李 杰，王亦然，年浩瀚，陳夢(mèng)玲，魯 瑤，王光利

①

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

一株新的多菌靈降解菌的篩選、鑒定及其降解特性

李 杰，王亦然，年浩瀚，陳夢(mèng)玲，魯 瑤，王光利

①

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

從長(zhǎng)期受多菌靈污染的土壤中，通過(guò)培養(yǎng)試驗(yàn)和紫外分光光度計(jì)法，篩選出一株能較好降解多菌靈的細(xì)菌，并將其命名為C4.根據(jù)菌落形態(tài)、生理生化特性及16S rDNA序列的同源性分析等，初步鑒定為細(xì)桿菌屬.多菌靈降解菌C4能夠適應(yīng)較廣的溫度范圍，且在30℃生長(zhǎng)最好，降解效果最優(yōu).當(dāng)初始pH為7.0，且通氣量大的時(shí)候，該菌株生長(zhǎng)最好，降解率最高.在一定的NaCl濃度范圍內(nèi)，降解菌C4都能生長(zhǎng)，且當(dāng)鹽濃度為35 g·L-1時(shí)，降解率最高，結(jié)合實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)選擇10 g·L-1.在最優(yōu)降解條件下，降解菌C4在5～6 d內(nèi)，幾乎可以完全降解100 mg·L-1的多菌靈，平均降解能力為18.5 mg·L-1·d-1.

多菌靈；篩選；鑒定；生物降解

0 引言

多菌靈（N－（2－苯駢咪唑基）－氨基甲酸甲酯）是一種苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，具有廣譜、高效、低毒的特點(diǎn)，在世界各國(guó)的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有很長(zhǎng)的應(yīng)用歷史.同時(shí)它也是苯菌靈和托布津類(lèi)殺菌劑的主要代謝產(chǎn)物.多菌靈的作用機(jī)制是在細(xì)胞分裂期，通過(guò)打亂微管組裝來(lái)阻止紡錘體的形成.由于長(zhǎng)期大量且不規(guī)范地使用多菌靈，噴灑的農(nóng)藥大部分都進(jìn)入土壤中.多菌靈及其殘留物已在多種糧食、蔬菜、水果、草藥及煙草中檢測(cè)到.農(nóng)藥殘留超標(biāo)不僅使農(nóng)民受到嚴(yán)重的損失，同時(shí)對(duì)環(huán)境也造成危害.多菌靈在土壤中較穩(wěn)定，且在不同的土壤環(huán)境下，半衰期也有差別［1-2］，殘留在土壤中的多菌靈會(huì)通過(guò)植物的根系，葉脈進(jìn)入整個(gè)植物［3］，最后通過(guò)食物鏈傳遞給各級(jí)消費(fèi)者［4］，產(chǎn)生毒害影響.有關(guān)多菌靈的毒害作用已經(jīng)有不少報(bào)道.Morinaga等［5］發(fā)現(xiàn)多菌靈有可能會(huì)干擾人類(lèi)的內(nèi)分泌.Singh等［6］通過(guò)對(duì)大麥根的分生細(xì)胞分析得出，多菌靈有可能會(huì)造成遺傳毒害.現(xiàn)已有大量的報(bào)道證明，多菌靈對(duì)雄性生殖系統(tǒng)具有毒性作用，如Nakai等［7］研究結(jié)果顯示，大劑量的口服多菌靈會(huì)明顯損傷精子形成早期的頂體.我國(guó)每年多菌靈的生產(chǎn)量已超過(guò)10 000 T.大量的農(nóng)藥殘留在土壤、河流中，對(duì)各種生物的生長(zhǎng)繁殖造成潛在的危害.目前已經(jīng)報(bào)道多種多菌靈降解菌，且降解途徑已有報(bào)道［8-9］，但有關(guān)細(xì)桿菌屬對(duì)多菌靈的降解還尚未有報(bào)道.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基與試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1.5 g K2HPO4，0.5 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，1.0 g NaCl，1.0 g NH4NO3，1 L水. LB培養(yǎng)基：5 g酵母提取物，10 g NaCl，10 g胰化蛋白胨，1 L水.

1.1.2 供試土樣和藥劑

從江蘇省太倉(cāng)市某農(nóng)藥廠多菌靈生產(chǎn)車(chē)間排污口處采集的活性污泥土樣；多菌靈原藥（有效成分98%），購(gòu)自石家莊百納化工助劑有限公司；三氯甲烷（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、甲醇（色譜純）、無(wú)水硫酸鈉（分析純）.

1.1.3 儀器

TQHZ-2002A大容量全溫度振蕩培養(yǎng)箱；智能光照培養(yǎng)箱；德國(guó)Hettich ROTINA380R離心機(jī)；高效液相色譜儀.

1.2 方法

1.2.1 多菌靈降解菌的富集篩選

取采集的5份土樣，每份2 g，共10 g，加入100 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中另加0.1%的酵母膏，和終濃度50 mg·L-1的多菌靈.在30℃，160 r·min-1的恒溫震蕩箱中培養(yǎng)5 d，取第一次富集液的上清5 mL，轉(zhuǎn)接到100 mg·L-1的多菌靈富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 d.同樣的條件下連續(xù)轉(zhuǎn)接，富集液濃度分別為200 mg·L-1，300 mg·L-1，400 mg·L-1，500 mg·L-1，600 mg·L-1.稀釋涂布，培養(yǎng)3 d后根據(jù)菌落的顏色、大小、濕潤(rùn)度、透明度、菌落邊緣的形態(tài)、菌落的形狀等選擇具有代表性的單菌落，在平板上進(jìn)行編號(hào)后劃線，在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h.得到純培養(yǎng)物后接種到10 mL的液體LB中培養(yǎng)至OD600為1.0時(shí)，接2%的培養(yǎng)液到多菌靈濃度為50 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)和HPLC進(jìn)行驗(yàn)證.對(duì)有明顯降解效果的純培養(yǎng)物進(jìn)行甘油保存，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用.

1.2.2 HPLC檢測(cè)

取培養(yǎng)7 d的多菌靈降解液，用等體積的三氯甲烷萃取，靜置分層后收集下層，無(wú)水硫酸鈉去除殘留水分.室溫下用氮?dú)饬鲹]發(fā)凈三氯甲烷，再用2 mL甲醇重新溶解，0.22 μm有機(jī)相針頭過(guò)濾去除雜質(zhì)后收集，通過(guò)高效液相色譜儀檢測(cè).HPLC條件：流動(dòng)相為甲醇和水（1：1），流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm.

1.2.3 16S rRNA的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

按照1%的接菌量接種到液體LB中，恒溫培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，采用高鹽法提取基因組［10］.PCR引物為通用引物（+）27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和（-）1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′.擴(kuò)增體系為：基因組模板20 ng，10×buffer 5 μL，10 mmol·L-1的dNTPs 2 μL，10 μM的27F 1 μL，10 μM的1492R 1μL，5 U·μL-1的Tap Plus poiymerase 0.5 μL，剩下的用水補(bǔ)齊50 μL.PCR擴(kuò)增程序：95℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃90 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10 min.擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD18-T載體中，然后轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中，挑選陽(yáng)性克隆子送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NC?BI上，在線查詢分析，利用Blast軟件在GenBank中與其他的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較，選擇相近的序列和降解菌株的序列用MEGA 5.0計(jì)算遺傳距離，通過(guò)鄰結(jié)法［11］構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖1所示.

1.2.4 純培養(yǎng)條件下菌株的降解特性

1.2.4.1 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解特性的影響

取5%處于對(duì)數(shù)期OD為1.0的新鮮菌液加入到滅過(guò)菌的100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，多菌靈的終濃度為100 mg·L-1，用HCl和NaOH來(lái)調(diào)節(jié)pH，分別為4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0時(shí)，30℃，160 r的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h，吸取2 mL培養(yǎng)液，測(cè)此時(shí)降解菌的OD600.同時(shí)，萃取出培養(yǎng)液中的多菌靈，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè).以滅活菌做對(duì)照.

1.2.4.2 溫度對(duì)降解菌株的生長(zhǎng)及降解特性的影響

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期OD600為1.0的新鮮菌液5 mL，加入到100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，多菌靈的終濃度為100 mg·L-1，分別放置在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，160 r的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h.吸取2 mL培養(yǎng)液測(cè)菌的吸光值，剩余的培養(yǎng)液用三氯甲烷萃取，再用紫外分光光度計(jì)檢測(cè).

1.2.4.3 裝液量對(duì)降解菌生長(zhǎng)和降解特性的影響

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期OD600為1.0的新鮮菌液5 mL，加入到分別裝有30 mL，50 mL，70 mL，90 mL，110 mL，130 mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，多菌靈的終濃度為100 mg·L-1，放置在30℃，160 r的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)72 h.吸取2 mL培養(yǎng)液測(cè)菌的吸光值，剩余的培養(yǎng)液用三氯甲烷萃取，再用紫外分光光度計(jì)檢測(cè).

1.2.4.4 NaCl濃度對(duì)降解菌降解特性的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600為1.0的新鮮菌液5 mL，加入到含有不同濃度NaCl的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，多菌靈的終濃度為100 mg·L-1.置于30℃，160 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè).

1.2.4.5 最優(yōu)培養(yǎng)條件下多菌靈的降解特性

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OD600為1.0的新鮮菌液5 mL，加入到100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃，160 r·min-1置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，分別于12 h，24 h，36 h，48 h，72 h，96 h，120 h取樣，用HPLC檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈降解菌的篩選與鑒定

用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)40 d的富集篩選得到一株降解多菌靈的菌株，將其命名為C4.純培養(yǎng)物的菌落表面光滑粘稠，凸起濕潤(rùn)，顏色呈黃綠色，邊緣整齊，鏡檢結(jié)果呈革蘭氏陽(yáng)性.用SDS高鹽法提取C4的基因組，以通用引物擴(kuò)增出大小為1.5 kb的16S rDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行DNA序列 BLAST同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與細(xì)桿菌屬的相似度最高.結(jié)合菌株C4的形態(tài)特征，生理生化特性，初步鑒定菌株C4屬于細(xì)桿菌屬（Microbacterium），且尚不能確定種，還需與模式生物進(jìn)行DNA雜交，根據(jù)同源性做進(jìn)一步分析.

圖1 根據(jù)16S rDNA部分基因序列構(gòu)建的菌株C4與相關(guān)種屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 純培養(yǎng)條件下菌株的降解特性

2.2.1 pH對(duì)菌株生長(zhǎng)及降解特性的影響

在不同的pH條件下，多菌靈的生長(zhǎng)和降解情況如圖2所示.降解菌C4在pH為7的時(shí)候，降解菌C4的生長(zhǎng)量OD600最高為0.321，降解率也最高為82%.當(dāng)培養(yǎng)基初期為酸性時(shí)，隨著酸性的增強(qiáng)，降解菌的生長(zhǎng)量和降解效果逐漸降低.當(dāng)培養(yǎng)基初期為堿性時(shí)，隨著堿性的增強(qiáng)，降解菌的生長(zhǎng)量和降解效果逐漸降低.所以培養(yǎng)基的初始酸堿度對(duì)降解菌C4的生長(zhǎng)量和降解率有較大的影響.由于多菌靈易溶于酸水不溶于堿水，所以在酸性條件下比在堿性條件時(shí)降解的更好.

圖2 不同pH對(duì)菌株C4生長(zhǎng)和降解的影響

圖3 溫度對(duì)菌株C4生長(zhǎng)和降解的影響

2.2.2 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解的影響

溫度對(duì)降解菌C4的生長(zhǎng)和降解效果如圖3所示，降解菌C4的最適生長(zhǎng)范圍是25～35℃，此時(shí)的降解效果最佳.72 h時(shí)，降解率最高可達(dá)到68%.當(dāng)溫度范圍在10～20℃時(shí)，降解菌生長(zhǎng)較慢.超過(guò)35℃，該菌的生長(zhǎng)量減少.說(shuō)明高溫不適合降解菌C4生長(zhǎng).所以本次實(shí)驗(yàn)最適溫度選擇在30℃.

2.2.3 裝液量對(duì)降解菌生長(zhǎng)和降解的影響

裝液量分別為30 mL，50 mL，70 mL，90 mL，110 mL，130 mL，搖瓶培養(yǎng)72 h，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示.當(dāng)裝液量為30～50 mL時(shí)，降解效果最好.此時(shí)通氣量大，菌生長(zhǎng)的也好.當(dāng)通氣量在70～130 mL時(shí)，降解菌株C4的降解效果逐漸下降，菌株的生長(zhǎng)情況也逐漸下降，說(shuō)明該降解菌株不是厭氧菌.考慮到瓶子的利用率，所以本次試驗(yàn)的裝液量選定為100 mL.

圖4 裝液量對(duì)菌株C4生長(zhǎng)和降解的影響

圖5 NaCl濃度對(duì)菌株C4生長(zhǎng)和降解的影響

2.2.4 NaCl濃度對(duì)降解菌生長(zhǎng)和降解的影響

在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入不同濃度的NaCl，搖瓶培養(yǎng)72 h后檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)和降解情況，如圖5所示，當(dāng)鹽濃度為15～35 g·L-1時(shí)，菌生長(zhǎng)狀況最好，當(dāng)高于35 g·L-1時(shí)，降解菌生長(zhǎng)量迅速下降，直至濃度為100 g·L-1時(shí)，菌株幾乎無(wú)法生長(zhǎng).鹽濃度在25 g·L-1時(shí)，菌株的降解效果最好.根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本次實(shí)驗(yàn)選擇鹽濃度為10 g·L-1.

2.2.5 最優(yōu)條件下菌株的生長(zhǎng)和降解情況

當(dāng)降解條件為30℃，中性，NaCl濃度為10 g·L-1，裝液量為100 mL的時(shí)候，搖瓶培養(yǎng)120 h后檢測(cè)結(jié)果.如圖6所示，從圖6中可以看出，該菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況良好，且在剛開(kāi)始的60 h之內(nèi)降解較快，隨后在120 h時(shí)，降解菌C4的降解量達(dá)到91%，能很好的降解多菌靈.且降解菌的降解曲線和生長(zhǎng)曲線相吻合.降解菌沒(méi)有明顯的延滯期，生長(zhǎng)量在逐步增加，直至72 h后處于平穩(wěn)期.

圖6 最優(yōu)條件下菌株C4生長(zhǎng)和降解情況

3 討論

生物修復(fù)技術(shù)因具有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效的特點(diǎn)，作為一種治理環(huán)境農(nóng)藥污染的方法被國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視.最關(guān)鍵性的一步就是要篩選出能夠高效降解農(nóng)藥的菌株.張桂山等［12］報(bào)道的羅爾斯通菌屬，當(dāng)外加酵母提取物，多菌靈濃度為500 mg·L-1，避光培養(yǎng)24 d，降解率達(dá)到95.96%.Xu等［13］篩選出的紅球菌屬能以多菌靈為唯一碳、氮源生長(zhǎng).在2～3 d內(nèi)，可以完全降解100 mg·L-1的多菌靈，降解率高達(dá)55.56 mg·L-1·d-1.王呈玉等［14］篩選出的拉烏爾菌屬在25℃，pH 7.0，200 r·min-1，避光培養(yǎng)72 h，多菌靈初始濃度為50 mg·L-1的降解率達(dá)到100%.降解菌的生長(zhǎng)特性對(duì)該菌是否能應(yīng)用于生物修復(fù)具有重要的實(shí)際意義.本實(shí)驗(yàn)室篩選出的多菌靈降解菌Microbacterium sp.對(duì)環(huán)境具有良好的適應(yīng)性.通過(guò)試驗(yàn)可知，該降解菌在溫度范圍為20～40℃時(shí)，降解率均高于30%.當(dāng)pH為7左右時(shí)，降解率均高于50%，能適應(yīng)稍大范圍的酸堿度變化.且在NaCl濃度為10～35 g·L-1的范圍內(nèi)有較好的降解效果.C4能夠在以多菌靈為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中很好的生長(zhǎng)，且降解效果較好，培養(yǎng)120 h后，降解率高達(dá)91%.

由于多菌靈本身對(duì)于生物安全具有危害性，且已經(jīng)被大量生產(chǎn)并應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，所以研究多菌靈的生物降解具有重要的意義.篩選出能夠高效降解多菌靈的菌株是生物修復(fù)的基礎(chǔ)，探究降解菌的降解特性對(duì)日后把降解菌推向?qū)嶋H應(yīng)用具有重要意義.另外，繼續(xù)探索該菌株代謝途徑，純化出代謝產(chǎn)物驗(yàn)證其是否會(huì)造成二次污染，構(gòu)建多功能高效穩(wěn)定的工程菌等相關(guān)問(wèn)題還尚待解決.

4 結(jié)論

從長(zhǎng)期受到多菌靈污染的土壤中篩選出一株能夠高效降解多菌靈的菌株，命名為C4.經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列同源性測(cè)定，初步鑒定該降解菌為細(xì)桿菌屬，其豐富了降解菌的菌種資源.該菌株能夠在以多菌靈為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中很好的生長(zhǎng)，且降解效果較好，培養(yǎng)120 h后，降解率高達(dá)91%.通過(guò)試驗(yàn)可以看出，這株降解菌C4的最適生長(zhǎng)條件為30℃，中性，有氧.該菌株有較寬泛的溫度適應(yīng)范圍，且在偏酸性的條件下，降解率也高達(dá)50%以上，同時(shí)對(duì)鹽濃度有一定的耐受范圍.這為該菌株用于多菌靈污染土壤的微生物治理提供良好的依據(jù)，且為以后研究多菌靈代謝提供基礎(chǔ).

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The Isolation，Identification and Degradation Character of a Novel Carbendazim-degrading Bacterium

LI Jie，WANG Yiran，NIAN Haohan，CHEN Mengling，LU Yao，WANG Guangli
（School of Life Science，Huaibei Normal University，235000，Huaibei，Anhui，China）

The aim was to isolation a novel carbendazim-degrading bacterium and study the degradation char?acter.A carbendazim-degrading bacterium was isolated by continuous enrichment，screened from long carben?dazim-treated soils，then it was identified according to their morphological observation，physiological biochem?ical test，comparison sequences of 16S rDNA and phylogenetic analysis.The degrading rate was detected by UV spectrophotometer.The result shows that the optimum growth temperature on carbendazim is 25～30℃，the optimum pH is 7.0.The C4 can utilize carbendazim as the sole carbon or nitrogen source and after five to six days 100 mg·L-1of carbendazim could almost be degraded completely，the average degradation rate at 18.5 mg·L-1·d-1.

carbendazim；isolation；identification；biodegradation

X 173

A

2095-0691（2017）03-0037-06

2017-04-05

李 杰（1994- ），女，安徽淮北人，碩士生，研究方向：微生物學(xué).通信作者：王光利（1978- ），男，安徽淮北人，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物學(xué)與環(huán)境微生物工程的研究工作.