朱海生，劉建汀，陳敏氡，李永平，王彬，張前榮，葉新如，林琿，溫慶放

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絲瓜銅鋅超氧化物歧化酶基因家族的克隆與表達(dá)分析

朱海生，劉建汀，陳敏氡，李永平，王彬，張前榮，葉新如，林琿，溫慶放

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福州350013）

【目的】克隆絲瓜銅/鋅超氧化物歧化酶基因家族，并分析其序列特征、表達(dá)情況及其在絲瓜褐變中的作用，為進(jìn)一步揭示絲瓜褐變的發(fā)生機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，為絲瓜品種遺傳改良奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和RT-PCR方法獲得絲瓜基因家族的cDNA序列，采用生物信息學(xué)方法分析氨基酸序列，利用熒光定量PCR技術(shù)研究基因家族在不同組織及褐變條件下的表達(dá)情況。采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定總超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用福林-酚比色測(cè)定總酚含量?！窘Y(jié)果】獲得了3個(gè)絲瓜基因家族cDNA序列，依次命名為（GenBank登錄號(hào)：KP178922）、（GenBank登錄號(hào)：KX092445）和（GenBank登錄號(hào)：KX092446）。全長(zhǎng)758 bp，包含一個(gè)456 bp的開放讀碼框（ORF），編碼152個(gè)氨基酸；全長(zhǎng)799 bp，ORF為471 bp，編碼157個(gè)氨基酸；全長(zhǎng)1 011 bp，ORF為663 bp，編碼221個(gè)氨基酸；編碼的蛋白與甜瓜、南瓜、黃瓜同源蛋白的相似性均在90%以上。生物信息學(xué)分析表明3個(gè)基因編碼的酶蛋白均無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性穩(wěn)定蛋白，Wolf Psort預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)?；蚣易逶诟械谋磉_(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低。在絲瓜采后儲(chǔ)藏期間，和在絲瓜儲(chǔ)藏初期表達(dá)量較采后當(dāng)時(shí)（0 d）上調(diào)，后期表達(dá)量受到抑制；在絲瓜鮮切條件下，3個(gè)基因表達(dá)量在鮮切后較采后當(dāng)時(shí)（0 h）總體呈下降趨勢(shì)。相關(guān)性分析顯示，在采后儲(chǔ)藏和鮮切條件下，表達(dá)量均與SOD酶活性呈極顯著性正相關(guān)，表達(dá)量均與SOD酶活性呈顯著性正相關(guān)，SOD酶活性在鮮切條件下與總酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)，和在調(diào)控SOD酶活性方面起作重要作用，和的表達(dá)影響了SOD酶活性，并影響了絲瓜褐變進(jìn)程?！窘Y(jié)論】從絲瓜果肉中獲得基因家族的3個(gè)，其中和在普通絲瓜果肉褐變過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。

絲瓜；褐變；；表達(dá)分析；SOD活性

0 引言

【研究意義】絲瓜為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Mill.）一年生攀援藤本植物，起源于印度，主要分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，在亞洲和拉丁美洲種植最為廣泛，在中國(guó)各地均有大面積栽培，是中國(guó)重要的蔬菜之一[1-2]。絲瓜屬約有8個(gè)種，只有普通絲瓜（（L.）Roem.）和有棱絲瓜（（L.）Roxb.）2種經(jīng)過(guò)馴化作為栽培種推廣[3]，其中普通絲瓜在儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、加工和烹飪過(guò)程中果肉及湯汁容易產(chǎn)生褐變，大大降低了其貯藏加工性能，嚴(yán)重影響絲瓜產(chǎn)品的商品價(jià)值，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此了解絲瓜褐變機(jī)理并控制褐變的發(fā)生已成為絲瓜育種和采后的研究熱點(diǎn)[4-6]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）作為植物防御系統(tǒng)中的第一道防線，是有效清除活性氧的重要抗氧化酶，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[7-8]，在維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性[9-10]、增強(qiáng)植物的抗逆性[11-12]、延緩果蔬衰老褐變[13]等方面有著重要的作用。因此，克隆絲瓜，分析其表達(dá)、SOD活性與絲瓜褐變的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡明絲瓜褐變機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)絲瓜生產(chǎn)、貯運(yùn)、加工和品種選育都具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】SOD酶是生物體內(nèi)廣泛存在的能清除細(xì)胞內(nèi)有害活性氧的一類金屬酶，是最先參與清除植物體內(nèi)超氧因子自由基反應(yīng)的酶類，在抗氧化酶系統(tǒng)中處于核心地位[10,14-16]。高等植物以Cu/Zn-SOD為主，是SOD中尤為重要的一類，占總SOD的90%[17-18]。研究表明，Cu/Zn-SOD與植物的抗旱、抗寒、耐鹽堿等多種抗逆性關(guān)系密切[19-23]。SOD也是與果蔬酶促褐變相關(guān)的酶，對(duì)果蔬體內(nèi)的酚類物質(zhì)的氧化起抑制作用。嚴(yán)伶俐等[13]研究表明，荔枝的表達(dá)與果皮褐變密切相關(guān)。蔣娟等[24]認(rèn)為，鮮切蓮藕過(guò)程中Cu/Zn-SOD蛋白表達(dá)下降，蓮藉清除自由基的能力減弱，引起褐變發(fā)生。萊陽(yáng)梨果實(shí)中SOD等內(nèi)源抗氧化酶活性提高，可以減少活性氧的積累及膜脂過(guò)氧化程度，維持膜的結(jié)構(gòu)與功能，抑制果肉褐變[25-26]。Cu/Zn-SOD在生物體中存在廣泛，目前已從棉花[27]、水稻[28]、玉米[29]、甘蔗[30]、白菜[31]、茶樹[32]等多種植物中克隆獲得了。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)絲瓜果實(shí)褐變的生理和分子機(jī)理所知甚少。絲瓜基因家族的克隆、基因表達(dá)分析及其在絲瓜褐變中的作用等相關(guān)研究，目前未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從絲瓜果肉克隆獲得基因家族成員，分析其家族序列特征，研究表達(dá)模式、酶活性、總酚含量與絲瓜褐變的相關(guān)性，為深入研究絲瓜褐變機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為優(yōu)質(zhì)絲瓜品種選育提供支持。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年10月至2016年2月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

以‘閩絲3號(hào)’絲瓜為材料，不同組織試驗(yàn)選取‘閩絲3號(hào)’同一時(shí)期的根、莖、葉、花和果實(shí)；不同儲(chǔ)藏時(shí)間試驗(yàn)是將‘閩絲3號(hào)’果實(shí)恒溫（4±1）℃放置0、1、2、3和4 d后分別取樣；鮮切處理試驗(yàn)是將‘閩絲3號(hào)’果實(shí)鮮切恒溫（25±1）℃放置0、2、4、6和8 h后取樣。

試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，樣品采集后用液氮速凍，貯藏在超低溫冰箱（-80℃）中備用。

1.2 絲瓜基因家族的克隆

利用百泰克通用植物總RNA提取試劑盒提取絲瓜果肉總RNA，使用大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。根據(jù)筆者課題組2015年對(duì)絲瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組Illumina高通量深度測(cè)序的結(jié)果，搜索到基因家族3個(gè)基因全長(zhǎng)，依據(jù)獲得的基因序列信息來(lái)設(shè)計(jì)cDNA全長(zhǎng)和開放閱讀框（open read frame，ORF）引物（表1）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳、純化、回收后，與pMD18-T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，PCR檢測(cè)后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究中的引物

1.3 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN6.0 進(jìn)行基因和氨基酸序列比對(duì)；進(jìn)化樹的構(gòu)建采用Clustal W2軟件和MEGA 4.0軟件；序列處理在線工具包（SMS）（http://www.bio-soft.net/ sms/index.html）；保守結(jié)構(gòu)域分析采用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）；蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）軟件；翻譯后蛋白修飾MotifScan（http://myhits.isb-sib.ch/ cgibin/motif_scan）；亞細(xì)胞定位分析采用Wolf Psort Prediction軟件（http://www.genscript.com/psort/wolf_ psort.html）。

1.4 絲瓜基因家族表達(dá)分析

利用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)基因家族3個(gè)基因熒光定量PCR引物（表1），內(nèi)參基因?yàn)楸菊n題組克隆獲得的絲瓜18S rRNA[33]。參照Power SYBR? Green PCR Master Mix（美國(guó)，ABI）說(shuō)明書在ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為25 μL：10 μL SYBR?Premix，4 μL cDNA模板，0.4 μL正、反向引物，0.4 μL Rox，加蒸餾水至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。反應(yīng)完成后進(jìn)行融解曲線和熒光值變化曲線分析，采用2-??Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)情況。

1.5 絲瓜總酚和SOD活性的測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法[34]測(cè)定SOD酶活性。絲瓜總酚采用筆者課題組建立的福林-酚比色法測(cè)定[35-36]。

2 結(jié)果

2.1 絲瓜基因家族的克隆

根據(jù)本課題組2015年對(duì)絲瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組Illumina高通量深度測(cè)序的結(jié)果，搜索到基因家族3個(gè)基因全長(zhǎng)，分別命名為（GenBank登錄號(hào)為KP178922）、（GenBank登錄號(hào)為KX092445）和（GenBank登錄號(hào)為KX092446）。

設(shè)計(jì)序列全長(zhǎng)引物和ORF引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到約750 bp和460 bp（圖1），測(cè)序結(jié)果表明，全長(zhǎng)758 bp，ORF為456 bp，包含一個(gè)71 bp的5′非編碼區(qū)和231 bp的3′非編碼區(qū)。該基因序列與印度南瓜（KF831056.1）、中國(guó)南瓜（KF831053.1）、黃瓜（XM_011659851.1）和甜瓜（XM_008452515.2）等序列的同源性分別為93%、90%、88%和85%。

設(shè)計(jì)基序列全長(zhǎng)引物和ORF引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到約800 bp和470 bp（圖1），測(cè)序結(jié)果表明，全長(zhǎng)799 bp，ORF為471 bp，包含一個(gè)197 bp的5′非編碼區(qū)和131 bp的3′非編碼區(qū)。該基因序列與甜瓜（XM_008443767.2）、黃瓜（XM_004147491.2）和梅（XM_008242310.1）等序列的同源性分別為88%、87%和80%。

設(shè)計(jì)基因序列全長(zhǎng)引物和ORF引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，分別得到約1 000 bp和660 bp（圖1），測(cè)序結(jié)果表明，全長(zhǎng)1 011 bp，ORF為663 bp，包含一個(gè)76 bp的5′非編碼區(qū)和272 bp的3′非編碼區(qū)。該基因序列與甜瓜（XM_008467200.2）、黃瓜（XM_004145720.2）和棗（XM_016018106.1）等序列的同源性分別為85%、84%和83%。

、和3個(gè)基因之間平均同源性為51.07%。

2.2基因家族編碼蛋白質(zhì)的特性分析

2.2.1基因家族編碼蛋白質(zhì)的特性分析ORF編碼152個(gè)氨基酸，理論分子量（Mw）為15.14 kD，等電點(diǎn)（pI）為5.644，pH 7.0時(shí)的帶點(diǎn)荷數(shù)（ch）為-5.836；在構(gòu)成該蛋白的20種氨基酸中，甘氨酸（Gly）含量最高（20.4%），纈氨酸（Vla）次之（7.9%），甲硫氨酸（Met）含量最低，為1.3%；就構(gòu)成氨基酸的特性而言，該蛋白包含8個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K、R），15個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D、E），44個(gè)疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）和36個(gè)極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y），脂肪族指數(shù)（AI）為75.00，不穩(wěn)定系數(shù)（II）為20.88；該蛋白的總平均疏水性（GRAVY）為-0.167，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。

M：DL2000 marker；A：LcCu/Zn-SOD1基因全長(zhǎng)；B：LcCu/Zn-SOD1基因ORF；C：LcCu/Zn-SOD2基因全長(zhǎng)；D：LcCu/Zn-SOD2基因ORF；E：LcCu/Zn-SOD3基因全長(zhǎng)；F：LcCu/Zn-SOD3基因ORF

Blastp搜索顯示，LcCu/Zn-SOD1含有一個(gè)保守SOD的結(jié)構(gòu)域（2—145位，E值為7.32e-57），屬于Cu/Zn類SOD超家族。Motif Scan分析顯示，43—53位為Cu/Zn-SOD信號(hào)序列1；137—148位為Cu/Zn-SOD信號(hào)序列2；9—14、32—37、55—60和137—142位為N-豆蔻?；稽c(diǎn)；87—90和97—100位為酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；33—36和85—88位為N糖基化位點(diǎn)。采用SignalP分析表明，LcCu/Zn- SOD1不含信號(hào)肽序列。采用Wolf Psort預(yù)測(cè)表明，其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的可能性最大。TMHMM顯示，LcCu/Zn-SOD1屬于非跨膜蛋白。LcCu/Zn-SOD1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，序列中α螺旋、β轉(zhuǎn)角和β折疊分別占41.7%、15.3%和36.1%。利用SWISS- MODEL對(duì)絲瓜LcCu/Zn-SOD1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2-A所示。

2.2.2基因家族編碼蛋白質(zhì)的特性分析基因ORF編碼157個(gè)氨基酸，理論分子量（Mw）為15.88 kD，等電點(diǎn)（pI）為7.159，pH 7.0時(shí)的帶點(diǎn)荷數(shù)（ch）為0.517；在構(gòu)成該蛋白的20種氨基酸中，甘氨酸（Gly）含量最高（17.8%），異亮氨酸（Ile）次之（8.3%），酪氨酸（Tyr）含量最低，為0.6%；就構(gòu)成氨基酸的特性而言，該蛋白包含13個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K、R），14個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D、E），51個(gè)疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）和33個(gè)極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y），脂肪族指數(shù)（AI）為90.06，不穩(wěn)定系數(shù)（II）為17.61；該蛋白的總平均疏水性（GRAVY）為-0.136，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。

Blastp搜索顯示，LcCu/Zn-SOD2含有一個(gè)保守SOD的結(jié)構(gòu)域（5—148位，E值為8.16e-61），屬于Cu/Zn類SOD超家族。Motif Scan分析顯示，46—56位為Cu/Zn-SOD信號(hào)序列1；140—151位為Cu/Zn-SOD信號(hào)序列2；12—17、39—44、58—63、87—92/140—145和152—157位為N-豆蔻?；稽c(diǎn)；11—14和100—103位為酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；60—63位為N-糖基化位點(diǎn)。采用SignalP分析表明，LcCu/Zn-SOD2不含信號(hào)肽序列。采用Wolf Psort預(yù)測(cè)表明，其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大。TMHMM顯示，LcCu/Zn-SOD2屬于非跨膜蛋白。LcCu/Zn-SOD2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，序列中α螺旋、β轉(zhuǎn)角和β折疊分別占44.6%、42.7%和16.6%。利用SWISS-MODEL對(duì)絲瓜LcCu/Zn- SOD2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2-B所示。

2.2.3基因家族編碼蛋白質(zhì)的特性分析基因ORF編碼221個(gè)氨基酸，理論分子量（Mw）為22.41 kD，等電點(diǎn)（pI）為6.092，pH 7.0時(shí)的帶點(diǎn)荷數(shù)（ch）為-5.302；在構(gòu)成該蛋白的20種氨基酸中，丙氨酸（Ala）含量最高（12.7%），其次為甘氨酸（Gly）和亮氨酸（Leu）（均為10.9%）；就構(gòu)成氨基酸的特性而言，該蛋白包含12個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K、R），19個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D、E），84個(gè)疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V）和54個(gè)極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y），脂肪族指數(shù)（AI）為93.62，不穩(wěn)定系數(shù)（II）為24.01；該蛋白的總平均疏水性（GRAVY）為-0.061，預(yù)測(cè)為親水性蛋白。

A: LcCu/Zn-SOD1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu); B: LcCu/Zn-SOD2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu); C: LcCu/Zn-SOD3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

Blastp搜索顯示，LcCu/Zn-SOD3含有一個(gè)保守Cu/Zn-SOD的結(jié)構(gòu)域（70—213位，E值為5.45e-60），屬于Cu/Zn類SOD超家族。Motif Scan分析顯示，111—121位為Cu/Zn SOD信號(hào)序列1；205—216位為Cu/Zn-SOD信號(hào)序列2；104—109、123—128、152—157、160—165和205—210位為N-豆蔻?；稽c(diǎn)；80—83、89—92和165—168位為酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。采用SignalP分析表明，LcCu/Zn-SOD3不含信號(hào)肽序列。采用Wolf Psort預(yù)測(cè)表明，其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大。TMHMM顯示，LcCu/Zn- SOD3屬于非跨膜蛋白。LcCu/Zn-SOD3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，序列中α螺旋、β轉(zhuǎn)角和β折疊分別占55.2%、48.4%和12.7%。利用SWISS-MODEL對(duì)絲瓜LcCu/Zn-SOD3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2-C所示。

2.3 LcCu/Zn-SOD蛋白的同源比對(duì)與進(jìn)化分析

同源分析表明，LcCu/Zn-SOD1（AKN08991.1）與黃瓜（NP_001267697.1）、印度南瓜（AHF27437.1）、中國(guó)南瓜（AHF27434.1）、甜瓜（XP_008450736.1）和蘿卜（XP 018435956.1）等蛋白的同源性為93%、92%、91%、91%和90%；LcCu/Zn-SOD2（APO14278.1）與黃瓜（XP_004147539.1）、甜瓜（XP_008441989.1）、白樺（AHX36945.1）和黃麻（OMO92598.1）等蛋白的同源性為92%、92%、87%和85%；LcCu/Zn-SOD3（APO14279.1）與甜瓜（XP_008465422.1）、黃瓜（XP_008441989.1）、棗（XP_015873592.1）和陸地棉（ABA00454.1）等蛋白的同源性為91%、90%、83%和79%，顯示出較高的保守性。LcCu/Zn-SOD1、LcCu/Zn-SOD2和LcCu/Zn-SOD3三者平均同源性為50.15%。

進(jìn)一步分析SOD蛋白親緣關(guān)系（圖3），結(jié)果表明，LcCu/Zn-SOD1與印度南瓜、中國(guó)南瓜、黃瓜、甜瓜等聚為一類，蛋白親緣關(guān)系較近，與陸地棉等SOD蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；LcCu/Zn-SOD2與黃瓜、甜瓜等聚為一類，蛋白親緣關(guān)系較近，與棗等SOD蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；LcCu/Zn-SOD3與甜瓜、黃瓜等聚為一類，蛋白親緣關(guān)系較近，與麻風(fēng)樹等SOD蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。LcCu/Zn-SOD1、LcCu/Zn-SOD2和LcCu/Zn-SOD3三者都能和同為葫蘆科的其他作物聚在一起，可見(jiàn)不同植物的SOD系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有明顯的種屬特征。

2.4基因家族表達(dá)分析

2.4.1 不同組織中的表達(dá) 熒光定量PCR分析結(jié)果表明，、和在絲瓜根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)（圖4），但表達(dá)量存在明顯差異，在根中的表達(dá)豐度最高，其次為葉和果實(shí)，在莖和花的表達(dá)量較低。在果實(shí)中，表達(dá)量最高，表達(dá)量最低。

2.4.2 采后不同冷藏時(shí)間中的表達(dá) 利用熒光定量PCR分析在4℃冷藏1、2、3和4 d時(shí)基因家族表達(dá)情況（圖5），3個(gè)基因表達(dá)模式存在一定差異，在采后前2 d的表達(dá)量逐漸上升，均比采后當(dāng)時(shí)（0 d）高，并在采后2 d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值，3 d后開始下降，但3 d時(shí)仍高于采后當(dāng)時(shí)（0 d），4 d時(shí)表達(dá)量最低，且低于采后當(dāng)時(shí)（0 d）；隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，只是在2 d時(shí)略有回調(diào)；在采后1 d就達(dá)到高峰，之后呈下降趨勢(shì)，且2、3和4 d時(shí)的表達(dá)量均低于采后當(dāng)時(shí)（0 d）?？傮w表達(dá)量上，較高，較低。

隨著采后儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，絲瓜出現(xiàn)褐變（圖6），絲瓜總酚含量呈逐步上升趨勢(shì)，在3 d時(shí)達(dá)到峰值，4 d時(shí)變化減緩，較3 d時(shí)有小幅下降（圖7-A）。絲瓜中SOD酶活性總體變化趨勢(shì)和的表達(dá)較為一致，在2 d時(shí)酶活性達(dá)到最高值，但SOD酶活性變化幅度較為平緩（圖7-B）。相關(guān)性分析表明（表2），和表達(dá)量與SOD酶活性分別呈極顯著正相關(guān)和顯著正相關(guān)，表達(dá)量與SOD酶活性相關(guān)性不明顯，SOD酶活性與總酚含量呈負(fù)相關(guān)。

圖3 LcCu/Zn-SOD1、LcCu/Zn-SOD2和LcCu/Zn-SOD3 蛋白進(jìn)化樹

G：根；J：莖；Y：葉；H：花；GS：果實(shí)

圖5 采后不同時(shí)間LcCu/Zn-SOD基因家族的相對(duì)表達(dá)量

A：采后0 d；B：采后1 d；C：采后2 d；D：采后3 d；E：采后4 d

A：總酚變化情況；B：SOD酶活性變化情況 A: The changes of total phenols content; B: The changes of SOD activity

2.4.3 在鮮切絲瓜中的表達(dá) 絲瓜鮮切并常溫放置2、4、6和8 h后分析基因家族表達(dá)情況（圖8），在鮮切2 h時(shí)表達(dá)量上調(diào)，之后呈下降趨勢(shì)；鮮切后表達(dá)量均低于采后當(dāng)時(shí)（0 h），期間表達(dá)量有起伏；在鮮切2 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最低值，4 h時(shí)上升達(dá)到最高值，之后又逐漸下降。3個(gè)基因表達(dá)量在鮮切后總體呈下降趨勢(shì)，只有和分別在鮮切2 h時(shí)和鮮切4 h時(shí)表達(dá)量高于采后當(dāng)時(shí)（0 h）。

表2 采后不同儲(chǔ)藏時(shí)間基因表達(dá)量、SOD酶活性和總酚含量相關(guān)性分析

*表示在0.05水平顯著性差異，**表示在0.01水平極顯著性差異。下同

*indicates significant difference at the 0.05 level,** indicates extremely significant difference at the 0.01 level. The same as below

圖8 鮮切處理下LcCu/Zn-SOD基因家族的相對(duì)表達(dá)量

絲瓜鮮切后，隨著褐變的發(fā)生（圖9），總酚含量逐漸上升趨勢(shì)，在4 h達(dá)到峰值，4 h后變化減小，趨于穩(wěn)定（圖10-A）。SOD酶活性只有在鮮切2 h時(shí)高于采后當(dāng)時(shí)（0 h），之后逐漸下降，且均低于采后當(dāng)時(shí)（0 d）（圖10-B）。相關(guān)性分析表明（表3），和表達(dá)量與SOD酶活性分別呈極顯著正相關(guān)和顯著正相關(guān)，表達(dá)量與SOD酶活性相關(guān)性不明顯，SOD酶活性與總酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

A：采后0 h；B：采后2 h；C：采后4 h；D：采后6 h；E：采后8 h

表3 不同鮮切時(shí)間基因表達(dá)量、SOD酶活性和總酚含量相關(guān)性分析

A：總酚變化情況；B：SOD酶活性變化情況 A: The changes of total phenols content; B: The changes of SOD activity

3 討論

是多基因家族，龍眼中發(fā)現(xiàn)12個(gè)[37]；擬南芥中發(fā)現(xiàn)3個(gè)[38]；Liu等[39]在芥菜型油菜中克隆到2個(gè)的cDNA片段；湯燕姍等[15]從水蜜桃胚性愈傷組織克隆到2個(gè)。本研究獲得絲瓜3個(gè)，均具有完整的的閱讀框（ORF），但在編碼的氨基酸序列大小上有一定差異。生物學(xué)信息分析顯示，三者編碼的蛋白質(zhì)均含有一個(gè)保守的SOD結(jié)構(gòu)域，屬于Cu/Zn類SOD超家族，各含有2個(gè)Cu/Zn-SOD信號(hào)序列，不含信號(hào)肽序列，屬于親水性、非跨膜蛋白。這些特征與其他植物Cu/Zn-SOD的序列組成和結(jié)構(gòu)均有高度的相似性[7,19,40]。Wolf Psort預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，這與前人得到主要定位于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的結(jié)果一致[17]。同源性分析發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源Cu/Zn-SOD在氨基酸序列上具有較高同源性，其中絲瓜Cu/Zn-SOD蛋白與南瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科蔬菜蛋白的相似性均在90%以上，說(shuō)明基因家族編碼的蛋白具有較高的保守性[40-41]。

果蔬褐變與保護(hù)酶系統(tǒng)有關(guān)[25]，SOD是植物體內(nèi)非常重要的一類保護(hù)酶[42-43]。本研究中，絲瓜儲(chǔ)藏期間褐變發(fā)生，總酚含量逐漸上升，和表達(dá)量分別在采后2 d和采后1 d達(dá)到峰值，SOD酶活性在2 d時(shí)也達(dá)到最大值，其原因可能是低溫儲(chǔ)藏初期導(dǎo)致絲瓜果肉內(nèi)活性氧的大量積累，為維持正常的活性氧水平，和表達(dá)量上調(diào)；之后和表達(dá)量、SOD酶活性降低，推測(cè)采后長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)藏產(chǎn)生的過(guò)量活性氧使絲瓜果實(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷，褐變發(fā)生加劇。在鮮切后25℃條件下，絲瓜總酚含量逐漸上升，在4 h達(dá)到峰值，絲瓜褐變發(fā)生明顯，3個(gè)基因表達(dá)量在鮮切后總體呈下降趨勢(shì)，只有和分別在鮮切2 h時(shí)和鮮切4 h時(shí)表達(dá)量高于采后當(dāng)時(shí)，SOD酶活性略有回調(diào)后逐漸下降，可能是絲瓜鮮切后，家族表達(dá)與酶活性下降，SOD清除活性氧能力逐漸減弱，導(dǎo)致植物體中活性氧的代謝失衡，積累的大量活性氧促進(jìn)褐變發(fā)生。相關(guān)性分析顯示，表達(dá)量均與SOD酶活性呈極顯著正相關(guān)，表達(dá)量均與SOD酶活性呈顯著正相關(guān)，而表達(dá)量與SOD酶活性相關(guān)性不明顯，SOD酶活性在鮮切條件下與總酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)，暗示在鮮切及采后儲(chǔ)藏條件下，和在調(diào)控SOD酶活性方面起作重要作用，和的表達(dá)影響了SOD酶活性，并影響了絲瓜褐變進(jìn)程。已有的研究認(rèn)為，活性氧活性的抑制和活性氧的清除是保護(hù)植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的有效途徑[44]，積累過(guò)多的活性氧會(huì)使細(xì)胞膜過(guò)氧化，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，致使膜系統(tǒng)中區(qū)室化功能喪失，多酚氧化酶與酚類物質(zhì)接觸而發(fā)生酶促褐變[45]。絲瓜果肉褐變可能是多種因素共同作用的結(jié)果，其與PPO等相關(guān)酶活性、酚類物質(zhì)含量、細(xì)胞膜透性、膜脂過(guò)氧化以及絲瓜生理狀態(tài)等有關(guān)，本研究為進(jìn)一步闡明絲瓜褐變機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

此外，SOD的表達(dá)是多種因子共同構(gòu)成的一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[37]。本研究發(fā)現(xiàn)，在絲瓜果實(shí)中，表達(dá)量在3個(gè)中最低，在鮮切及采后儲(chǔ)藏條件下，表達(dá)模式與其他2個(gè)基因存在較大差異，表達(dá)與SOD酶活性之間相關(guān)性不明顯，這可能與的復(fù)雜功能有關(guān)，不同基因家族成員功能不盡相同，絲瓜功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究獲得了3個(gè)絲瓜基因家族cDNA序列，分別命名為、和。全長(zhǎng)758 bp，ORF為456 bp，編碼152個(gè)氨基酸；全長(zhǎng)799 bp，ORF為471 bp，編碼157個(gè)氨基酸；全長(zhǎng)1 011 bp，ORF為663 bp，編碼221個(gè)氨基酸。3個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)均含有一個(gè)保守的SOD結(jié)構(gòu)域，屬于Cu/Zn類SOD超家族，各含有2個(gè)Cu/Zn-SOD信號(hào)序列，不含信號(hào)肽序列，屬于親水性、非跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，編碼的蛋白與南瓜、甜瓜、黃瓜等葫蘆科蔬菜具有較高同源性?；蚣易?個(gè)成員在絲瓜根中的表達(dá)量最高，在花中表達(dá)量最低。在鮮切及采后儲(chǔ)藏條件下，基因家族基因表達(dá)、SOD活性、總酚與絲瓜褐變存在較高相關(guān)性。推測(cè)和在普通絲瓜果肉褐變過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Cloning and Expression Analysis of Copper and Zinc Superoxide DismutaseGene Family from

ZHU HaiSheng, LIU JianTing, CHEN MinDong, LI YongPing, WANG Bin, ZHANG QianRong,YE XinRu, LIN Hui, WEN QingFang

(Crops Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Vegetable Research Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Engineering Research Center for Vegetables, Fuzhou 350013)

【Objective】The aim of this study was to clone thegene family from, investigate their sequence characteristics and analyze their expression in luffa browning. These findings will provide a scientific basis for further revealing the mechanism of luffa browning and lay a practical foundation for the genetic improvement of luffa. 【Method】The cDNA sequences ofgene family were obtained by transcriptome sequencing and RT-PCR. The bioinformatics methods were used to analyze the putative amino acid sequence, and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) method was used to study the expression ofgene family in different tissues and browning conditions. The superoxide dismutase enzyme activity was measured by NBT deoxidization method. The total phenols was measured by folin-cioncaleuc method. 【Result】Three cDNAs ofwere cloned from luffa fruit, in turn being named,and. The cDNA sequence ofwas 758 bp in length, containing a 456 bp opening reading frame(ORF), encoded a polypeptide of 152 amino acids. The cDNA sequence ofwas 799 bp in length, containing a 471 bp ORF, encoded a polypeptide of 157 amino acids. The cDNA sequence ofwas 1 011 bp in length, containing a 663 bp ORF, encoded a polypeptide of 221 amino acids. They shared over 90% identity with the homologous proteins from,and. The bioinformatics analysis showed that three proteins were hydrophilic protein without signal-peptide and transmembrane region, and the Wolf Psort protection indicated that they were located in the cytoplasm. The expression ofgene familywas the highest in root and the lowest in flower. During post-harvest storage, the expression ofandwas up-regulated in the early, and then decreased. The expression levels of three genes were overall down-regulated in fresh-cut luffa fruit. Correlation analysis showed that the expression level ofshowed a extremely significant positive correlation with SOD activity, and the expression level ofshowed a significant positive correlation with SOD activity during fresh-cut and post-harvest storage. SOD activity was significantly and negatively correlated with total phenols content during fresh-cut conditions.andplay an important role in regulating the activity of SOD, and the expression ofandmay influence the activity of SOD and the process of luffa browning.【Conclusion】Three cDNAs ofwere firstly obtained and characterized from luffa fruit,andmay play an important role in luffa browning process.

; browning;; expression analysis; activity of SOD

2017-04-17；接受日期：2017-06-16

福建省自然科學(xué)基金（2015J01118）、福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2017R1026-6）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)PI項(xiàng)目（2016PI-40）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新項(xiàng)目（2015QC-6、PC2017-7）

朱海生，E-mail：zhs0246@163.com。通信作者溫慶放，E-mail：fjvrc@163.com