趙益文，趙佳，龐全海

?

褪黑素對大鼠胰島瘤細胞INS-1胰島素和Gαi/o蛋白基因表達的影響

趙益文1，趙佳2，龐全海1

（1山西農業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2北京大學分子醫(yī)學研究所，北京100871）

【目的】研究褪黑素對大鼠胰島瘤細胞INS-1中胰島素和Gαi/o蛋白基因表達的影響，探究褪黑素在mRNA水平對和1調節(jié)作用中可能存在的分子機制。褪黑素(melatonin, MT)是松果腺分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，在機體內可調節(jié)胰島素的分泌而使其呈現晝夜節(jié)律性分泌，影響葡萄糖晝夜代謝水平的變化進而維持機體血糖的相對恒定，故對于褪黑素影響胰島素表達的研究可能會對褪黑素在胰島素晝夜節(jié)律性分泌中的調控作用提供依據。【方法】將凍存的INS-1細胞復蘇培養(yǎng)至第三代，INS-1細胞傳代后,用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細胞約24—48 h，當細胞密度達60%—70%時，使用無血清無葡萄糖的RPMI1640洗2次，然后在INS-1細胞培養(yǎng)外液中分別加入不同濃度（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的葡萄糖及100 nmol·L-1褪黑素和不同濃度葡萄糖孵育INS-1細胞12 h，觀察和統(tǒng)計INS-1細胞的形態(tài)學變化。利用EasyPure? RNA Kit 提取INS-1細胞的總RNA，核酸蛋白測定儀測定細胞總RNA的濃度和純度，其次利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞的總RNA質量，TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0引物設計軟件，參考GenBank上已登錄的基因序列進行1、12、和引物的設計。應用qRT-PCR法進行檢測處理后的INS-1細胞1、12、和mRNA水平的變化?！窘Y果】用含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液孵育INS-1細胞后，觀察發(fā)現隨著培養(yǎng)基中葡萄糖濃度含量的增加INS-1細胞突觸的增長呈現先增加后減少的趨勢，其中20 mmol·L-1葡萄糖處理組INS-1細胞突觸的增長明顯，而20 mmol·L-1葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素處理組INS-1細胞表面積增大，但突觸增長卻不明顯；培養(yǎng)基中含不同濃度葡萄糖的處理組中，Insulin1 mRNA水平呈現先升后降的趨勢，Gαi1 mRNA水平則呈現先降后升的趨勢，其中20 mmol·L-1葡萄糖處理組，Insulin1 mRNA水平顯著增加（＜0.05），Gαi1 mRNA水平顯著減少（＜0.05），而Gαi2和Gαo則無顯著變化（＞0.05），因而Gαi1表現出與Insulin1 mRNA水平呈現負相關性而非Gαi2、Gαo與Insulin1 mRNA水平呈現負相關性；20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素處理組和20 mmol·L-1葡萄糖處理組相比，20 mmol·L-1葡萄糖和褪黑素處理組的Gαi1 mRNA水平顯著增高（＜0.05），且Insulin1和PKCα mRNA水平顯著減少（＜0.05），PKA mRNA水平則減少不顯著（＞0.05）?！窘Y論】褪黑素能夠抑制INS-1細胞1的表達，減少胰島素的分泌導致INS-1細胞適應性增生。褪黑素與其受體結合后可促進1 mRNA水平增高而抑制的表達，使得1的表達受到抑制，胰島素分泌減少，使血糖在夜間得以維持相對恒定。

褪黑素；INS-1細胞；葡萄糖；胰島素；Gαi/o

0 引言

【研究意義】褪黑素（melatonin, MT）是由松果腺（pineal gland）分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，由于其具有良好的水溶性和脂溶性，故可以通過各種膜結構進入細胞器而發(fā)揮作用[1]。MT在機體內可調節(jié)胰島素（insulin）分泌，使其呈晝夜節(jié)律性分泌進而影響葡萄糖晝夜代謝水平的變化，維持機體血糖的相對恒定[2-3]，還可在一定程度上改善糖尿病的后遺癥[4]。MT對胰島素晝夜節(jié)律性分泌作用的發(fā)揮是通過Gi蛋白調節(jié)其下游的cAMP[5]、cGMP[6-7]水平而實現的。Gαi/o蛋白有多種亞型，不同亞型在胰島素分泌的不同方面起著調節(jié)作用。Gαi2/3可抑制腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase, AC）的活性，Gαo1抑制L型Ca2+通道，Gαi1、Gαi2、Gαi3及 Gαo2還可在胰島素釋放時發(fā)揮抑制作用[8-9]。研究MT對INS-1細胞胰島素和Gαi/o蛋白表達的影響可從mRNA水平上闡明其作用機制，對進一步探討胰島素晝夜節(jié)律性分泌具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】VAN CAUTER[10]等研究發(fā)現，夜晚攝入食物后血漿糖濃度相較于清晨會顯著升高，而胰島素的敏感性及β細胞對葡萄糖的響應能力則低于清晨，呈現晝夜節(jié)律的特性。然而當消除這種亮暗晝夜差異使其一直處于暗環(huán)境下并保持清醒狀態(tài)時，血漿糖濃度水平在早晚所表現的這種節(jié)律性就會極大程度的減弱[11]，晝夜節(jié)律系統(tǒng)與葡萄糖代謝極其相關[12-14]，晝夜節(jié)律性一旦被打亂則有可能會導致糖尿病的發(fā)生[15-16]。PESCHKE等[17]和BODEN等[2]研究均表明，在白天血漿中胰島素的濃度升高，夜晚胰島素的濃度降低，而血漿中褪黑素濃度的變化則與胰島素相反?；诖耍S多學者研究了MT對胰島素分泌的影響。SRINIVASAN等[18-19]研究發(fā)現，MT可抑制胰腺β細胞胰島素的分泌，提高胰島素的敏感性。BONNEFOND等[20-21]等的研究表明MT受體基因與二型糖尿病密切相關，可能有利于二型糖尿病的治療。而MT對胰島素的這種調節(jié)作用可能是通過Gαi/o蛋白來實現的[5-7]。然而，也有一些在體以及離體[22-23]的研究表明，MT可促進β細胞胰島素的分泌?！颈狙芯壳腥朦c】對于在mRNA水平上MT調控1和表達的作用機制，目前在國內外鮮有報道，MT在胰島素分泌的晝夜節(jié)律性中的作用也尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過在INS-1細胞培養(yǎng)外液中加入不同濃度的MT，觀察和統(tǒng)計INS-1細胞形態(tài)學變化及1、12、和表達的變化，揭示MT調控胰島素和Gαi/o蛋白基因表達的作用機制，為進一步探討MT在胰島素分泌的晝夜節(jié)律性中的作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

本試驗于2015年12月至2016年9月在北京大學分子醫(yī)學研究所細胞分泌與代謝實驗室進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基（ThermoFisher）；胎牛血清（FBS）（Gibco）；丙酮酸鈉（Sigma）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；β巰基乙醇（Gibco）；褪黑素（Solarbio）；D-(+)-葡萄糖（Sigma）；EasyPure? RNA Kit（TRANSGEN）；HotMaster DNA polymerase（TIANGEN）；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix （TIANGEN）；其他常用試劑均為國產分析純。

1.2.2 試驗材料 大鼠胰島瘤細胞系（INS-1）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)。將大鼠胰島瘤細胞INS-1培養(yǎng)于含10%的新生胎牛血清、1%的丙酮酸鈉、1‰ β-巰基乙醇的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 試驗方法

1.3.1 INS-1細胞培養(yǎng) 將凍存的INS-1細胞自液氮罐中取出后放入37℃水浴，搖晃使其盡快融化。融化后用移液槍移入無菌離心管，加10倍體積培養(yǎng)液，混勻，1 000 r/min-1離心8 min，去上清，加少量新鮮培養(yǎng)液，將沉淀細胞吹打成細胞懸液，按1×105密度接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)箱孵育24 h使細胞復蘇，48 h換液，培養(yǎng)至第4天即可進行傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)至第三代即可用其進行后續(xù)試驗。

1.3.2 INS-1細胞的刺激試驗 將生長良好的INS-1細胞進行傳代，以1×105/24cm2密度接種于細胞培養(yǎng)皿，約24—48 h后細胞密度達60%—70%，使用無血清無葡萄糖的RPMI1640洗兩次：

（1）換用無血清含不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的RPMI1640刺激12 h，提取總RNA；

（2）換用無血清含100 nmol·L-1褪黑素[5]及不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的RPMI1640刺激12 h，提取總RNA。

1.3.3 cDNA合成 按照 EasyPure? RNA Kit試劑盒操作說明提取總RNA，核酸蛋白測定儀ND-1000（Thermo）測定總RNA的濃度和純度。0.9%—1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量。利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒合成cDNA，采用20 μL反應體系：Total RNA 1 μL，Anchored Oligo(dT)18Primer 1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TS Enzyme Mix1 μL，gDNA Remover1μL，RNase-free Water 6 μL；反應條件：42℃ 30 min，85℃ 5 min；反轉錄產物可于-20℃長期保存。

1.3.4 引物設計與合成 利用Primer Premier 5.0引物設計軟件，參考GenBank上已登錄的1、2、、1、、和序列，設計7對特異性引物，由北京華大科技有限公司合成（表1）。

1.3.5 qRT-PCR 利用HotMaster DNA polymerase進行反應，每個樣本設3次重復，另加3個無模板陰性對照。25 μL反應體系：ddH2O 18.25 μL，10×HotMaster Taq Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol?L-1）1 μL，5×SYBR 1 μL，正反向引物（10 μmol?L-1）各0.5 μL，HotMaster DNA polymerase 0.25 μL，cDNA模板1.0 μL。反應條件：95℃ 10 s；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s，溶解曲線；4℃ forever。根據熒光曲線的CT值計算定量結果。

1.4 圖像分析與數據處理

實驗數據用Excel 2013進行基本統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 6軟件進行圖形繪制，結果均用“平均值±標準差（Means±SD）”表示，全部數據采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析檢驗。

2 結果

2.1 褪黑素及葡萄糖對INS-1細胞形態(tài)學影響

將INS-1細胞分為5組，每組用不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的培養(yǎng)液進行孵育，12 h后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，發(fā)現隨著葡萄糖濃度的增加，INS-1細胞表面積沒有明顯變化，但細胞突觸的增長呈現先增加后減少的趨勢，表現為貼壁細胞生長特征（圖1-A-E）。此外，在用不同濃度葡萄糖處理的基礎上加入100 nmol·L-1MT處理細胞12 h，分別對比加入MT前后INS-1細胞的變化，可見在20 mmol·L-1葡萄糖處理組細胞突觸增長最為明顯，而加入MT后細胞突觸增長不明顯，但細胞表面積明顯增大（圖1-C、H、K）。其他葡萄糖濃度與MT處理組細胞形態(tài)則沒有明顯變化（圖1-A-K）。

2.21抑制INS-1細胞1的表達

為了篩選出與1表達相關的Gαi/o蛋白，將INS-1細胞分別用0、10、20、30、50 mmol·L-1葡萄糖和MT處理后，檢測了12、及1基因的表達水平（圖2-A-F）。如圖2所示，1的表達水平在不同濃度葡萄糖處理組表現為先升后降的趨勢，其中在20 mmol·L-1葡萄糖處理組表達顯著升高（＜0.05），而加入MT處理后1在各濃度葡萄糖處理組的表達水平均無顯著差異（＞0.05）。1的表達水平在不同濃度葡萄糖處理組表現為先降后升的趨勢，其中在20 mmol·L-1葡萄糖處理組表達顯著降低（＜0.05），而加入MT處理后1在各濃度葡萄糖處理組的表達水平亦均無顯著差異（＞0.05）（圖2-A、D）。2在10 mmol·L-1葡萄糖處理組表達水平顯著降低（＜0.05），加入MT處理后2在10 mmol·L-1葡萄糖處理組表達水平降低極顯著（＜0.01）（圖2-B、E）。的表達水平在MT處理前后均無顯著差異（＞0.05）（圖2-C、F）。此外，分別統(tǒng)計對比了在MT處理前和處理后12、及1在葡萄糖各濃度處理組的表達水平，20 mmol·L-1葡萄糖處理組1表達水平在MT處理后較處理前顯著增加（＜0.05）（圖2-G），1表達水平在MT處理后較處理前顯著減少（＜0.05）（圖2-I），其他組在MT處理前后無顯著差異（＞0.05）（圖2-G-J）。

2.3 褪黑素抑制INS-1細胞1的表達

為了進一步探究MT與1間的相互作用關系，筆者分別檢測了20 mmol·L-1葡萄糖處理INS-1細胞及20 mmol·L-1葡萄糖和MT同時處理INS-1細胞時1的表達水平并將兩者進行對比，結果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖處理INS-1細胞時，1表達水平顯著降低（＜0.05），加入MT處理INS-1細胞時，1表達水平無顯著差異（＞0.05），但MT處理組1表達水平顯著高于只有20 mmol·L-1葡萄糖處理組（＜0.05）（圖3-A）。此外為了篩選MT抑制1表達相關的蛋白激酶，分別檢測了20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1、的表達水平，結果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1和表達水平顯著降低（＜0.05），表達水平則無顯著差異（＞0.05）（圖3-B）。

表1 基因引物序列

3 討論

3.1 褪黑素抑制INS-1細胞增殖及1的表達

褪黑素是松果腺在夜間產生的一種胺類激素，光的刺激會抑制其分泌，并且MT作為晝夜節(jié)律性的周期信號，對機體的晝夜節(jié)律性的周期調節(jié)極其重要[24]。近年來許多研究均表明，MT對β細胞胰島素分泌的晝夜節(jié)律具有調節(jié)作用[5-7]，并可抑制β細胞胰島素的分泌[5,18-19,25]，但在mRNA水平上MT對胰島素表達的影響卻未見有報道。本試驗中用不同濃度葡萄糖（0、10、20、30、50 mmol·L-1）的培養(yǎng)液孵育INS-1細胞，隨著葡萄糖濃度的增加INS-1細胞突觸的增長呈現先增加后減少的趨勢，與ZHANG等[26]報道的高濃度葡萄糖抑制INS-1細胞增長低濃度葡萄糖促進INS-1細胞增長相一致，表現為貼壁細胞生長特征（圖1-A-E），且20 mmol·L-1葡萄糖處理組細胞突觸增長最為明顯。然而，加入100 nmol·L-1MT處理INS-1細胞后，20 mmol·L-1葡萄糖及MT處理組突觸增長不明顯，細胞表面積卻明顯增大（圖1-C、H），結合兩組1的表達水平，20 mmol·L-1葡萄糖處理組1表達顯著增加，20 mmol·L-1葡萄糖及MT處理組1表達增加不顯著，且相較于20 mmol·L-1葡萄糖處理組1表達顯著降低（圖2），由此可知，20 mmol·L-1葡萄糖可促進INS-1細胞胰島素的分泌并可促進細胞的增殖，當加入MT后，MT抑制了1的表達，胰島素分泌減少[27]，葡萄糖刺激INS-1細胞導致其適應性增生[28]。如上分析說明，MT能夠抑制INS-1細胞的增殖，并可抑制INS-1細胞1的表達，減少胰島素的分泌，導致INS-1細胞的增生。

3.2 褪黑素通過1抑制INS-1細胞1的表達

有研究顯示， MT對胰島素晝夜節(jié)律性分泌作用的發(fā)揮是通過Gi蛋白來實現的[5-7]，但Gαi/o抑制型蛋白有多種亞型，MT是通過何種Gi蛋白抑制胰島素分泌的目前尚未有明確報道。為了篩選出與1表達相關的Gαi/o蛋白，本試驗首先檢測了1及Gαi/o蛋白各亞型12的表達水平，統(tǒng)計比較了1與Gαi/o抑制型蛋白各基因表達水平的相關性。試驗結果顯示，的表達水平在20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組均無顯著差異（圖2-C、F），表明與MT抑制1的表達無關。2雖然在10 mmol·L-1葡萄糖處理組及10 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組表達水平均有顯著性降低，但10 mmol·L-1葡萄糖處理組及10 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1表達水平卻無顯著性差異（圖2-B、E），亦表明2與MT抑制1的表達無關。試驗中1的表達水平在不同濃度葡萄糖處理組表現為先降后升的趨勢，1的表達水平表現為先升后降的趨勢，其中在20 mmol·L-1葡萄糖處理組1的表達顯著升高，1表達顯著降低，而加入MT處理后，1和1在各濃度葡萄糖處理組的表達水平均無顯著差異（圖2-A、D），而且1表達水平在MT處理后較處理前顯著增加，1表達水平則顯著減少，表明MT對1具有上調作用對1具有下調作用，由此表明，1與MT抑制1的表達不僅具有相關性且可抑制1的表達，而這種抑制作用可能是由于葡萄糖刺激INS-1細胞胰島素分泌時，1可在一定程度上抑制細胞外液胰島素濃度的上升以使其不至于升高過猛[29]。

A—C. 葡萄糖處理Insulin1和Gαi1 (A), Gαi2 (B), Gαo (C)表達水平；D—F. 葡萄糖和100 nmol·L-1褪黑素處理Insulin1和Gαi1(D), Gαi2 (E), Gαo (F)表達水平；G-J.褪黑素處理前后Gαi1(G), Gαi2 (H), Insulin1(I), Gαo (J)表達水平對比；ns表示無顯著差異；*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

A. 褪黑素促進Gαi1的表達；B. 褪黑素處理Insulin1、PKA、PKCα表達水平

以上試驗證明了1可抑制1的表達，而MT亦可抑制1的表達，為了進一步驗證MT是否通過1而抑制1的表達，本試驗檢測了20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組INS-1細胞1表達水平的變化并將兩者進行對比，結果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖處理組，1表達水平顯著降低，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組，1表達水平無顯著差異，而20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1的表達水平則顯著高于20 mmol·L-1葡萄糖處理組（圖3-A），由此表明，MT可促進1的表達。

以上分析說明，1抑制INS-1細胞1的表達，MT促進INS-1細胞1的表達，而MT可抑制INS-1細胞1的表達，綜上可知，MT可通過促進抑制型G蛋白1的表達從而抑制INS-1細胞1的表達，抑制胰島素的分泌。

3.31通過抑制INS-1細胞1的表達

Gi蛋白可調節(jié)MT對胰島素晝夜節(jié)律性的分泌，而這種調節(jié)作用的發(fā)揮是通過其下游cAMP[5]、cGMP[6-7]、PKA和PKC[30]等實現的。為了篩選MT抑制1表達相關的蛋白激酶，本試驗檢測了20 mmol·L-1葡萄糖處理組及20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1、的表達水平，結果顯示，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1和表達水平顯著降低，表達水平則無顯著差異（圖3-B），表明表達水平的降低可抑制1的表達。此外，20 mmol·L-1葡萄糖和MT處理組1、和1的表達水平與20 mmol·L-1葡萄糖處理組相比，1表達水平顯著增高，和1表達水平顯著降低（圖3），表明1表達水平的增高可抑制的表達。如上分析說明，加入MT處理INS-1細胞后，1表達水平增高，抑制了的表達，進而抑制了1的表達，由此表明1是通過來抑制INS-1細胞1表達的。

3.4 褪黑素抑制INS-1細胞1表達模式圖

MT在機體內可調節(jié)胰島素的分泌，使其呈晝夜節(jié)律性分泌進而影響葡萄糖晝夜代謝水平的變化，維持機體血糖的相對恒定[2-3]。夜晚胰腺β細胞分泌的胰島素對MT非常敏感，胰島素或MT稍有變動就有可能發(fā)生糖尿病的風險[27]。有研究報道，葡萄糖在體內代謝后通過cAMP信號通路激活PKA蛋白激酶，促進胰島素的分泌，而MT可作用于Gi蛋白抑制腺苷酸環(huán)化酶（Adenylyl cyclase）的活性進而抑制cAMP的產生，從而抑制胰島素的分泌[17,30]。本試驗中首先檢測了MT確實對葡萄糖誘導的1表達具有抑制作用（圖4），與前人報道相符[18-19,30]。其次，本試驗對與1表達抑制相關的抑制型Gαi/o蛋白進行了篩選，結果表明1表達的抑制與1的表達相關而與和2的表達無關（圖2-A、D），且1可抑制1的表達。再次，本試驗檢測并對比了葡萄糖組及葡萄糖和MT組INS-1細胞1表達水平，結果表明MT可促進INS-1細胞1的表達（圖3-A）。本試驗檢測了和蛋白激酶與1和1間的相互關系，發(fā)現1可抑制的表達進而抑制1的表達（圖3-B）。以上分析表明，MT與MT受體結合后會促進與之偶聯的1蛋白的表達，1的表達水平增高會抑制的表達，進而使得1的表達受到抑制，胰島素分泌減少，使血糖在夜間得以維持相對恒定。

Melatonin：褪黑素；MT1-R：褪黑素受體1；MT2-R：褪黑素受體2；Adenylyl cyclase：腺苷酸環(huán)化酶；cAMP：環(huán)化腺核苷一磷酸；PKA：蛋白激酶A；PKCα：蛋白激酶Cα；Glucose：葡萄糖；Metabolism：代謝

4 結論

褪黑素能夠抑制INS-1細胞1的表達，減少胰島素的分泌，進而導致INS-1細胞適應性增生。夜間松果腺分泌的褪黑素與其受體結合后，可促進褪黑素受體偶聯的抑制型Gαi1蛋白的表達，1的表達水平增高會抑制的表達，進而使得1的表達受到抑制，胰島素分泌減少，使血糖在夜間得以維持相對恒定。

References

[1] 高超, 田秀芝, 張璐, 徐靜, 汪鋒, 卓志勇, 戴蘊平, 劉國世.外源褪黑素對牛卵母細胞體外成熟的影響. 中國農業(yè)科學, 2011, 44(17): 3634-3640.

GAO C, TIAN X Z, ZHANG L, XU J, WANG F, ZHUO Z Y, DAI Y P, LIU G S. Effect of exogenous melatonin (MT) in bovine oocytematuration., 2011, 44(17):3634-3640. (in Chinese)

[2] BODEN G, RUIZ J, URBAIN J L, CHEN X. Evidence for a circadian rhythm of insulin secretion., 1996, 271(2):E246-E252.

[3] GUARDIOLA-LEMAITRE B. Toxicology of melatonin., 1997, 12(6):697-706.

[4] CARDINALI D P, CANO P, JIMENEZ-ORTEGA V, ESQUIFINO A I. Melatonin and the metabolic syndrome: physiopathologic and therapeutical implications., 2011, 93(3):133-142.

[5] PICINATO M C, HABER E P, CIPOLLA-NETO J, CURI R, CARVALHO C R D O, CARPINELLI A R. Melatonin inhibits insulin secretion and decreases PKA levels without interfering with glucose metabolism in rat pancreatic islets., 2002, 33(3): 156-160.

[6] STUMPF I, MUHLBAUER E, PESCHKE E. Involvement of the cGMP pathway in mediating the insulin-inhibitory effect of melatonin in pancreatic beta-cells., 2008, 45(3):318-327.

[7] STUMPF I, BAZWINSKY I, PESCHKE E. Modulation of the cGMP signaling pathway by melatonin in pancreatic beta-cells., 2009, 46(2):140-147.

[8] SHARP G W. Mechanisms of inhibition of insulin release., 1996, 271(6): C1781-C1799.

[9] STRAUB S G, SHARP G W G. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins., 2012, 302(12): C1687-C1698.

[10] VAN CAUTER E, POLONSKY K S, SCHEEN A J. Roles of circadian rhythmicity and sleep in human glucose regulation 1., 1997, 18(5): 716-738.

[11] SHEA S A, HILTON M F, ORLOVA C, TIMOTHY AYERS R, MANTZOROS C S. Independent circadian and sleep/wake regulation of adipokines and glucose in humans., 2005, 90(5): 2537-2544.

[12] QIAN J, SCHEER F A J L. Circadian system and glucose metabolism: Implications for physiology and disease., 2016, 27(5): 282-293.

[13] MORRIS C J, YANG J N, SCHEER F A J L. The impact of the circadian timing system on cardiovascular and metabolic function., 2012, 199: 337.

[14] MORRIS C J, YANG J N, GARCIA J I, MYERSA S, BOZZIA I, WANGA W, BUXTONA O M, SHEAA S A, SCHEER F A J L. Endogenous circadian system and circadian misalignment impact glucose tolerance via separate mechanisms in humans., 2015, 112(17): E2225-E2234.

[15] SCHEER F A, HILTON M F, MANTZOROS C S, SHEA S A. Adverse metabolic and cardiovascular consequences of circadian misalignment., 2009, 106(11):4453-4458.

[16] PESCHKE E, B?HR I, MüHLBAUER E. Experimental and clinical aspects of melatonin and clock genes in diabetes., 2015, 59(1): 1-23.

[17] PESCHKE E. Melatonin, endocrine pancreas and diabetes., 2008, 44: 26-40.

[18] SRINIVASAN V, OHTA Y, ESPINO J, PARIENTE J A, RODRIGUEZ A B, MOHAMED M, ZAKARIA R. Metabolic syndrome, its pathophysiology and the role of melatonin., 2013, 7(1): 11-25.

[19] ZANUTO R, SIQUEIRA-FILHO M A, CAPERUTO L C, BACURAU R F, HIRATA E, PELICIARI-GARCIA R A, DO AMARAL F G, MAR?AL A C, RIBEIRO L M, CAMPOREZ J P, CARPINELLI A R, BORDIN S, CIPOLLA-NETO J, CARVALHO C R. Melatonin improves insulin sensitivity independently of weight loss in old obese rats., 2013, 55(2):156-165.

[20] BONNEFOND A, CLéMENT N, FAWCETT K, YENGO L, VAILLANT E, GUILLAUME J L, DECHAUME A, PAYNE F, ROUSSEL R, CZERNICHOW S, HERCBERG S, HADJADJ S, BALKAU B, MARRE M, LANTIERI O, LANGENBERG C, BOUATIA-NAJI N. Rare MTNR1B variants impairing melatonin receptor 1B function contribute to type 2 diabetes., 2012, 44(3): 297-301.

[21] GAULTON K J, FERREIRA T, LEE Y, Raimiondo A, M?gi R. Genetic fine mapping and genomic annotation defines causal mechanisms at type 2 diabetes susceptibility loci., 2015, 47(12): 1415-1425.

[22] COSTES S, BOSS M, THOMAS A P, MATVEYENKO A V. Activation of melatonin signaling promotes β-cell survival and function., 2015, 29(5): 682-692.

[23] RUBIO-SASTRE P, SCHEER F A, GóMEZ-ABELLáN P, MADRID J A, GARAULET M. Acute melatonin administration in humans impairs glucose tolerance in both the morning and evening., 2014, 37(10): 1715-1719.

[24] MORRIS C J, AESCHBACH D, SCHEER F A J L. Circadian system, sleep and endocrinology., 2012, 349(1): 91-104.

[25] MüHLBAUER E, ALBRECHT E, HOFMANN K, BAZWINSKY- WUTSCHKE I, PESCHKE E. Melatonin inhibits insulin secretion in rat insulinoma β-cells (INS-1) heterologously expressing the human melatonin receptor isoform MT2., 2011, 51(3): 361-372.

[26] ZHANG Z, LI J, JIANG X, LEI Y, LEI L, DE H C, HUA Z, HONG C. GLP-1 ameliorates the proliferation activity of INS-1 cells inhibited by intermittent high glucose concentrations through the regulation of cyclins., 2014, 10(2): 683-688.

[27] TUOMI T, NAGORNY C L F, SINGH P, ET A L. Increased melatonin signaling is a risk factor for type 2 diabetes., 2016, 23: 1067-1077.

[28] HULL R L, KODAMA K, UTZSCHNEIDER K M, CARR D B, PRIGEON R L, KAHN S E. Dietary-fat-induced obesity in mice results in beta cell hyperplasia but not increased insulin release: evidence for specificity of impaired beta cell adaptation., 2005, 48(7): 1350-1358.

[29] HELLMAN B, GRAPENGIESSER E. Glucose-induced inhibition of insulin secretion., 2014, 210(3): 479-488.

[30] SHARMA S, SINGH H, AHMAD N, PRIYANKA M, ARCHANA T. The role of melatonin in diabetes: therapeutic implications., 2015, 59(5): 391-397.

（責任編輯 林鑒非）

Effect of Melatonin onandExpression in Rat Insulinoma Cell Line

ZHAO Yiwen1, ZHAO Jia2, PANG Quanhai1

(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2Institute of Molecular Medicine, Peking University, Beijing 100871)

【Objective】To demonstrate the role of melatonin in the circadian secretion of insulin, the effect of melatonin onandexpression in rat insulinoma cell line (INS-1) and molecular mechanism were studied. As melatonin can regulate insulin secretion in a circadian manner, maintaining a homeostasis of blood glucose by regulating diurnal glucose metabolism, thus study on the effect of melatonin on expression of insulin may provide a basis for regulation of melatonin in circadian secretion of insulin.【Method】The cryopreserved INS-1 cells were passaged for at least three generations. After the passage of cells, INS-1 cells were cultured in RPMI1640 medium for about 24-48 h. When the cell confluency reached 60%-70%, washed with RPMI1640 without serum and glucose for two times. INS-1 cells were cultured in media supplemented with different concentrations of glucose(0, 10, 20, 30, and 50 mmol·L-1) and 100 nmol·L-1melatonin for 12 h treatment, then observation of morphological changes of INS-1 cells and statistical analysis were performed. The total RNA extracted from INS-1 cells by Easypure RNA kit, measuring the cells total RNA concentration and purity, then the quality of total RNA was measured by formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresis. TranScript One-step Removal and Synthesis Supermix were used to synthesize cDNA by reverse transcription. Primer Premier 5.0 primer design software, reference gene sequence of GenBank were used to design primers. qRT-PCR was used to detect the changes of1,1,2,,andinmRNA level.【Result】After incubation of INS-1 cells with different concentrations of glucose, it was observed that the growth of cell synapse first increased and then decreased along with the increase of the concentration of glucose in the culture medium. In the 20 mmol·L-1glucose treatment group, the synaptic growth of INS-1 cells was increased significantly; in the 20 mmol·L-1glucose and melatonin co-treatment group, the area of INS-1 cells was increased, but the synaptic growth was not obvious. In the glucose treatment group, the mRNA level of1 showed a trend of increase and then reduction, especially was increased at 20 mmol·L-1(＜0.05). The mRNA level of1 showed a trend of reduction and then increase, especially was reduced at 20 mmol·L-1(＜0.05). The mRNA level of2 andwas not significantly reduced (＞0.05). Thus,1 but not2 andshowed a negative correlation with1 mRNA level. Compared with 20 mmol·L-1glucose treatment group, the mRNA level of1 was significantly increased (＜0.05) at 20 mmol·L-1glucose and melatonin co-treatment group, the mRNA level of1 andα was significantly reduced (＜0.05), whereas the mRNA level ofwas not significantly reduced (＞0.05).【Conclusion】Melatonin inhibits the expression of1 in INS-1 cells and reduces insulin secretion resulting in the adaptive hyperplasia of INS-1 cells. The binding of melatonin to its receptor can promote the increase of1 mRNA levels and inhibit the expression of, which leads to the inhibited expression of1 and decreased insulin secretion, so that blood glucose remains homeostatic during the night.

melatonin; INS-1 cells; glucose; insulin; Gαi/o

2017-03-21；接受日期：2017-06-28

國家重點研發(fā)計劃（30972223，31272628）

趙益文，E-mail:yiwenz1103@163.com