閆青地，趙亞林，張昊，高靜，高夢燭，王倩，王蕊，王鳳茹，董金皋

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擬南芥僅含START結構域亞家族基因特性與功能分析

閆青地，趙亞林，張昊，高靜，高夢燭，王倩，王蕊，王鳳茹，董金皋

（河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/河北省植物生理和分子病理學重點實驗室，河北保定071001）

【目的】分析擬南芥中僅含START結構域（the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains）亞家族成員的啟動子元件及表達特性，闡明啟動子元件與表達特性的相互關系，為明確僅含START結構域亞家族的生物學功能，解析植物生長發(fā)育機理、更好地促控植物生長提供理論依據(jù)。【方法】利用生物信息學方法分析僅含START結構域亞家族6個成員的親緣關系及各自啟動子區(qū)所包含的所有元件，對啟動子元件的功能進行分析和分類；利用real-time PCR方法研究亞家族成員的表達特性；用突變體分析確認基因的功能；分析通過啟動子元件分析預測的基因功能與通過突變體分析確認的基因功能間的相關性，為基因的功能和作用機制分析提供科研思路和方法?！窘Y果】生物信息學分析表明，擬南芥中僅含START結構域亞家族成員共6個，分為3個分支，每個分支一對基因，每一對基因中均有一個基因的啟動子中含有高轉錄水平元件5′ UTR Py-rich stretch，6個亞家族成員的啟動子區(qū)均含有多個光、激素和逆境響應元件，也存在各自特異的響應元件；用real-time PCR分析基因的表達量，結果與生物信息學預測結果一致：At3g13062的表達量明顯高于同分支的At1g55960，At3g23080的表達量明顯高于同分支的At4g14500，At1g64720的表達量明顯高于同分支的At5g54170。組織定位分析表明亞家族成員有特異的時空表達特性：At3g13062和At1g55960在幼苗期就有明顯表達，但At3g13062主要在子葉、下胚軸和根中表達，而At1g55960主要在根中表達量較多；在成苗期擬南芥中，At3g13062主要在葉片中表達，在根中表達量較少；而At1g55960在成苗期擬南芥的葉片和根系的表達量均較多；At3g23080和At4g14500在幼苗期表達量較少，而在成苗期表達量增加，At3g23080主要分布于蓮座葉中，At4g14500主要分布于蓮座葉葉柄部。上述結果表明僅含START結構域亞家族成員可能在擬南芥不同時期和不同的部位分別行使著功能。利用生物信息學對啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，各個基因均具有胚乳特意表達的Skn-1 motif元件，暗示著該家族基因可能參與調控胚乳的發(fā)育，進而影響種子的活力和萌發(fā)；通過對At3g23080和At4g14500的T-DNA插入突變體種子的分析表明，At3g23080和At4g14500表達量下降均會導致種子活力和萌發(fā)率的下降，這與生物信息學預測結果一致?！窘Y論】擬南芥中僅含START結構域的亞家族有6個成員；6個亞家族成員可能在光、激素和逆境調控的發(fā)育過程中具有重要的作用；含START結構域的亞家族6個成員雖然同源關系較近，但具有各自的時空表達特性，在擬南芥的不同組織和不同發(fā)育時期執(zhí)行著各自的功能?；騿幼釉c基因功能有直接關系，啟動子區(qū)具有胚乳特意表達Skn-1 motif元件的At3g23080和At4g14500表達量下降均會導致種子活力和萌發(fā)率下降。

擬南芥；START結構域；啟動子元件；表達特性；基因功能

0 引言

【研究意義】動物中，含START（the lipid/sterol- binding StAR-related lipid transfer protein domains）結構域的蛋白質參與磷脂運輸和脂質代謝，與疾病的發(fā)生密切相關。但植物中START結構域的功能還不十分清楚。以編碼僅含START結構域蛋白質的基因為研究對象，檢測其表達特性、分析START結構域在進化中的地位，對解析植物生長發(fā)育機理、更好地促控植物生長發(fā)育具有重要的理論價值?！厩叭搜芯窟M展】START結構域最早在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，可以和脂類或甾醇類物質結合轉運脂類物質[1]。哺乳動物中START結構域的晶體結構形成一個疏水腔，可結合一個單一配體[2]。結合的配體有固醇、膽固醇、羥基膽固醇、磷脂、鞘脂等[3]，最近研究發(fā)現(xiàn)，START5蛋白還可以結合膽汁酸[4]，因此，START結構域在這些配體的轉運過程中至關重要。人類基因組編碼15個含START結構域的蛋白質，一些與疾病的發(fā)生密切相關，如STARD1決定遺傳疾病先天性類脂性腎上腺增生，研究發(fā)現(xiàn)，先天性類脂性腎上腺增生病人是START1蛋白的氨基酸發(fā)生了變化影響了START結構域的功能造成的[5]；START2（磷脂酰膽堿轉運蛋白，phosphalidylcholine transfer protein，PCTP）是可轉運膽固醇到線粒體內膜的類固醇類調節(jié)蛋白[6]；START11（ceramide transfer protein，CERT）神經(jīng)酰胺轉運蛋白，可以通過其START結構域來運輸神經(jīng)酰胺[7]。植物中存在大量的含START結構域的蛋白質，大部分成員屬于植物特有的HD-ZIP（homeodomain leucine zipper）轉錄因子家族[8]。擬南芥（）中含21個HD-ZIP START結構域的轉錄因子，在維管束發(fā)育、分生組織形成和極性建成等過程中起著重要的作用（如GL2[9]、ANL2[10]、PDF2[11]、ATML1[11]、FWA[12]、PHV[13]、PHB[14]、ATHB-8[15-16]、REV[17]等）。START結構域在這些轉錄因子中的作用類似于動物中的甾醇類激素受體，通過結合脂類或甾醇類物質來調控轉錄過程[18]。在HD-ZIP START家族成員GL2的功能研究中，發(fā)現(xiàn)START結構域對GL2的轉錄因子活性是必需的[4]。用老鼠和擬南芥中ATML1的START結構域替代GL2的START結構域后，可以恢復GL2的功能，說明START結構域的功能是保守的[4]；用動物和植物中的START結構域替代酵母中的START結構域，均可刺激轉錄因子的活性，START雖然能激活轉錄因子，但與傳統(tǒng)的轉錄激活域不同，其激活活性只有在轉錄因子的激活域也存在時才發(fā)揮作用[4]。雖然用小鼠的START結構域和擬南芥ATML1中的START結構域替代擬南芥GL2中的START結構域，功能可以互補替代，但用EDR2和REV中的START結構域替代GL2中START結構域則不能回復GL2的表型，說明START結構域的功能依賴于其編碼結構域的序列[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在動物、植物和微生物中，START結構域均通過與配體的結合調控轉錄活性[20]?！颈狙芯壳腥朦c】植物中含START結構域的家族除了定位于細胞核中的HD-ZIP START家族外，還有只含有START結構域的含跨膜片段的成員，如At3g13062、At1g55960、At3g23080、At4g14500、At5g54170、At1g64720編碼的蛋白，這些蛋白僅含START結構域，其功能未知。START結構域具有磷脂酰膽堿結合位點，磷脂酰膽堿是細胞膜的主要成分，推測其在細胞膜穩(wěn)定性方面具有重要作用?！緮M解決的關鍵問題】通過解析編碼僅含START結構域蛋白亞家族基因的順式作用元件，預測蛋白質的功能；利用遺傳學方法確定順式作用元件啟動的START結構域的功能；闡明順式作用元件和基因功能間的關系，為基因功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2014年3月至2017年4月在河北省植物生理和分子病理學重點實驗室完成。

1.1 試驗材料

哥倫比亞野生型擬南芥（Col-0）由河北省植物生理和分子病理學重點實驗室保存。

培養(yǎng)條件：光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度為150 μmol·m-2·s-1，溫度為22℃，相對濕度為50%—60%。

大腸桿菌（）感受態(tài)DH5、T載體PMD19-T Vector均購自北京全式金生物技術有限公司（http://www.transgen.com.cn/）；根癌農(nóng)桿菌（）GV3101，pCAMBIA 1381z植物組織定位載體由河北農(nóng)業(yè)大學分子和植物病理學實驗室保存。

1.2 生物信息學分析

基因的啟動子作用元件、保守域及結合位點通過Plant CARE、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）及TAIR網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org）進行分析。

1.3 基因表達分析

參照北京全式金生物技術有限公司SYBR Green Real-time PCR Super Mix（AQ141）步驟進行。使用熒光定量PCR儀（伯樂IQ5M）進行PCR反應。反應程序為94℃30 s；94℃5 s，55℃15 s，72℃10 s，40個循環(huán)；72℃7 min。所用引物見表1。

1.4 基因組織定位分析

在TAIR網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/）獲得目的基因起始密碼子ATG上游約1 500 bp序列，根據(jù)組織定位載體pCAMBIA 1381z酶切位點及目的基因啟動子序列的可用酶切位點，用Primer 5.0設計目的基因啟動子引物。以野生型擬南芥DNA為模板擴增目的基因的啟動子序列；將其與組織定位載體pCAMBIA 1381z連接；連接后用花絮侵染轉化擬南芥，經(jīng)GUS染色、無水乙醇脫色，顯微鏡下觀察目的基因的組織定位情況。

1.5 花絮侵染法轉化野生型擬南芥及純合株系的篩選

接種含有組織定位載體的農(nóng)桿菌于60 mL YEB液體培養(yǎng)基（含100 g·mL-1Kan，100 g·mL-1Rif）中，28℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長晚期；按1﹕50的比例轉接到200 mL YEB培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.6；5 000 r/min，離心15 min，收集菌體；重懸于轉化介質（5%蔗糖，0.02% silwet L-77），待OD600≈0.6時，將擬南芥花蕾在滲透緩沖液中浸泡30 s，平放，遮光保濕培養(yǎng)24 h，然后置擬南芥于培養(yǎng)室中繼續(xù)正常培養(yǎng)；成熟后，收獲擬南芥種子；將擬南芥種子播種于潮霉素抗性篩選平板上，篩選3代，獲得純合株系。

1.6 基因的組織定位分析

選取目的基因啟動子-GUS載體轉基因幼苗和成熟植株浸入提前配制好的GUS染色液中，于37℃染色20 h（幼苗的染色時間相對較短，約3 h），無水乙醇脫色，顯微鏡下觀察。

1.7 種子活力測定

采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定種子活力。取待測擬南芥種子用30℃左右的溫水浸泡2—6 h，使種子吸水膨脹；隨機取100粒吸脹種子放入培養(yǎng)皿中，加入TTC溶液，以浸沒種子為度；放入30—35℃的恒溫箱內保溫6 h；倒出藥液，用蒸餾水沖洗2—3次，立即觀察種胚著色情況，判斷種子有無活力。判斷標準：活力較強的種子染成鮮紅色；活力較弱的種子胚染成粉紅色或淡紅色。

表1 PCR擴增和基因表達所用引物序列

2 結果

2.1 擬南芥中編碼僅含START結構域家族基因啟動子分析

擬南芥中僅含START結構域的蛋白質進化關系如圖1，僅含START結構域亞家族成員共6個，分為2個大分支：At1g55960和At3g13062在一個大分支，同源關系較近；在另一個大分支的其他4個基因又分為2個分支，At1g64720和At5g54170在一個分支，At4g14500和At3g23080在另一個分支。

通過擬南芥信息資源網(wǎng)站（TAIR）獲得了目的基因上游約1 500 bp的啟動子片段序列，對目的基因啟動子所包含的順式作用元件進行了系統(tǒng)分析。同源性關系較近的每一對基因都有一個基因的啟動子區(qū)有高轉錄水平作用元件（表2，序號1），說明每一對基因中可能其中一個起主要作用；這6個編碼僅含START結構域蛋白質的基因的啟動子區(qū)域均有skn-1-motif和Sp1（表2，序號2、3），說明這些基因均可能與胚乳發(fā)育、光的響應有關；一些啟動子元件僅存在于1對或2對基因中，而在另外2對或1對基因中不存在（表2，序號4、9、10、11、23、27、32和33），說明每一對基因具有功能的相似性，而與另一對基因的功能明顯不同；大部分啟動子元件只在某一對基因中的1個中存在（表2，序號5、6、7、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、28、30、31、34、35、36、37、38、39、40、41和42），說明同一對基因的2個基因功能不盡相同；還有一些啟動子元件僅在6個基因中的1個基因啟動子中存在（表2，序號31、35、36、37、38、39、40、41和42），說明這些基因可能執(zhí)行著某些特異的功能，如At4g14500可能是某種激發(fā)子的響應基因、控制著細胞周期和葉片的發(fā)育，At5g54170可能在地上部特異表達。

表2 擬南芥中編碼僅含START結構域蛋白家族的基因啟動子中作用元件分析

2.2 擬南芥中編碼僅含START結構域家族基因的表達分析

實時定量PCR分析表明，在進化關系較近的每一對基因中，At3g13062、At3g23080和At1g64720相對表達量較高（圖2），同這3個基因的啟動子中均含有高轉錄水平的順式作用元件響應一致（表2，序號1）；所分析的基因均在莖中表達量最高（圖2）；所有基因均在幼苗期表達量較少，成苗期表達量增加，衰老后表達量下降（圖3）。在生長的各個階段， At1g64720表達量最多（圖4）。

利用目的基因啟動GUS的轉基因擬南芥染色分析目的基因的組織定位情況，結果表明，不同基因具有明顯的時空表達特性，At3g13062和At1g55960在幼苗期就有明顯的表達，主要分布于根系、莖、子葉和真葉中，At3g13062的表達量較多（可能與該基因的啟動子區(qū)有高轉錄水平的順式作用元件有關，圖5-A、5-B，表2），At3g23080和At4g14500在幼苗期表達量很少（圖5-C、5-D），到成苗期表達量增加，但主要在蓮座葉中表達，At3g23080的表達量多于At4g14500（圖5-G、5-H，可能與At3g23080的啟動子區(qū)有高轉錄水平的順式作用元件有關，表2）；成苗期At3g13062在根中的表達明顯降低，At1g55960在根系中的表達量較多（圖5-E、5-F）；不同在花器官中的表達部位也有明顯差異，At3g13062在萼片、柱頭和花絲中表達，但在花藥中不表達（圖5-I、5-M、5-N），At1g55960在萼片、花瓣、柱頭、花絲和花藥中表達（圖5-J、5-O、5-P）；At3g23080和At4g14500只在萼片和花瓣中略有表達（圖5-K、5-L、5-Q、5-R）。At3g13062在葉片中主要分布在表皮毛和輸導組織中（圖5-S），At1g55960主要分布于葉片輸導組織中，表皮毛中沒有表達（圖5-T），At3g23080在整個葉片中均勻表達，但表皮毛中沒有表達（圖5-U），At4g14500在葉片中表達量很少，主要分布于輸導組織（圖5-V）。

2.3 含胚乳表達元件的START亞家族成員的功能分析

擬南芥中編碼僅含START結構域蛋白家族基因的啟動子作用元件中均含有Skn-1——胚乳表達特異性元件（表1），預示這些基因可能與胚乳的發(fā)育密切相關。為驗證此功能，從美國ABRC（Arabidopsis biological Resource Center）突變體庫中購買At4g14500及At3g23080基因T-DNA插入突變體，分別為Salk-014746和Salk-053261c。經(jīng)Tair網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/）分析，Salk-053261c在At4g14500的5′ UTR位置插入（圖6-a），Salk-014746在At3g23080基因啟動子前插入（圖7-a），通過三引物法和real-time PCR驗證得到其純合突變體（圖6-b、6-c和圖7-b、7-c）：在DNA水平上，用基因的兩端引物LP和RP及通用中間引物BP同時擴增，At4g14500純合突變體擴增出約為600 bp條帶，At3g23080純合突變體擴增出約為500 bp條帶，而野生型擴增出1 000—2 000 bp條帶。

通過對At4g14500突變體及野生型擬南芥種子活力及大小進行測定。野生型種子略大于At4g14500突變體，且野生型種子的千粒重為0.0145 g，At4g14500突變體14500-T1、14500-T2種子千粒重分別為0.0134和0.0136 g；野生型種子被明顯染色，說明活力要高于At4g14500突變體（圖8）。

At3g23080種子略小于WT，野生型種子千粒重為0.0145 g，At3g23080突變體23080-T1、23080-T2、23080-T3種子千粒重分別為0.0128、0.0130和0.0127 g（圖9-a）；TTC種子活力分析發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥種子被明顯染色，而At3g23080突變體種子染色均較淺，說明At3g23080突變體種子活力降低（圖9-b）。

通過比較野生型擬南芥和At3g23080及At4g14500突變體種子的萌發(fā)率，結果表明野生型、At4g14500的2個T-DNA插入突變體、At3g23080的3個T-DNA插入突變體種子在1/2 MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別為96%、43%、34%、30%、29%和27%（圖10）。說明At3g23080和At4g14500表達量降低均能造成種子活力下降，直接導致萌發(fā)率的降低。

3 討論

在擬南芥中含START結構域的蛋白家族共有35個[18]成員，其中21個被融合在同源異型結構域中，此現(xiàn)象表明START結構域在植物的生長發(fā)育過程中起到了重要的作用[21]。僅含START結構域成員有6個，分別為At3g13062、At1g55960、At3g23080、At4g14500、At5g54170、At1g64720編碼的蛋白質，這些蛋白存在的意義及功能未知，START結構域具有磷脂酰膽堿結合位點，磷脂酰膽堿是細胞膜的主要成分，因此推測其在細胞膜穩(wěn)定性方面具有重要的作用，因此，本研究利用基因啟動子解析了這些基因的表達模式，有利于深入闡明單獨START結構域的功能及在生物進化中的地位，對闡明START結構域調控植物生長發(fā)育的機理具有重要的理論價值。研究發(fā)現(xiàn)僅含START結構域的這6個成員均具有跨膜結構，而且生物信息學分析表明這個亞家族成員的4個成員（At3g13062、At1g55960、At3g23080、At4g14500）上游啟動子序列包含響應抗逆防御相關的元件（TC-rich repeats）及MYB轉錄因子結合位點（MBS），這些元件的存在均提示這些基因可能與抗逆防御反應相關。這些預測結果與已發(fā)表的僅含START結構域的蛋白在植物抗逆過程中的報道一致，SSMP即是僅含START結構域并且參與擬南芥抗逆過程的跨膜蛋白[22-23]，因此本結果對進一步分析START結構域的功能具有指導意義。

根據(jù)生物信息學分析結果，本研究還發(fā)現(xiàn)編碼僅含START結構域蛋白家族基因的啟動子作用元件中均含有Skn-1——胚乳表達特異性元件，這預示著這些基因可能與胚乳的發(fā)育密切相關，而胚乳是種子萌發(fā)中的營養(yǎng)提供者，因此與種子活力相關，為驗證這一猜測，利用T-DNA插入突變體來驗證基因缺失對種子活力的影響，結果表明啟動子中含有胚乳表達特異性元件Skn-1的At4g14500和At3g23080表達量降低，確實導致了種子活力下降（圖8、圖9）。而且已有研究表明，種子活力涉及到蛋白[24]、糖[25]、核酸[26]、脂肪酸[27]、揮發(fā)性物質乙醛[28]、膜透性[29]、酶活性[30]、呼吸強度[31]、脂質過氧化[32]、機制修復[33]等方面的變化。因此欲明確At4g14500及At3g23080影響種子活力的原因需進一步分析其對種子中糖、脂肪酸、酶活性、呼吸強度的影響。

4 結論

擬南芥中僅含START結構域的亞家族有6個成員；含START結構域的亞家族6個成員雖然同源關系較近，但具有各自的時空表達特性，在擬南芥的不同組織和不同發(fā)育時期執(zhí)行著各自的功能?；騿幼釉c基因功能有直接關系，啟動子區(qū)具有胚乳特意表達Skn-1元件的At3g23080和At4g14500表達量下降均會導致種子活力和萌發(fā)率下降。

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（責任編輯 李莉，岳梅）

analysis on gene feature and function of the subfamily members Containing START domain only in

YAN QingDi, ZHAO YaLin, Zhang Hao, GAO Jing, GAO MengZhu, WANG Qian,WANG Rui, WANG FengRu, DONG JinGao

(College of life science, Agricultural University of Hebei/Key Laboratory ofHebeiProvincefor plant physiology and molecular plant pathology, Baoding 071001, Hebei)

【Objective】 The objective of this study is to analyze the promoter elements and expression feature of the genes coding the subfamily containing the START domain (the lipid/sterol-binding StAR-related lipid transfer protein domains) only in, expound the relationship between the cis-acting element and the gene function, and the results of study will provide an important theoretical basis for clarifying the biological function of the genes, analyzing the plant growth and development mechanism and promoting or suppressing plant growth better. 【Method】 Using bioinformatics method to analyze the genetic relationship of 6 members and all the elements contained in their respective promoter regions. The function of the promoter elements of subfamily were analyzed and classified, and the expression features and the regulation factors of these subfamily members were predicted. Real-time PCR method was employed to determine the expression characteristics of subfamily members, clarify the relationship between the test results and the conclusions of promoter analysis, thus providing scientific research ideas and direction for analysis of the function and mechanism of genes. The relationship between the gene promoter element and function was confirmed after analysis of the gene mutation type surface. 【Result】 There are 6 members belong to the subfamily containing START domain only in, divided into three branches, every branch has a pair of genes, each pair of genes has a promoter containing high transcription element 5′ UTR Py-rich stretch. The promoter regions of the 6 subfamily members contain multiple common response elements, such as light, hormone and stress, and also have specific response elements for their own. The real-time PCR results of the genes expression level showed that the expression level of At3g13062 was significantly higher than the same branch gene At1g55960, At3g23080 was significantly higher than the same branch gene At4g14500, At1g64720 was significantly higher than the same branch gene At5g54170. All the subfamily members have higher expression levels at seedling stage, but less expression levels at ageing stage, and have its own specific expression of space and time characteristics. In the gene promoter analysis of the family containing START domain structure only, it was found that each gene promoter has a cis-acting element Skn-1 motif which was specially expressed in endosperm, implied that the family genes may be involved in regulation of endosperm development. Seeds analysis of At3g23080 and At4g14500 T-DNA insertion mutant showed that At3g23080 and At4g14500 expression decreased and caused a decline in the seed vigor. 【Conclusion】 There are 6 members in the subfamily containing START domain only. Six members of the family may be play an important role in the response process to light, hormones and stress. the 6 family members have a close kinship, but their expression characteristics of time and space are different and carry out their respective functions in different development periods of. There is a direct relationship between gene promoter elements and the gene function, and the promoter region with endosperm expressed specially element Skn1 motif in At3g23080 and At4g14500, so the decreased expression of At3g23080 or At4g14500 caused a decline in seed vigor.

; START domain; promoter elements;expression feature; gene function

2017-03-03；接受日期：2017-04-18

河北省自然科學基金（C2017204060）

閆青地，E-mail：1073886780@qq.com；趙亞林，E-mail：1520469399@qq.com。閆青地和趙亞林為同等貢獻作者。通信作者王鳳茹，E-mail：wfr15931945160@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com