孔維龍，于坤，但乃震，楊紹宗，包滿珠，黃向榮，傅小鵬

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甜菜WRKY轉(zhuǎn)錄因子全基因組鑒定及其在非生物脅迫下的表達(dá)分析

孔維龍1，于坤2，但乃震1，楊紹宗1，包滿珠1，黃向榮1，傅小鵬1

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832003）

【目的】WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類植物響應(yīng)生物、非生物脅迫，對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育都起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。在甜菜全基因組信息分析的基礎(chǔ)上，鑒定WRKY家族基因（），解析其組織特異性及鹽、熱脅迫下的表達(dá)情況，為該類基因的功能研究提供參考，為觀賞甜菜和石竹目其他觀賞植物的基因工程打下基礎(chǔ)。【方法】以75條擬南芥WRKY蛋白為參考，根據(jù)WRKY保守蛋白序列（PF03106）利用hmm和BLAST同源性搜索對(duì)甜菜WRKY家族基因進(jìn)行鑒定。利用MapInspect、GSDS2.0、MEGA5.0、DNAMAN5.0、WebLogo 3、MEME生物信息學(xué)工具對(duì)甜菜WRKY家族基因染色體定位、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域、保守元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。利用RNA-seq和qRT-PCR分析甜菜組織表達(dá)特異性，鹽脅迫、熱脅迫條件下表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】甜菜WRKY家族基因包含40個(gè)成員，其中39條不均勻地分布在9條染色體上，另外1條定位到隨機(jī)片段上。根據(jù)WRKY保守域特征并與擬南芥WRKY蛋白進(jìn)化分析，可將40個(gè)成員分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3類，Ⅰ類有9個(gè)成員，Ⅱ類有26個(gè)成員，Ⅲ類有5個(gè)成員。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系Ⅱ類可進(jìn)一步分為Ⅱa（1個(gè)）、Ⅱb（4個(gè)）、Ⅱc（9個(gè)）、Ⅱd（5個(gè)）和Ⅱe（7個(gè)）5個(gè)亞類?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，甜菜外顯子和內(nèi)含子數(shù)目具有高變異性（2—7個(gè)外顯子），即使同一亞類內(nèi)也都差異較大。保守元件分析顯示同一類或亞類內(nèi)成員具有相同的保守元件。WRKY保守域分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)WRKY七肽域變型：WRKYGKK和WRKYGEK。每個(gè)至少在2個(gè)組織中表達(dá)，30個(gè)在葉中表達(dá)，40個(gè)在花序中均有表達(dá)，36個(gè)在幼葉中有表達(dá)，38個(gè)在直根中有表達(dá)，39個(gè)在幼苗中有表達(dá)，36個(gè)在種子中有表達(dá)。各表達(dá)量差異較大，可分為低表達(dá)、高表達(dá)基因兩類，如、、、、、、、、、和在各組織中均有較高表達(dá)，而、、、、和在各組織中均表達(dá)較低。熱脅迫條件下、、、、、和上調(diào)表達(dá)；鹽脅迫條件下、、、和呈現(xiàn)不同程度上調(diào)表達(dá)；對(duì)熱、鹽2種脅迫均有明顯響應(yīng)?！窘Y(jié)論】甜菜WRKY蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，基因序列長(zhǎng)度和內(nèi)含子數(shù)量變化很大，在不同組織中呈現(xiàn)出多種表達(dá)模式，部分響應(yīng)熱或鹽脅迫，對(duì)甜菜逆境生理調(diào)控起重要作用。

甜菜；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；生物信息學(xué)；脅迫；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】甜菜（）是溫帶地區(qū)重要的產(chǎn)糖作物，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，世界每年30%的植物糖產(chǎn)量均出自于甜菜，同時(shí)它也是生產(chǎn)生物乙醇、天然色素、食用蔬菜及動(dòng)物飼料的重要來(lái)源，近年來(lái)越來(lái)越多的甜菜栽培種（紅梗葉甜菜、紅葉甜菜）作為觀賞植物被廣泛應(yīng)用于景觀配置[1]。WRKY作為一類對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)都有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析和表達(dá)特異性研究，對(duì)甜菜栽培、育種、生產(chǎn)推廣以及功能研究具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】WRKY家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，因高度保守的WRKY保守域而得名。WRKY保守域能夠特異識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W盒[C/T]TGAC[T/C]和SURE元件（糖響應(yīng)順式元件）。WRKY保守域包含大約60個(gè)氨基酸，由1個(gè)N端WRKYGQK七肽域和C端鋅指結(jié)構(gòu)構(gòu)成[2]。WRKYGQK七肽域又有WRKYGKK、WRKYDQK和WRKYDHK[3]等多種變型；鋅指結(jié)構(gòu)有C2H2（CX4-5CX22-23HX1H）和C2HC（CX7CX23HX1C）2個(gè)類型。除WRKYGQK七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)外，一些WRKY蛋白還含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（LZ）、核定位信號(hào)域（NLS）、絲氨酸/蘇氨酸富集域、谷氨酰胺富集域和脯氨酸富集域[4-5]。根據(jù)WRKY域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型，WRKY家族可被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3類。第Ⅰ類包含2個(gè)WRKY七肽域和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅱ類包含1個(gè)WRKY七肽域和1個(gè)C2H2類型鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅲ類包含1個(gè)WRKY七肽域和1個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)。第Ⅱ類根據(jù)進(jìn)化關(guān)系可細(xì)分成Ⅱa+b、Ⅱc和Ⅱd+e 3類[6]。最先報(bào)導(dǎo)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子是甘薯的[7]，隨后相繼在馬鈴薯[8]、煙草[9]、小麥和大麥[10-11]、擬南芥[12-16]、胡椒[17]、水稻[18-20]、辣椒[21]、楊樹(shù)[22]、油菜[23]、黃瓜[24]、棉花[25]、胡蘿卜[26]、番木瓜[27]、柳樹(shù)[28]、蘋(píng)果[29]、谷子[30]等鑒定得到WRKY轉(zhuǎn)錄因子。大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為正調(diào)蛋白或負(fù)調(diào)蛋白對(duì)植物應(yīng)答生物與非生物脅迫起調(diào)節(jié)作用。除此之外，也參與調(diào)控植物生理發(fā)育過(guò)程，涉及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成調(diào)節(jié)、葉片衰老、胚形成及種子萌發(fā)等多個(gè)方面[5,31]。如擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)答脫落酸和干旱脅迫[32]。超量表達(dá)和的轉(zhuǎn)基因小麥在耐鹽性、耐旱性和抗凍性等方面均有提高[33]。在水稻糊粉細(xì)胞，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還能調(diào)控GAMYB（GA轉(zhuǎn)錄因子激活子）介導(dǎo)GA信號(hào)途徑[34]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甜菜是重要的產(chǎn)糖作物，同時(shí)觀賞甜菜和石竹目其他觀賞植物，如香石竹（）、石竹（）、須苞石竹（）等被廣泛應(yīng)用于室內(nèi)裝飾、園林造景等領(lǐng)域。但它們生長(zhǎng)發(fā)育均容易受多種生物、非生物逆境的影響，嚴(yán)重影響甜菜產(chǎn)量，限制觀賞甜菜和石竹目其他觀賞植物的應(yīng)用和推廣。而目前石竹目植物高質(zhì)量的基因組和轉(zhuǎn)錄組可利用數(shù)據(jù)相對(duì)有限，僅甜菜具有高質(zhì)量的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可供利用。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以甜菜全基因組為基礎(chǔ)，鑒定WRKY家族成員，分析基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、亞細(xì)胞定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等信息，明確甜菜WRKY家族基因在各個(gè)組織中的表達(dá)特征和多種脅迫條件下的表達(dá)模式。為WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能的解析和抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建打下基礎(chǔ)，同時(shí)預(yù)測(cè)出與觀賞甜菜抗逆性緊密相關(guān)的候選，為觀賞甜菜以及石竹科其他觀賞植物抗逆分子育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2016年12月至2017年2月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，供試品種為觀賞甜菜（var.），購(gòu)于北京東升種業(yè)有限公司。播種于人工氣候箱（達(dá)斯卡特RGL-P，合肥），光照強(qiáng)度16 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗，培養(yǎng)溫度22℃，相對(duì)濕度65%。待小苗長(zhǎng)至6—7片葉時(shí)，進(jìn)行鹽和高溫非生物脅迫處理。用300 mmol·L-1NaCl溶液澆灌植株根部以模擬鹽脅迫，設(shè)置清水澆灌為對(duì)照，2日后取頂部第2、3片幼葉樣品迅速放入液氮保存。高溫處理方式：38℃處理2 h，之后取頂部第2、3片幼葉迅速放入液氮保存。所有脅迫處理均于人工氣候箱進(jìn)行，對(duì)照和處理分設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6株。

1.2 甜菜WRKY家族基因的鑒定

使用hmm和BLAST同源性搜索兩種方法來(lái)鑒定WRKY轉(zhuǎn)錄因子，WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域信息（PF03106）來(lái)自Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/），利用該結(jié)構(gòu)域HMM文件，用HMMER 3.0軟件在甜菜功能基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genomforschung.uni-bielefeld. e/en/projects/annobeet）中進(jìn)行的對(duì)比搜索[29]，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。下載已鑒定的75條擬南芥WRKY蛋白序列，利用在線基因組BlastP搜索，再次搜索WRKY轉(zhuǎn)錄因子。去除重復(fù)序列，利用Pfam和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對(duì)候選基因進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，最終獲得甜菜WRKY家族基因。

1.3 甜菜WRKY家族基因的生物信息分析

甜菜WRKY家族基因內(nèi)含子、外顯子和基因組定位信息均來(lái)自于甜菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用在線軟件GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結(jié)構(gòu)圖，運(yùn)用MapInspect工具繪制染色體定位圖；利用序列分析軟件DNAMAN 5.0和在線軟件WebLogo 3（http://weblogo.threeplusone.com/）分析甜菜WRKY蛋白的WRKY保守域；利用在線軟件 MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)甜菜WRKY蛋白進(jìn)行基序預(yù)測(cè)，參數(shù)中預(yù)測(cè)數(shù)目設(shè)置為8，其他參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置；利用MEGA5.0軟件對(duì)甜菜WRKY家族蛋白序列與擬南芥WRKY蛋白序列（每個(gè)家族/亞家族隨機(jī)選取2個(gè)）進(jìn)行比對(duì)，用鄰位（Neighbor-Joining）算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap重復(fù)1 000次。

1.4 甜菜表達(dá)分析

RNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)自于SRA（SRX287608-287615；SRX647324；SRX647712；SRX647714）（https://www. cbi.nlm.nih.gov/sra/）[35]，分析甜菜在不同組織（幼苗、直根、幼葉、葉、花序、種子）中的表達(dá)情況以及各在鹽脅迫、熱脅迫下幼葉中表達(dá)變化。具體方法：用HISAT2將reads比對(duì)到參考基因組上，用StringTie計(jì)算基因表達(dá)量[36]。

RNA-seq測(cè)序用KWS2320植株生長(zhǎng)于沙灘，生長(zhǎng)溫度21℃，光周期為10 h光照/14 h黑暗，光照強(qiáng)度4 000—6 000 lx，相對(duì)濕度60%。測(cè)序樣品為花序、直根、基部葉片、幼葉（頂端第3、4片幼葉不含葉中脈）、種子樣品，幼苗為20℃培養(yǎng)2 d的出芽苗[1,36]。鹽脅迫處理：植株全營(yíng)養(yǎng)液水培，23 d苗齡時(shí)轉(zhuǎn)入含50 mmol·L-1NaCl的全營(yíng)養(yǎng)液，每天增加50 mmol·L-1NaCl濃度，逐漸增加NaCl濃度到300 mmol·L-1，此后保持300 mmol·L-1NaCl全營(yíng)養(yǎng)液脅迫2 d，于第30天采取幼葉樣品。熱脅迫處理：植株全營(yíng)養(yǎng)液水培30 d，幼葉樣品采摘前進(jìn)行35℃高溫脅迫3 h。對(duì)照幼葉取材于全營(yíng)養(yǎng)水培30 d的植株。所有樣品使用Nucleospin RNA Plant kit試劑盒（Macherey-Nagel，德國(guó)）進(jìn)行提取，利用Hiseq 1500測(cè)序儀進(jìn)行雙末端測(cè)序[35-36]。

采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（艾德萊生物科技有限公司，北京）和TRUEscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾德萊生物科技有限公司，北京）提取樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列

使用ABI公司（美國(guó)）Q7實(shí)時(shí)定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析，定量試劑選用寶生物工程（大連）有限公司SYBR Premix EX TaqTMII，以作為內(nèi)參基因（KF214784）[37]。反應(yīng)體系（10 μL）為SYBR染料5 μL、DyII 0.2 μL、ddH2O 3 μL、上下游引物各0.4 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)條件為95℃ 4 min；95℃ 20 s，60℃20 s，72℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基因的相對(duì)表達(dá)量使用平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示。

2 結(jié)果

2.1 甜菜WRKY家族基因的鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

共篩選得到40個(gè)甜菜（表2），根據(jù)Eulgem等[2]和Rushton等[31]描述的WRKY保守域，可將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3類。其中Ⅰ有9個(gè)成員；Ⅱ類有26個(gè)成員；Ⅲ類有5個(gè)成員。參照擬南芥中的分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)一步將Ⅱ類歸為Ⅱa（1個(gè)）、Ⅱb（4個(gè)）、Ⅱc（9個(gè)）、Ⅱd（5個(gè)）和Ⅱe（7個(gè)）亞類。甜菜WRKY蛋白序列與擬南芥（每類或亞類、隨機(jī)選取兩條）進(jìn)行聚類和系統(tǒng)發(fā)生分析的結(jié)果（圖1）與根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指類型進(jìn)行鑒定的結(jié)果（表2）一致，Ⅲ類是獨(dú)立的分支，Ⅰ和Ⅱ類顯示相對(duì)較近的關(guān)系；Ⅱ-a和Ⅱ-b亞類聚類成一個(gè)分支，Ⅱ-e和Ⅱ-d亞類聚類成一個(gè)分支，Ⅱ-c與I聚類為一個(gè)分支。此外，與擬南芥和水稻類似，甜菜Ⅱ類也可分成Ⅱa+b、Ⅱc和Ⅱd+e 3類，整個(gè)WRKY被分成5類（圖1）。

表2 甜菜WRKY家族基因信息

*為WRKY結(jié)構(gòu)變型* modified WRKY heptapeptide

黑色方框代表甜菜WRKY蛋白，白色方框代表擬南芥WRKY蛋白。Ⅰ代表Ⅰ類，Ⅱ-a+b代表Ⅱ-a+b類，Ⅱ-c代表Ⅱ-c類，Ⅱ-d+e代表Ⅱ-d+e類，Ⅲ代表Ⅲ類，Ⅱa代表II a亞類，Ⅱb代表Ⅱb亞類，Ⅱc代表Ⅱc亞類，Ⅱd代表Ⅱd亞類，Ⅱe代表Ⅱe亞類。下同

2.2 甜菜WRKY蛋白WRKY保守域序列分析

對(duì)甜菜WRKY保守域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)此域高度保守（表2、圖2），偶有變型。其中Ⅰ類的C端WRKY七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX4CX23HXH，N端WRKY七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX4CX22HXH（例外，其鋅指結(jié)構(gòu)是CX4CX23HXH形式與C段鋅指更類似）；Ⅱ類a、b、d、e亞類WRKY七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX5CX23HXH（例外，其WRKY七肽域是WRKYGEK形式，為WRKY七肽域變形），Ⅱ類c亞類七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX4CX23HXH（例外，其WRKY七肽域WRKYGKK，為WRKY七肽域變異）；Ⅲ類七肽域和鋅指結(jié)構(gòu)為WRKYGQK和CX7CX23HXC（圖2）。

2.3 甜菜內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)分析

甜菜外顯子和內(nèi)含子數(shù)目具有高變異性（2—7個(gè)外顯子）（圖3）。4個(gè)含有2個(gè)外顯子，占10%；23個(gè)含有3個(gè)外顯子，占57.5%；7個(gè)含有4個(gè)外顯子，占17.5%；4個(gè)含有5個(gè)外顯子，占10%；僅有2個(gè)含有6個(gè)外顯子。Ⅲ類和Ⅱd+e類多為3個(gè)外顯子（和例外，只有2個(gè)）；Ⅱc、Ⅱa+b和Ⅰ類數(shù)量變異性較大，其中Ⅰ類和Ⅱa+b類變異性極大（3—6個(gè)外顯子）。Ⅲ類和Ⅱd+e類相對(duì)保守，而Ⅱc、Ⅱa+b和Ⅰ類內(nèi)含子外顯子結(jié)構(gòu)分化嚴(yán)重，變化較大。

Ⅰ類被分為Ⅰ-C亞類和Ⅰ-N亞類，Ⅱ-a, b代表Ⅱa與Ⅱb亞類，Ⅱ-c代表Ⅱ-c亞類，Ⅱ-d代表Ⅱ-d亞類，Ⅱ-e代表Ⅱ-e亞類，Ⅲ代表Ⅲ類

圖3 甜菜WRKY內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)

2.4 甜菜染色體定位

染色體定位結(jié)果顯示，甜菜40個(gè)中有39個(gè)分布于9條染色體中，且呈不均勻分布，1個(gè)（）未能定位到任何染色體上（圖4），定位在隨機(jī)片段上。其中第2和6染色體上的分布最多，各有7個(gè)，各占17.5%；第5和1染色體次之，各有6、5個(gè)，各占15%、12.5%；第9染色體分布最少，僅有2個(gè)，占5%；第3、4、7和8染色體均分布3個(gè)，各占7.5%（圖4）。甜菜各類基因在染色體上的分布也存在差異，其中Ⅱd+e類分布最為廣泛，除第7染色體之外，其他8條染色體上均有分布；Ⅰ類分布于第2、4、6、7、9染色體上；Ⅱc類分布于第1、2、3、5、6染色體上，并有一條未能定位到任何染色體上；Ⅲ類分布于第1、2、3、5、7染色體上；Ⅱa+b類分布于第2、5、6、8染色體上（圖4、表2）。甜菜在9條染色體上的分布較多，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)情況分析。以2個(gè)或多個(gè)同源基因（屬于相同的家族基因或類）在染色體上的物理位置不超過(guò)100 kb，彼此之間相似度大于40%，即為串聯(lián)重復(fù)基因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)[29,38-39]，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)情況，即使有些基因彼此之間物理距離較近，如和物理距離為小于100 kb，也因不屬于同一類，排除其串聯(lián)重復(fù)的可能。

圖4 甜菜WRKY染色體定位

2.5 甜菜WRKY家族基因保守元件

分析保守元件預(yù)測(cè)結(jié)果，Motif 1和Motif 3包含WRKY七肽域，Motif 2和Motif 4為鋅指結(jié)構(gòu)域，Motif 1和Motif 2構(gòu)成C端WRKY盒；Motif 3和Motif 4構(gòu)成N端WRKY盒。Motif 6是亮氨酸拉鏈盒（BRLZ domain），Motif 7是蘇氨酸富集域，Motif 5和Motif 8為未知盒。Ⅰ類具有2個(gè)WRKY盒，具有Motif 1—Motif 4共4個(gè)motif，而其他類只具有C端WRKY盒，即僅具有Motif 1和Motif 2，無(wú)Motif 3和Motif 4。Motif 5幾乎存在于Ⅰ類、Ⅱc類的每一個(gè)成員中（除BvWRKY 7外），部分存在于Ⅱd+e、Ⅲ中，而Ⅱa+b類中無(wú)Motif 5；Motif 6和Motif 8特異地存在于Ⅱa+b類中；Motif 7僅偶然存在于Ⅱa+b、II c、Ⅱd+e中（圖5）。各類motif存在數(shù)量和種類較為固定，與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果（圖1）和鑒定分類結(jié)果（表2）一致。

2.6 甜菜組織特異性表達(dá)譜

分析根、葉、幼葉、花序、幼苗和種子6個(gè)組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)至少在2個(gè)組織中表達(dá)。其中，30個(gè)在葉中表達(dá)，40個(gè)在花序中均有表達(dá)，36個(gè)在幼葉中有表達(dá)，38個(gè)在直根中有表達(dá)，39個(gè)在幼苗中有表達(dá)，36個(gè)在種子中有表達(dá)。40個(gè)在各組織中的表達(dá)量存在較大差異，直根中總表達(dá)量最高（RPKM=371.05）；在幼葉、種子、幼苗中次之，RPKM分別為311.47、251.17、208.00；花序、葉中表達(dá)最少，RPKM分別為142.07、119.33。6個(gè)組織的表達(dá)譜聚類發(fā)現(xiàn)，花序、幼葉和葉中的表達(dá)較為類似；種子、幼苗和直根中的表達(dá)較為類似（圖6）。

通過(guò)聚類分析，40個(gè)基因在各組織中的表達(dá)結(jié)果可明顯的分為兩組，一組（A組）包括22個(gè)成員，為高表達(dá)基因；另一組（B組）包括18個(gè)成員，為低表達(dá)基因。A組中所有基因在各組織中均有表達(dá)，但各成員之間表達(dá)模式差異較大，一部分基因在各個(gè)組織中均有較高表達(dá)量，如、、、、、、、、、和。一部分基因呈現(xiàn)組織表達(dá)特異性，如優(yōu)勢(shì)表達(dá)于幼苗和種子；優(yōu)勢(shì)表達(dá)于直根和幼苗；在葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。B組中有6個(gè)基因在各個(gè)組織中均表達(dá)量較低，分別為、、、、和。12個(gè)基因在某些組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其他組織中表達(dá)量極低。如、和優(yōu)勢(shì)表達(dá)于直根；優(yōu)勢(shì)表達(dá)于幼葉；優(yōu)勢(shì)表達(dá)于種子（圖6）。

2.7 甜菜在2種非生物脅迫下的表達(dá)譜

對(duì)熱脅迫和鹽脅迫處理后幼葉RNA-seq結(jié)果進(jìn)行分析。熱脅迫之后，大部分下調(diào)表達(dá)，其中、下調(diào)最為明顯；有7個(gè)呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)，其中、、、和上調(diào)較為明顯（圖7）。鹽脅迫條件下，絕大多數(shù)出現(xiàn)不同程度的下調(diào)表達(dá)，其中下調(diào)最為明顯。少數(shù)基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，其中和上調(diào)表達(dá)最為明顯。此外，在熱脅迫和鹽脅迫后均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)對(duì)熱和鹽2種非生物逆境均有積極響應(yīng)作用（圖7）。

2.8 甜菜的qRT-PCR表達(dá)分析

根據(jù)RNA-seq分析結(jié)果，鹽脅迫下5個(gè)基因表達(dá)量明顯上調(diào)，熱脅迫下7個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，這些基因被初步認(rèn)定為抗逆相關(guān)候選基因（表1）。利用qRT-PCR進(jìn)一步分析6—7片葉齡的觀賞甜菜中這些候選基因在鹽脅迫和熱脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果表明，鹽脅迫條件下、、、、3表達(dá)量上調(diào)；熱脅迫下、、、、、、表達(dá)量上調(diào)（圖8），與RNA-seq結(jié)果基本一致。略有不同的是鹽脅迫和熱脅迫下，qRT-PCR分析結(jié)果中基因上調(diào)程度均沒(méi)有RNA-seq分析結(jié)果高。究其原因，可能與甜菜品種、脅迫方式及脅迫強(qiáng)度有關(guān)。

3 討論

甜菜屬于真雙子葉植物的基部類群，對(duì)其WRKY轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的鑒定填補(bǔ)了被子植物到核心雙子葉植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子無(wú)人報(bào)道的空缺。本研究共鑒定出40個(gè)甜菜WRKY轉(zhuǎn)錄因子，不存在缺失類和亞類等情況。其的數(shù)量與被子植物基部植物的挪威云杉（32個(gè)）[26]和核心雙子葉植物加拿大油菜（43個(gè)）[23]以及蓖麻子（47個(gè)）[40]相接近。相較其他雙子葉植物以及單子葉植物差別較大，如楊樹(shù)有104個(gè)[41]、大豆有188個(gè)[42]、棉花有116個(gè)[43]、大白菜有145個(gè)[44]、蘋(píng)果有139個(gè)[26]、擬南芥有74個(gè)[5]，均遠(yuǎn)多于甜菜。究其原因，發(fā)現(xiàn)這些物種都經(jīng)歷過(guò)基因重復(fù)事件，包括全基因組復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制。如白菜在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷六倍體階段，由全基因組復(fù)制事件產(chǎn)生3個(gè)亞基因組，導(dǎo)致白菜大量基因發(fā)生擴(kuò)張。另外，花生（75個(gè)）[45]、蘋(píng)果[29]、水稻[26]、擬南芥[5]、馬鈴薯（81個(gè)）[26]、番茄（81個(gè)）[46]均發(fā)生過(guò)串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制，導(dǎo)致基因數(shù)量增多。相比于上述物種，甜菜既沒(méi)有發(fā)生過(guò)全基因組的復(fù)制事件，WRKY轉(zhuǎn)錄因子又無(wú)串聯(lián)或片段復(fù)制發(fā)生，這是其家族基因數(shù)量較少的重要原因。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKYGOK基序與DNA的“大溝”結(jié)合，進(jìn)而與W-box的T上的甲基原子團(tuán)進(jìn)行非極性結(jié)合識(shí)別DNA。WRKYGOK基序的變異將導(dǎo)致與T-box結(jié)合能力大幅下降甚至完全喪失。在甜菜中發(fā)現(xiàn)2個(gè)WRKY七肽域變型：的WRKYGKK七肽域和的WRKYGEK七肽域。在番茄[38]、桃樹(shù)[47]中亦有WRKYGKK七肽域，而WRKYGEK七肽域卻少有報(bào)道。大豆中含有WRKYGKK變體的和不能正常結(jié)合W-box[48]。具有WRKYGKK變體的煙草的識(shí)別另一結(jié)合序列TTTTCCAC而不是正常Wbox[49]。推測(cè)甜菜2個(gè)WRKY七肽域變型可能使WRKY蛋白失去與DNA的識(shí)別和結(jié)合能力，或者能識(shí)別其他新基序，產(chǎn)生新的功能。

分析組織表達(dá)特征，發(fā)現(xiàn)甜菜在各組織表達(dá)差異較大，總表達(dá)量在根部最高，在葉表達(dá)量最低，大多數(shù)基因在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，如、和。類似的，丹參絕大多數(shù)（22/61）也在根中呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)表達(dá)，總表達(dá)量較其他組織高[50]。水稻也在根優(yōu)勢(shì)表達(dá)，試驗(yàn)證明磷酸鹽匱乏的處理?xiàng)l件下，超量表達(dá)的水稻Pi含量較對(duì)照高6%，分蘗數(shù)、谷粒重量均高于對(duì)照，證明能提高水稻對(duì)磷酸鹽的吸收[51]。擬南芥、亦在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其超量表達(dá)植株亦被證明能增加根Pi含量和提高Pi吸收率[52-53]。推測(cè)甜菜在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)部分也可能涉及磷酸鹽吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。

RNA-seq和qRT-PCR的結(jié)果均表明、、、、表達(dá)量受鹽脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)；、、、、、表達(dá)量受熱脅迫誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)。在水稻、小麥、葫蘆卜、馬鈴薯等物種中亦有轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)鹽、熱、冷、干旱脅迫上調(diào)表達(dá)的報(bào)道[26,54-56]，觀賞甜菜的在鹽和熱脅迫條件下均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)植物適應(yīng)脅迫環(huán)境有重要作用，與植物逆境生長(zhǎng)密切相關(guān)，部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)多種脅迫。

4 結(jié)論

甜菜WRKY家族基因序列長(zhǎng)度和內(nèi)含子數(shù)量變化很大，但蛋白結(jié)構(gòu)高度保守；在不同組織中呈現(xiàn)出多種表達(dá)模式。RNA-seq和qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)、、、和受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，、、、、、和受熱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，推測(cè)這些基因可能參與了甜菜非生物逆境下生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。

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（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

Genome-wide Identification and Expression Analysis of WRKY Transcription Factor under Abiotic Stress in

KONG WeiLong1, YU Kun2, DAN NaiZhen1, YANG ShaoZong1, Bao ManZhu1,HUANG XiangRong1, FU XiaoPeng1

(1College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Wuhan 430070;2College of Agronomy, Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Ecological Agriculture, Xinjiang Production and Construction Group, Shihezi 832003, Xinjiang)

【Objective】WRKY transcription factor is a kind of transcription factor which plays an important role in plant response to biotic, abiotic stress, plant growth and development.Based on the sugar beet genome information, the WRKY family genes () were identified, tissue-specific expression profiles and expression pattern under salt and heat stresses were analyzed. The aim of the study is to provide reference for thegene function research, and lay a foundation for ornamental beet () and other Dianthus ornamental plant genetic engineering research. 【Method】 A total of 75WRKY proteins were used as

, according to WRKY conserved protein sequence (PF03106), thegenes ofwere identified by hmm and BLAST homology searches, and the chromosome location, phylogeny, gene structure, conserved domain, conserved element were also analyzed by MapInspect, GSDS2.0, MEGA5.0, DNAMAN5.0, WebLogo 3 and MEME bioinformatics tools. The specificity ofgenes expression and expression pattern under salt stress and heat stress ofwere analyzed by RNA-seq and qRT-PCR analysis. 【Result】gene family contained 40 members, 39 were unevenly distributed on 9 chromosomes, 1 on the random fragment. According to the WRKY conserved domain features and the evolution analysis with, 40 members were divided into three classes: Ⅰ, Ⅱ, and Ⅲ. classⅠhad 9 members, class Ⅱ had 26 members and class Ⅲ had 5 members. According to the evolutionary relationship, class Ⅱ further divided into five subclass: Ⅱa (1), Ⅱb (4), Ⅱc (9), Ⅱd (5) and Ⅱe (7). Genetic structure analysis showed that exon and intron number ofgenes had high variability (2-7 exons), even within the same subgroup. Conserved element analysis showed that within the same class or subclass had the same conserved elements. WRKY conserved domain analysis revealed two mutations in the WRKY domain: WRKYGKK and WRKYGEK. Eachwas expressed in at least two tissues, 30were expressed in leaf, 40were expressed in inflorescence, 36were expressed in young leaf, 38were expressed in root, 39were expressed in seedling, and 36were expressed in seed. The expression levels ofgenes were also different. Allgenes were divided into two types: low expression genes and high expression genes.Such as:,,,,,,,,,andwere highly expressed in all tissues;,,,,andwere low expressed in all tissues.,,,,andgenes were up-regulated under heat stress, and,,,andwere up-regulated under salt stress. In addition,had a significant response to both heat and salt stress. 【Conclusion】WRKY proteins are highly conserved, the length of the gene sequence and the number of introns varied widely, allgenes showed a variety of expression patterns in different tissues, somegenes responded to heat or salt stress, which play an important role in stress physiological regulation.

; WRKY transcription factor; bioinformatics; stress; expression analysis

2017-02-23；接受日期：2017-04-25

國(guó)家自然科學(xué)基金（31000918）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2662015PY052，2662016PY041)

孔維龍，E-mail：Asuraprince@126.com。通信作者傅小鵬，E-mail：fuxiaopeng@mail.hzau.edu.cn