CHO100（d）的相對分子質(zhì)量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution of dextran（a），D-CHO50（b），D-CHO75（c）and D-CHO100（d）

表2 D-CHO的氧化度Table 2 Oxidation degree of D-CHO

2.4 D-CHO-AmB的制備

葡聚糖經(jīng)高碘酸鈉氧化后，開環(huán)得到多聚醛葡聚糖，然后通過席夫堿反應，使AmB的氨基和DCHO的醛基連接形成腙鍵，制備D-CHO-AmB共軛物，并利用紫外可見吸收光譜進行全波長掃描對其進行鑒定，結(jié)果如圖4所示。由圖可以看出，葡聚糖及3種不同氧化度的D-CHO在200～500 nm范圍內(nèi)幾乎沒有吸收。AmB的特征吸收峰分別是363，382，406 nm，制備得到的3種D-CHO-AmB的特征吸收峰與AmB基本相同，分別是363，383，406 nm，表明成功合成了D-CHO-AmB共軛物。3種DCHO-AmB共軛物的掃描圖譜基本相同，表明醛基數(shù)量不影響D-CHO-AmB的結(jié)構(gòu)。然而，D-CHOAmB和AmB的吸收峰略有差異，且峰強度變?yōu)槟嫘?，這可能是由于AmB和D-CHO發(fā)生反應后，其多烯的構(gòu)象變化引起的。Neshi等人的研究也表明，多烯類的紫外吸收光譜很容易受構(gòu)象的改變而發(fā)生改變[18]。

圖4 葡聚糖、D-CHO和D-CHO-AmB的紫外可見光圖譜Fig.4 UV-vis absorption spectra of dextran，D-CHO and D-CHO-AmB conjugates

2.5 載藥量測定

2.5.1 AmB標準曲線的測定 由紫外可見吸收光譜可知，修飾后的AmB特征吸收峰基本不變，因此本實驗選擇383 nm作為最佳吸收波長。以AmB濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，進行線性回歸，繪制標準曲線。線性回歸方程為：A=0.023 1C+ 0.025 4（r=0.999 0），表明AmB在2～10 μg/mL范圍內(nèi)濃度和吸光度呈良好的線性相關(guān)性。

2.5.2 精密度和回收率 AmB低中高3個濃度的精密度和回收率試驗。各個質(zhì)量濃度的精密度RSD值均小于2%，平均回收率在98.0%-102.0%之間，表明本方法的日內(nèi)精密度、日間精密度以及回收率符合方法學要求。

2.5.3 載藥量的測定 通過紫外法測得DCHO50-AmB、D-CHO75-AmB和D-CHO100-AmB的載藥量分別為18.9%、21.8%和36.7%，表明載藥量隨著葡聚糖氧化度的提高而變大。這是由于葡聚糖氧化度越高，可以與AmB反應位點越多，致使鏈接到D-CHO上的藥物越多，載藥量增大。

2.6 D-CHO-AmB溶血性 通過預實驗發(fā)現(xiàn)，DCHO-AmB的溶血性較低，因此，選擇了較高的質(zhì)量濃度與AmB注射劑比較。AmB質(zhì)量濃度在50～1 000 μg/mL范圍內(nèi)，D-CHO-AmB的溶血率變化緩慢，而AmB注射劑中AmB質(zhì)量濃度較低時，溶血率較小，當質(zhì)量濃度超過50 μg/mL時，溶血率迅速增加，具有較為嚴重的溶血作用。因此，AmB經(jīng)葡聚糖修飾后，溶血性顯著降低，安全系數(shù)也明顯高于AmB注射劑。

2.7 D-CHO-AmB抑菌活性評價

2.7.1 MIC的測定 通過微量基稀釋法，測定DCHO-AmB和AmB的最小抑菌濃度，觀察AmB修飾前后的抑菌活性的變化。

葡聚糖修飾AmB后，導致相對分子質(zhì)量增大，MIC值升高。此外，由于3種共軛物的載藥量不同，其MIC值也有所不同。載藥量最小的D-CHO50-AmB的MIC值最大，D-CHO100-AmB的抑菌效果要好于D-CHO75-AmB的。

2.7.2 抑菌圈實驗 通過MIC測定結(jié)果可知，與AmB相比，修飾后的D-CHO-AmB的MIC值增大，即最低抑菌濃度升高。為了驗證相同濃度AmB下，兩者的抑菌效果，作者選擇D-CHO100-AmB觀察抑菌圈效果。D-CHO100-AmB的鋼管外部出現(xiàn)了一個明顯的抑菌圈，而AmB僅圍繞鋼管有一較小的抑菌圈，空白對照則無抑菌圈出現(xiàn)。這表明制備的D-CHO-AmB通過增加AmB的水溶性，達到更好的抑菌效果。因此，改變AmB的疏水性，不僅不會使其抗菌活性喪失，而且增加其水中抗菌活性。這是由于AmB與大分子葡聚糖結(jié)合后，雖然增加了AmB的水溶性，但其抗菌活性中心的疏水性多烯側(cè)鏈結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變，因此發(fā)揮較好的抑菌活性。

3 結(jié)語

AmB通過靜脈滴注治療深部真菌感染的效果較好，但其水溶性差，現(xiàn)有注射劑的不良反應較多，并可造成血栓性靜脈炎。因此，制備AmB新劑型或者提高藥物本身溶解性一直是研究的熱點。作者選擇葡聚糖與AmB通過席夫堿反應制備D-CHOAmB共軛物。由于葡聚糖具有良好的生物適應性及水溶性，因此，D-CHO-AmB可以提高AmB的水溶性，同時不影響藥物作用。氧化度高的D-CHOAmB載藥量達到36.7%，表明該共軛物可以較好地攜載AmB。D-CHO-AmB與AmB注射劑相比，溶血性顯著性降低，溶血臨界濃度提高了10倍，注射安全性大大提高。此外，D-CHO-AmB具有較好的抑菌活性，抑菌圈明顯。以上結(jié)果表明D-CHO-AmB具有良好的應用前景，它不但可以直接制備成注射劑，也可用于脂質(zhì)體等新劑型，這為AmB的臨床應用提供了更多選擇。

[1]HELGA K R，DOLORES R S，MARIA A D，et al.New amphotericin B-gamma cyclodextrin formulation for topical use with synergistic activity against diverse fungal species and Leishmania spp.[J].International Journal of Pharmaceutics，2014，473（1-2）：148-157.

[2]WEN Ye，LIU Hong，TANG Ren，et al.Preparation of amphotericin B magnetoliposomes and quality control[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2007，27（10）：1344-1346.（in Chinese）

[3]YANG Zhuoli，YANG Kewei，LI Xinru，et al.Preparation and in vitro release kinetics of amphotericin B-loaded poly（ethyleneglycol）-poly（dl-lac-tide）block copolymer micelles[J].Chinese Pharmaceutical Journal，2007，42（7）：519-523.（in Chinese）

[4]AFZAL H，ABDUS S，IRAM N，et al.Nanocarrier-based topical drug delivery for an antifungal drug[J].Drug Development and Industrial Pharmacy，2014，40（4）：527-541.

[5]TIAN Qingping，LI Peng，WANG Lei，et al.Preparation of amphotericin B microemulsion and its transdermal absorption[J]. Chinese Pharmaceutical Journal，2009，44（4）：283-287.（in Chinese）

[6]HONGBO Y，PARESH C，ZHENG Y Z，et al.Budget impact analysis of liposomal amphotericin B and amphotericin B lipid complex in the treatment of invasive fungal infections in the United States[J].Apply Health Economic Health Policy，2014，12（1）：85-93.

[7]SERRANO D R，LALATSA A，DEA A M A，et al.Oral particle uptake and organ targeting drives the activity of amphotericin B nanoparticles[J].Molecular Phamaceutics，2015，12（2）：420-431.

[8]LIANG Yan，SONG Jiahong，CHEN Jingxiao，et al.Preparation of heparin/chitosan microcapsule for anticoagulation study[J]. Journal of Food Science and Biotechnology，2015，34（3）：295-301.（in Chinese）

[9]LEMARCHAND C，GREF R，COUVREUR P.Polysaccharide-decorated nanoparticles[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，58（2）：327-341.

[10]LI Y L，ZHU L，LIU Z Z，et al.Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells[J].Angewandte Chemie International Edition，2010，48（52）：9914-9918.

[11]SUN H L，GUO B N，LI X Q，et al.Shell-sheddable micelles based on dextran-ss-poly（ε-caprolactone）diblock copolymer for efficient intracellular release of doxorubicin[J].Biomacrlmolecules，2010，11：848-854.

[12]CAO Lixia，GUO Xiaona，ZHU Kexue，et al.Preparation of buckwheat protein isolate-dextran conjugates[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，33（7）：703-708.（in Chinese）

[13]MEHVAR R.Dextrans for targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents[J].Journal of Controlled Release，2000，69（1）：1-25.

[14]HUDSON S P，LANGER R，F(xiàn)LINK G R，et al.Injectable in situ cross-linking hydrogels for local antifungal therapy[J]. Biomaterials，2010，31（6）：1444-1452.

[15]XU Shengjing，CAO Shuanglin，XIA Jining，et al.Comparison of broth microdilution and agar dilution methods for antifungal susceptibility testing of Malassezia speciesin vitro[J].Chinese Journal of Dermatology，2011，44（10）：704-707.（in Chinese）

[16]MAIA J，CARVALHO R A，COELHO F J，et al.Insight on the periodate oxidation of dextran and its structural vicissitudes[J]. Polymer，2011，52（2）：258-265.

[17]BRUNEEL D，SCHACHT E.Chemical modification of pullulan：1.Periodate oxidation[J].Polymer，1993，34（12）：2628-2632.

[18]NISHI K K，ANTONY M，MOHANAN P V，et al.Amphotericin B-gum arabic conjugates：synthesis，toxicity，bioavailability，and activities against Leishmania and fungi[J].Pharmaceutical Research，2007，24（5）：971-980.

Preparation and Antibacterial Activities of Dextran-Amphotericin B Conjugates

QIU Lipeng， CAO Ying， ZHU Mengqin， ZHAO Li， CHEN Jinghua*
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Three oxidation degree of dextran derivatives（D-CHO）were synthesized with oxidation of sodium periodate.Dextran-amphotericin B （D-CHO-AmB）conjugate was prepared by Schiff's base reaction between aldehyde groups of D-CHO and amino groups of AmB.MALS/GPC results indicated that the molecular weight of dextran was reduced with the increase of oxidation degree. The drug loadings of D-CHO-AmB were 18.9%to 36.7%，which increased with the oxidation degree.Compared with AmB injection，the hemolytic effect of D-CHO-AmB was decreased significantly and the critical concentration of hemolysis was almost tenfold.The inhibition zone test proved that D-CHO-AmB conjugates had an excellent antifungal effect.

amphotericin B，dextran，hemolysis，inhibition effect

R 978

：A

：1673—1689（2017）07—0692—06

2015-07-13

國家自然科學基金項目（21574059）；國家自然科學基金青年基金項目（81503007）。

邱立朋（1984—），男，山東臨沂人，理學博士，講師，主要從事納米給藥系統(tǒng)研究。E-mail：flyqlp@163.com

*通信作者：陳敬華（1971—），男，湖北黃石人，教授，博士研究生導師，主要從事生物功能材料研究。E-mail：jhchenwhut@126.com

邱立朋，曹瑩，朱夢琴，等.葡聚糖-兩性霉素B的制備及其抑菌活性研究[J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（07）：692-697.