趙慧軍 李志忠

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅、蘭州，730000；2.蘭州理工大學(xué)，甘肅、蘭州，730000）

一株草莓灰霉菌的生物學(xué)特征研究與鑒定

趙慧軍1,2李志忠2

（1.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅、蘭州，730000；2.蘭州理工大學(xué)，甘肅、蘭州，730000）

草莓灰霉病是影響草莓生產(chǎn)種植的主要病害，極易侵染導(dǎo)致草莓果實(shí)腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重危害草莓的產(chǎn)量品質(zhì)和運(yùn)輸儲(chǔ)存。本研究從染病草莓中分離純化出一株灰霉菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生物學(xué)特征研究和ITS分子鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis sp.），為后續(xù)進(jìn)行灰葡萄孢菌拮抗菌的篩選和草莓灰霉病的生物防治奠定了基礎(chǔ)。

草莓；灰霉菌；生物學(xué)特征；鑒定

引言

草莓灰霉病是由半知菌亞門(mén)、葡萄孢屬的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害［2］，由于其宿主廣泛、致病性強(qiáng)，可以導(dǎo)致果蔬莖稈、葉片、果實(shí)的枯萎、腐爛和，嚴(yán)重影響果蔬的產(chǎn)量和品質(zhì)［2］。

甘肅省蘭州市紅古區(qū)作為綠色農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化示范區(qū)，土壤氣候條件適合多品種草莓種植。本實(shí)驗(yàn)通對(duì)紅古區(qū)花莊鎮(zhèn)草莓標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地的調(diào)查采樣，從感染灰霉病的草莓果實(shí)病斑中分離純化一株灰霉菌，通過(guò)生物學(xué)特征檢測(cè)和ITS分析鑒定，為后續(xù)進(jìn)行灰葡萄孢菌拮抗菌的篩選和草莓灰霉病的生物防治提供了研究基礎(chǔ)，對(duì)該地區(qū)種植和推廣優(yōu)質(zhì)綠色無(wú)公害草莓具有現(xiàn)實(shí)意義。

1、材料與方法

1.1 試驗(yàn)園概況

本試驗(yàn)樣品來(lái)自蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植區(qū)(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)，海拔1580～1680m之間，屬溫帶大陸性干旱氣候。年平均氣溫7.6℃，年平均降水量327.7-349.9mm，年平均日照為1762-2769h，無(wú)霜期166d。主栽品種為杜克拉，屬早熟品種，株行距為0.5×1m，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《無(wú)公害食品草莓生產(chǎn)技術(shù)》（NY/5105—2002）川地草莓抗旱栽培技術(shù)進(jìn)行管理。

1.2 材料與試劑

1.2.1 材料

在蘭州市花莊鎮(zhèn)河咀村草莓種植基地灰霉病高發(fā)區(qū)采摘感染灰霉的草莓樣本（病果）7株。

1.2.3 試劑

PDA培養(yǎng)基；PDB發(fā)酵培養(yǎng)基；DNA提取試劑盒（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；DNA電泳上樣緩沖液(日本TaKaRa公司)；Taq酶(日本TaKaRa 公司)；D2000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)；瓊脂糖(西班牙Biowest公司)；DNA膠純化試劑盒 (購(gòu)自AXYGEN公司)；引物(invitrogen)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 致病菌的分離純化和形態(tài)觀察

將感染嚴(yán)重的病果研磨后加入90mL無(wú)菌水充分振蕩，稀釋后配成不同濃度梯度的組織混合液，涂布到PDA平板24℃恒溫培養(yǎng)。2d后挑取少量菌絲接種培養(yǎng)，稀釋分離單孢純培養(yǎng)［3］。分別觀察培養(yǎng)2～5d菌絲、分生孢子、孢子梗及菌核的形態(tài)特征。

1.3.2 致病菌致病性研究

將健康草莓果實(shí)用無(wú)菌水洗凈，在10%HgCl2溶液中浸泡8min，無(wú)菌水反復(fù)沖洗3次后濾紙吸取表面水分［5］，用接種針在草莓表面形成孔徑為3～5mm創(chuàng)傷，用5mm打孔器在培養(yǎng)5d的灰霉平板上取菌碟［4］，接種到供試草莓創(chuàng)傷位置［3］。接種后的草莓果實(shí)放入組培罐中用濾紙保濕［5］，置于22℃培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察4～5d后的感染情況。

1.3.3 分生孢子萌發(fā)形態(tài)觀察

將培養(yǎng)5d的灰霉平板用0.3%吐溫80洗脫收集孢子，配置濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸液［5］，各取200μl孢子菌懸液和800μLPDB發(fā)酵液加入EP管中充分震蕩，對(duì)照組取200μl孢子菌懸液和800μL無(wú)菌水［6］；分別于20℃、22℃、24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d后觀察孢子萌發(fā)形態(tài)。

1.3.4 致病菌分子鑒定

待測(cè)菌株的DNA提取使用真菌基因組DNA提取試劑盒，以該菌株DNA為模板，PCR擴(kuò)增ITS片段，采用25μl擴(kuò)增體系（見(jiàn)表1）。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，純化后切膠回收［2,6］，委托南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。

表1 核糖體DNA反應(yīng)體系的組成

2、結(jié)果與分析

2.1 灰霉菌形態(tài)學(xué)觀察

在PDA平板培養(yǎng)基中分離純化出一株灰霉菌株X，呈輻射狀擴(kuò)散，生長(zhǎng)初期呈白色［7］(圖1)，逐漸轉(zhuǎn)為淺灰色，隨著菌絲的蔓延生長(zhǎng)顏色加深，變?yōu)樯罨疑蚝稚?圖2)，偶有臟綠色；分生孢子梗單支或樹(shù)枝狀分支，頂端膨大，上有小突起，分生孢子著生于突起上［5，7］(圖3-4)，孢子呈卵圓形、橢球形(圖5)。菌絲細(xì)長(zhǎng)，多橫隔，單個(gè)或多個(gè)分支［7］(圖6)。

圖1：接種2d的單菌落

圖2：接種5d的菌落

圖3：著生孢子囊的菌絲（4d）

圖4：孢子梗(4d)

圖5：分生孢子

圖6：菌絲（5d）

2.2 灰霉菌分生孢子萌發(fā)

孢子萌發(fā)時(shí)，首先卵圓形一端形成突起，產(chǎn)生萌發(fā)管(圖7)；在20℃下培養(yǎng)時(shí)孢子萌發(fā)率隨著培養(yǎng)溫度的增加而提高，22℃為孢子最適萌發(fā)溫度，主要形成單個(gè)或2個(gè)萌發(fā)管；至24℃時(shí)，易形成3個(gè)或3個(gè)以上萌發(fā)管，且萌發(fā)管形成分支，菌絲生長(zhǎng)迅速，總體萌發(fā)率降低［5］。

圖7：孢子萌發(fā)初期

圖8：20℃培養(yǎng)

圖9：多萌發(fā)管

圖10：22℃培養(yǎng)

圖11：24℃培養(yǎng)

圖12：對(duì)照組

2.3.灰霉菌果實(shí)復(fù)染

菌株X感染草莓果實(shí)表面著生灰色菌絲，引起果實(shí)肉質(zhì)腐爛，隨著菌絲的生長(zhǎng)果實(shí)覆蓋灰色霉層，表面呈粉狀，隨著病斑的擴(kuò)大，顏色變深，霉層呈現(xiàn)深灰色伴隨臟綠色［9］（如圖13-14）。

圖13：感染灰霉菌3d

圖14：感染灰霉菌5d

2.4 灰霉菌分子鑒定

以菌株X的DNA為模板，對(duì)ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)條帶2號(hào)（如圖15），經(jīng)測(cè)序，菌株X的ITS序列長(zhǎng)度為539bp。將ITS序列與Genbank中的相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比較，并采用DNAStar構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［3,6］（如圖16）。結(jié)果表明，與菌株X相似性最高的是Botrytis sp. isolate NO_9（KX427539.1），二者序列相似度達(dá)100%。

圖15：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖16：ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3、結(jié)論和討論

綜上所述，根據(jù)霉菌分類標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生物學(xué)特征及分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)同源性比較，該菌株X鑒定為灰葡萄孢菌（Botrytis sp. isolate NO_9）。

研究發(fā)現(xiàn)，分離自草莓、葡萄、辣椒、番茄、梨、洋蔥果實(shí)等其他果蔬的灰葡萄孢菌都能感染草莓果實(shí)也葉片，因此要防止不同作物之間的致病菌感染［10,11］。本研究將繼續(xù)對(duì)灰葡萄孢菌的生理生化特征及其對(duì)草莓的侵染影響因素、灰葡萄孢菌拮抗菌的篩選和生物防治等方面進(jìn)一步深入研究［12-14］。

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Identification and Biological Characteristics Analysis of Gray Mold in Strawberry

ZHAO Hui-jun1,2,LI Zhi-zhong2
（1.Lanzhou Vocational Technical College,Lanzhou,730000, China; 2.Lanzhou University of Technology,Lanzhou,730000,China)

Strawberry Botrytis Cinerea is the main disease that affects the production and cultivation of the strawberry and which makes the strawberry rotting and deteriorating easily.so the quality and transportation of it will also be affected. In this study, a strain of Botrytis Cinerea was detached and purified from the diseased strawberry. By studying the Morphological, Biological Properties and ITS Molecular, the strain was identified as Botrytis Sp, and all these have laid the foundation for the subsequent screening of Botrytis Sp and Biotic-control of Gray Mould of strawberry .

Strawberry；Gray Mold；Biological Characteristics；Identification

S432.4

A 文字編號(hào);