李海洋，李 肖，韋小敏，來航線，黨妮娜，王昕昱，孔令昭，聶榮杰，劉壯壯(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

產(chǎn)復(fù)合酶優(yōu)良菌株篩選及蘋果渣固態(tài)發(fā)酵效果研究

李海洋，李 肖，韋小敏，來航線，黨妮娜，王昕昱，孔令昭，聶榮杰，劉壯壯
(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西楊凌 712100)

通過液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)和蘋果渣固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，研究不同絲狀真菌產(chǎn)水解酶的活性及產(chǎn)酶優(yōu)良的霉菌對蘋果渣發(fā)酵的改質(zhì)效果，篩選出適用于蘋果渣發(fā)酵的優(yōu)良霉菌。結(jié)果表明，黑曲霉MHQ1產(chǎn)纖維素酶、果膠酶和木聚糖酶的活性較高，分別為64.7、66.9和216.7 U·mL-1；米曲霉MMQ1產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的活性較高，分別為1 782.6 和83.0 U·mL-1；煙曲霉MYQ1產(chǎn)蛋白酶和果膠酶的活性較高，分別為128.9 和51.6 U·mL-1。其中，黑曲霉MHQ1能在果渣基質(zhì)上良好地生長，對果渣具有較強(qiáng)的降解改質(zhì)能力，產(chǎn)物中粗蛋白和純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增至387.5 和228.9 g·kg-1，接菌增率為79.2%和193.8%，且纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的活性分別為178.0、150.6和57.5 U·g-1，纖維素、果膠分別降解28.9%、53.8%，水溶性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至2.7%。采用酵母菌與產(chǎn)復(fù)合酶優(yōu)良的霉菌復(fù)合發(fā)酵，能顯著提高果渣發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)水平，降低抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提高水解酶和水溶性氨基酸等活性物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有效地發(fā)酵果渣為生物蛋白飼料。

霉菌；水解酶；蘋果渣；固態(tài)發(fā)酵；蛋白質(zhì)；

中國是重要的蘋果生產(chǎn)國，年產(chǎn)蘋果約為2 500 萬t[1]。蘋果加工過程中每年約有100多萬t蘋果渣產(chǎn)生[2]，因此，對其充分開發(fā)利用成為許多學(xué)者的重要研究課題。隨著中國飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，尋找開發(fā)非常規(guī)蛋白飼料原料已成為飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)急需解決的問題[3-5]。蘋果渣因含有可溶性糖、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)[6]，越來越多地被應(yīng)用于動物飼料。但果渣中較低的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、較大的酸度和果膠、纖維素等抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，直接影響果渣作為飼料的飼用效果[7-8]。通過外源氮素的添加，利用微生物的分解再合成過程提高果渣中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，是實(shí)現(xiàn)果渣飼料化利用的重要措施，研究[9-10]表明，采取多種菌種混合發(fā)酵可有效提高產(chǎn)物中營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，且生產(chǎn)上常用協(xié)同性和互補(bǔ)性較好的霉菌與酵母組合作為發(fā)酵菌劑。主要因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵過程是復(fù)合酶水解原料中大分子營養(yǎng)物質(zhì)的過程，酶的活力及酶的復(fù)合類型決定菌劑對底物的降解改質(zhì)程度。有鑒于此，本研究通過液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)探究不同絲狀真菌的產(chǎn)酶活性及產(chǎn)酶類型，再將產(chǎn)復(fù)合酶活性較高的霉菌與酵母配伍，進(jìn)行果渣復(fù)菌發(fā)酵，以期獲得用于蘋果渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白飼料的專適性霉菌。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌種 黑曲霉MHQ1(AspergillusnigerMHQ1)、黑曲霉MHQ2(AspergillusnigerMHQ2)、黑曲霉MHQ3(AspergillusnigerMHQ3)、黑曲霉MHQ4(AspergillusnigerMHQ4)、米曲霉MMQ1(AspergillusoryzaeMMQ1)、米曲霉MMQ2(AspergillusoryzaeMMQ2)、煙曲霉MYQ1(AspergillusfumigatesMYQ1)、瑞氏木霉MRM1(TrichodermareeseiMRM1)，未知菌株MW1、MW2 、MW3 、MW4、MW5。以上菌種均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室提供。

長枝木霉13003(Trichodermalongibrachiatum13003)、綠色木霉13002(Trichodermaviride13002)、酵母菌為產(chǎn)朊假絲酵母1314 (Candidautilis1314)均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 原料 烘干蘋果渣由眉縣恒興果汁有限公司提供，油渣、麩皮均購自市場。

1.1.3 培養(yǎng)基 絲狀真菌培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，酵母培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基[11]。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：麥秸粉15 g，麩皮20 g，微晶纖維素6 g，豆餅粉5 g，硫酸銨2 g，尿素1 g，硝酸鈉2 g，硫酸二氫鉀3 g，硫酸鎂0.5 g，吐溫80 3 mL，自來水1 000 mL，pH自然。

固態(tài)發(fā)酵原料：原料為w(蘋果渣)∶w(油渣粉)∶w(尿素)=17∶2∶1。

1.2 方 法

1.2.1 菌懸液制備 絲狀真菌孢子懸液：將28 ℃活化的霉菌斜面菌種用無菌水配制成菌懸液，接種至裝有滅菌PDA固體培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)72 h后加入200 mL無菌生理鹽水，搖動制成孢子懸液，采用血球計數(shù)法測定孢子數(shù)，并用無菌水稀釋至108cfu·mL-1。

酵母菌懸液：按照無菌操作法向100 mL滅菌YEPD液體培養(yǎng)基中接入產(chǎn)阮假絲酵母菌，28 ℃、150 r·min-1搖瓶培養(yǎng)72 h，采用血球計數(shù)法測定細(xì)胞數(shù)，并用無菌水稀釋至108cfu·mL-1。

1.2.2 絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵 準(zhǔn)確量取80 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基于500 mL抽濾瓶中，121 ℃濕熱滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻后，通過打孔法分別將15株絲狀真菌的產(chǎn)孢子菌塊接入抽濾瓶中，每瓶接3塊，共設(shè)16個處理，為對照(CK)和單接各個絲狀真菌MHQ1、MHQ2、MHQ3、MMQ1、MW1、MHQ4、MYQ1、13003、MMQ2、MRM1、MW2、 MW3、MW4、13002、MW5，每處理重復(fù)3次。將接種后搖勻的液態(tài)培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d，從第2天起每天定時取樣，獲得含酶發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)5 000 r·min-1離心和真空抽濾即為去除菌體的粗酶液，酶液4 ℃保存，備用。

1.2.3 固態(tài)發(fā)酵 準(zhǔn)確稱取固態(tài)發(fā)酵原料50 g裝入650 mL組培瓶，加入75 mL mandels復(fù)合鹽溶液，混勻，121 ℃濕熱滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻后，按單一霉菌分別與酵母配伍的方式，在每瓶培養(yǎng)基中接入3 mL酵母菌懸液和3 mL霉菌孢子懸液，共設(shè)7個處理，為對照(CK)、酵母菌+黑曲霉組(Y+MHQ1)、酵母菌+米曲霉組(Y+MMQ1)、酵母菌+煙曲霉組(Y+MYQ1)、酵母菌+黑曲霉組(Y+MHQ3)、酵母菌+長枝木霉組(Y+13003)、酵母菌+未知霉菌組(Y+MW1)，每個處理重復(fù)3次。將接種并攪勻的培養(yǎng)基于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h，培養(yǎng)期間，每隔24 h觀察記錄培養(yǎng)基中絲狀真菌菌絲的生長情況，并記錄。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵樣品于40 ℃低溫烘干至恒量，冷卻后準(zhǔn)確稱量并記錄，最后將樣品粉碎，過40目篩，備用。

1.2.4 測定方法 纖維素酶活、木聚糖酶活、淀粉酶活和果膠酶的活性測定采用DNS法[12-14]；蛋白酶酶活的測定采用GB/T23527-2009，粗蛋白的測定采用GB/T 6432-1994，純蛋白的測定采用凱氏定氮法[15]；纖維素的測定采用GB/T20806-2006；果膠的測定采用果膠酸沉淀法[16]；水溶性氨基酸的測定采用茚三酮比色法[17]。

1.2.5 計算公式 發(fā)酵產(chǎn)物得率=發(fā)酵產(chǎn)物干質(zhì)量/發(fā)酵前原料干質(zhì)量×100%

發(fā)酵增率 (△f)=(發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)-未發(fā)酵純蘋果渣營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))/未發(fā)酵純蘋果渣營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100%

接菌增率(△i)=(接菌發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)-未接菌發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù))/未接菌發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼用復(fù)合酶優(yōu)良絲狀真菌篩選

不同菌種產(chǎn)酶活性和類型不同，通過單一菌株液體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)測定纖維素酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶和木聚糖酶的活性，從而篩選出能產(chǎn)多種水解酶且酶活較高的優(yōu)良絲狀真菌。

2.1.1 高產(chǎn)纖維素酶 纖維素酶是一類能水解纖維素成簡單糖的復(fù)合酶，它主要包括葡聚糖內(nèi)切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)和 β-葡萄糖苷酶(BG)。纖維素酶活性測定常用的可溶性底物為羧甲基纖維素，不溶性底物為新華1號濾紙，本研究以濾紙為底物測定大型絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶的活性，酶活結(jié)果見圖1。

由圖1可知，15株霉菌液體發(fā)酵5 d后，最高纖維素酶活變幅為6.1～64.7 U·mL-1，其中來源于中國工業(yè)菌種保藏中心產(chǎn)纖維素酶優(yōu)良的長枝木霉13003菌株的酶活為30.0 U·mL-1。以菌株13003作為纖維素酶活參比菌株，可知酶活高達(dá)64.7 U·mL-1的黑曲霉MHQ1顯著優(yōu)于13003和其他霉菌，可作為產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良出發(fā)菌株。菌株MHQ2、MHQ3、MW2、MMQ1酶活都在20 U·mL-1以上，雖然較參比菌株酶活低，但都顯著高于其他霉菌。

柱狀圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同 Letters on histogram indicate significant difference (P<0.05),the same below

2.1.2 高產(chǎn)蛋白酶 蛋白酶是作用于蛋白質(zhì)或多肽，催化肽鍵水解的酶類。按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的最適作用 pH不同，可分為酸性、中性和堿性蛋白酶，飼料工業(yè)中使用的是酸性和中性蛋白酶。本研究在中性條件下測定霉菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的中性蛋白酶活性，酶活結(jié)果見圖2。

由圖2可知，15株霉菌液體發(fā)酵后，最高蛋白酶活變幅為0.7～128.9 U·mL-1，其中MYQ1、MMQ1菌株產(chǎn)蛋白酶活性較高，酶活分別為128.9和83.0 U·mL-1，且菌株MYQ1、MMQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良出發(fā)菌株。其次為菌株MW1、MW2、MW4、13002，酶活都在45 U·mL-1以上，且相鄰兩菌株間酶活差異不顯著，但都顯著高于菌株MHQ1、MHQ2、MHQ3、MHQ4、13003、MMQ2、MRM1。

圖2 15株絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白酶活性Fig.2 Protease activity of 15 strains’ liquid fermentation products

2.1.3 高產(chǎn)果膠酶 果膠酶是指能催化分解果膠質(zhì)的一類酶的總稱，包括原果膠酶、聚半乳糖醛酸酶、果膠裂解酶和果膠酯酶等[18]。果膠酶以果膠為底物，可以使果膠分解并產(chǎn)生半乳糖醛酸。本研究采用DNS法測定霉菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的果膠酶活性，酶活結(jié)果見圖3。

由圖3可知，15株霉菌液體發(fā)酵后，最高果膠酶活變幅為20.8～66.9 U·mL-1，其中MHQ1菌株產(chǎn)果膠酶活性最高，其次為MHQ3、MYQ1、MW2菌株，果膠酶活力分別為66.9、55.5、51.6 和43.3 U·mL-1，且菌株MHQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)良出發(fā)菌株。菌株MHQ3、MYQ1、MW2酶活都在40 U·mL-1以上，且相鄰菌株酶活差異不顯著，但顯著高于其他菌株。

圖3 15株絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的果膠酶活性Fig.3 Pectinase activity of 15 strains’ liquid fermentation products

2.1.4 高產(chǎn)淀粉酶 淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶[19]。

由圖4可知，15株霉菌液體發(fā)酵后，最高淀粉酶活變幅為129.9～1 782.6 U·mL-1，其中MMQ1菌株產(chǎn)淀粉酶活性最高，其次為MW1、MW3、MMQ2菌株，酶活分別為1 039.1、1 001.2和955.3 U·mL-1，且菌株MMQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產(chǎn)淀粉酶的優(yōu)良出發(fā)菌株。菌株MW1、MW3、MMQ2酶活都在900 U·mL-1以上，且3株霉菌之間酶活無顯著差異，但都顯著高于其他菌株。

2.1.5 高產(chǎn)木聚糖酶 木聚糖酶是一類降解木聚糖的復(fù)合酶系，主要有內(nèi)切木聚糖酶、外切木聚糖酶、脫支鏈酶、木糖苷酶等。液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖酶活性見圖5。由圖5可知，15株霉菌液體發(fā)酵后，最高木聚糖酶活變幅為49.2～224.3 U·mL-1，其中MHQ3、MHQ1菌株酶活較高，其次為菌株13003，木聚糖酶活力分別為224.3 、216.7和193.0 U·mL-1，且除13003菌株外，菌株MHQ3、MHQ1酶活顯著高于其他霉菌(P<0.05)，可作為產(chǎn)木聚糖酶的優(yōu)良出發(fā)菌株。菌株13003酶活高于MHQ2、MMQ1、MW2，并顯著高于其他霉菌(P<0.05)。

圖4 15株絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的淀粉酶活性Fig.4 Amylase activity of 15 strains’ liquid fermentation products

2.1.6 優(yōu)良菌株的綜合產(chǎn)酶情況 將15株霉菌按5種酶的活性高低進(jìn)行排序，綜合各種酶活排序選取能產(chǎn)生多種酶且活性較高的霉菌為優(yōu)良菌株，排序篩選結(jié)果見表1。

表1表明，絲狀真菌MHQ1、MMQ1、13003、MHQ3、MYQ1、MW1產(chǎn)復(fù)合酶的活性較高，尤以菌株MHQ1、MMQ1、MYQ1的表現(xiàn)最佳，其中霉菌MHQ1、MHQ3產(chǎn)纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶的活性較高，菌株MMQ1、MW1產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的活性較高，菌株13003產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的活性較高，菌株MYQ1產(chǎn)蛋白酶和果膠酶的酶活較高。上述霉菌作為產(chǎn)復(fù)合酶優(yōu)良菌株，可用于蘋果渣及其他有機(jī)渣類發(fā)酵試驗(yàn)和進(jìn)一步研究其對蘋果渣等有機(jī)廢棄物的酶解改質(zhì)效果。

圖5 15株絲狀真菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中的木聚糖酶活性Fig.5 Xylanase activity of 15 strains’ liquid fermentation products

表1 優(yōu)良霉菌產(chǎn)5種酶活性的綜合排序Table 1 Comprehensive ranks of five enzyme activity produced by comparably high-enzyme yield strains

注：阿拉伯?dāng)?shù)字表示排序名次。

Note: Numbers in the table means the ranking numbers.

2.2復(fù)菌固態(tài)發(fā)酵對蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

不同的產(chǎn)酶菌株對蘋果渣發(fā)酵基質(zhì)的降解利用能力不同，將上述篩選的產(chǎn)復(fù)合酶活性較高的絲狀真菌與產(chǎn)朊假絲酵母1314復(fù)配，用于蘋果渣固態(tài)發(fā)酵，通過記錄和測定發(fā)酵產(chǎn)物中菌絲生長狀況、發(fā)酵飼料得率、粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究不同絲狀真菌與酵母組合對蘋果渣發(fā)酵效果的影響。

2.2.1 霉菌菌絲生長狀況 發(fā)酵蘋果渣中菌絲的生長速度和數(shù)量反映菌絲的生長特性和對果渣發(fā)酵基質(zhì)的適應(yīng)程度，酵母菌與絲狀真菌混合發(fā)酵蘋果渣過程中菌絲的生長狀況見表2。

從表2可以看出，發(fā)酵原料在接種發(fā)酵劑后，菌絲體隨著生長時間增加不斷增長，且各處理菌體生長狀況因發(fā)酵劑不同稍有差異。接種24 h后，處理Y+MMQ1、Y+MHQ3、Y+MW1中出現(xiàn)白色菌絲；接種48 h后，Y+MHQ1、Y+MMQ1、Y+MHQ3處理基質(zhì)中已呈現(xiàn)旺盛菌絲，表明霉菌MHQ1、MMQ1、MHQ3在果渣基質(zhì)中能快速生長；接種72 h后，除Y+13003外，各接種處理基質(zhì)中的菌絲生長繁茂，布滿發(fā)酵原料，結(jié)成白色團(tuán)狀；而處理Y+13003在發(fā)酵96 h后才出現(xiàn)旺盛菌絲，表明上述6株霉菌均能在果渣基質(zhì)中良好地生長，其中霉菌13003生長相對較慢。

表2 菌絲的生長狀況Table 2 Mycelium growth condition onfermenting apple pomace

注：“-”表示外觀無明顯變化，“+”表示菌絲開始生長，“++”表示菌絲明顯可見，“+++”表示菌絲生長旺盛。

Note: “-”means no significant change, “+”means beginning growth, “++”means clearly visible, “+++”means vigorous growth.

2.2.2 對發(fā)酵蘋果渣飼料粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 蘋果渣經(jīng)過酵母菌與絲狀真菌復(fù)合發(fā)酵后，產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率見表3。

由表3可知，發(fā)酵能大幅提高果渣發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為216.2～387.5 g·kg-1，較未發(fā)酵純果渣中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加262.1%～549.1%。其中，未接菌發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為216.2 g·kg-1，較純蘋果渣增加262.1%，主要是輔料的添加調(diào)節(jié)發(fā)酵果渣氮素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時在低溫烘干過程中可能伴有孢子飄散引起氮素的少量累積。與未接菌發(fā)酵相比，酵母與霉菌混合發(fā)酵能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P<0.05)，接菌增率為20.9%～79.2%?；炀幚鞾+MHQ1發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率最高，分別為387.5 g·kg-1和79.2%，并顯著高于其他處理。混菌處理Y+MHQ3發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率分別為369.6 g·kg-1和70.9%，僅次于酵母與霉菌MHQ1的復(fù)合發(fā)酵效果。

表3 粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率Table 3 Increased percentages of crude protein mass fraction in fermentation products

注：未發(fā)酵純果渣原料粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.7 g/kg。下同。

Note: Mass fraction of crude protein in samples were 59.7 g/kg. The same below.

2.2.3 對發(fā)酵蘋果渣飼料純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 蘋果渣經(jīng)過酵母菌與絲狀真菌混合發(fā)酵后，產(chǎn)物中純蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率見表4。

由表4可知，發(fā)酵能大幅提高果渣發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.9～228.9 g·kg-1，較未發(fā)酵純果渣中純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加51.0%～343.6%。其中未接菌發(fā)酵產(chǎn)物中純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.9 g·kg-1，較純果渣增加51.0%。與未接菌發(fā)酵相比，酵母與霉菌混合發(fā)酵能顯著提高發(fā)酵產(chǎn)物中純蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(P<0.05)，接菌增率為31.2%～193.8%?；炀幚鞾+MHQ1發(fā)酵產(chǎn)物純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率最高，分別為228.9 g·kg-1、193.8%，并顯著高于其他處理，表明在酵母菌的配伍下，霉菌MHQ1能有效改質(zhì)果渣為生物蛋白飼料。

上述結(jié)果表明，產(chǎn)飼用復(fù)合酶優(yōu)良的絲狀真菌均能利用蘋果渣基質(zhì)良好地生長，能不同程度地提高發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白和純蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其中黑曲霉MHQ1表現(xiàn)最佳，發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白和純蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到387.5、228.9 g·kg-1。

表4 純蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其增率Table 4 Increased percentages of pure protein mass fraction in fermentation products

注：未發(fā)酵純果渣原料純蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.6 g/kg。

Note: Mass fraction of pure protein in samples were 51.6 g/kg.

2.3黑曲霉與酵母配伍用于蘋果渣固態(tài)發(fā)酵的效果

黑曲霉MHQ1和產(chǎn)朊假絲酵母1314配伍的復(fù)合菌劑用于蘋果渣固態(tài)發(fā)酵，通過測定發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶、果膠酶和蛋白酶活性及纖維素、果膠和水溶性氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)一步探討該復(fù)合菌劑對蘋果渣的利用和改質(zhì)效果，結(jié)果見表5。

由表5可知，優(yōu)良黑霉菌株MHQ1與酵母菌復(fù)合發(fā)酵蘋果渣發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的酶活分別為178.0、150.6和57.5 U·g-1，較純果渣分別增加867.4%、497.6%和168.7%。產(chǎn)物中纖維素和果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18.9%和4.8%，與純果渣相比纖維素、果膠降解率分別為28.9%、53.8%，純蛋白、水溶性氨基酸增至22.9%、2.7%，表明經(jīng)過發(fā)酵酶解，蘋果渣中的纖維素和果膠發(fā)生不同程度的降解利用，減少飼料中抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時水溶性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)得到大幅提高，蛋白質(zhì)部分轉(zhuǎn)化為更容易被動物吸收利用的氮素形態(tài)。

表5 纖維素酶、果膠酶、蛋白酶活性及部分營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Cellulase, pectinase and protease activity and nutrients mass fraction in fermentation products

3 討論與結(jié)論

近些年，產(chǎn)酶菌株的篩選主要集中在產(chǎn)單一酶活性較高菌株的篩選，通過選擇培養(yǎng)基分離篩選自然界中產(chǎn)酶活性較高的原生菌株。張歡[20]篩選出1株產(chǎn)纖維素酶活性較高的黑曲霉菌株，其發(fā)酵液濾紙酶活力和羧甲基纖維素酶活力分別達(dá)到40.7 和60.9 U·mL-1；魏丕偉等[21]從高溫大曲中獲得1株中性蛋白酶活11.0 U·mL-1的米曲霉；華寶玉等[22]從桔子園土壤和腐爛的水果等處篩選得到產(chǎn)果膠酶活可達(dá)42.0 U·mL-1的聚多曲霉；國春艷等[23]從土壤中篩選出液態(tài)發(fā)酵下木聚糖酶活高達(dá) 628.4 U·mL-1的黑曲霉菌株；肖長清等[24]報道1株大曲中降解淀粉能力較強(qiáng)的黑曲霉，液體發(fā)酵酶活可達(dá)35.0 U·mL-1。本研究通過液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，綜合評價各菌株的酶活力，從15株霉菌中篩選出5株產(chǎn)復(fù)合酶活性較高的菌株，尤以菌株MHQ1、MMQ1、MYQ1表現(xiàn)優(yōu)異。在統(tǒng)一酶活單位下比較可知，本研究篩選出的優(yōu)良菌株的淀粉酶和蛋白酶活性優(yōu)于文獻(xiàn)[21，24]報道的菌株，纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶與菌株酶活[20，22-23]相一致，且綜合產(chǎn)酶能力較好，可以做為飼用復(fù)合酶制劑生產(chǎn)的優(yōu)良材料。

霉菌可以分泌豐富的水解酶類，且霉菌中菌體蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)20%～30%，因此在蛋白飼料的生產(chǎn)中霉菌被廣泛使用[25]。陳娟等[26]利用黑曲霉與多株酵母菌復(fù)合發(fā)酵蘋果渣，產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增至27.6%，提高455.3%。張高波等[27]研究表明，酵母與霉菌復(fù)菌發(fā)酵果渣后，產(chǎn)物中纖維素酶、蛋白酶活性分別為64.3和742.4 U·g-1，較對照增加947.4%和207.3%。與上述結(jié)果相似，本研究以酵母菌配伍產(chǎn)復(fù)合酶優(yōu)良的霉菌進(jìn)行果渣固態(tài)混菌發(fā)酵，結(jié)果表明黑曲霉MHQ1與產(chǎn)朊假絲酵母共發(fā)酵能顯著提高蘋果渣中粗蛋白和純蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，明顯提高纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的活性，降低纖維素和果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，發(fā)酵改質(zhì)效果明顯。主要因?yàn)楹谇乖诠l(fā)酵過程中能產(chǎn)生多種水解酶，將果渣中的纖維素和果膠等降解為易利用的還原糖[28-29]，同時纖維素酶和果膠酶共同作用破壞細(xì)胞壁，有利于胞內(nèi)淀粉、脂類、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)的釋放[30]，為酵母和霉菌的生長、蛋白質(zhì)的累積提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)；另一方面，酵母對可溶性營養(yǎng)物質(zhì)的利用可以減弱纖維素酶等合成的反饋抑制作用，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶的效率[31]。因此，絲狀真菌與酵母良好的協(xié)同共生關(guān)系，為果渣等非常規(guī)飼料原料的開發(fā)利用開辟廣闊的前景。

本研究獲得1株產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活性較高，能用于蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白飼料的優(yōu)良絲狀真菌黑曲霉MHQ1，其與產(chǎn)朊假絲酵母菌配伍發(fā)酵果渣，能顯著提升產(chǎn)物中蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增加纖維素酶、果膠酶和蛋白酶的活性，不同程度地降解纖維素、果膠等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，有效地改質(zhì)蘋果渣為生物蛋白飼料，為蘋果渣的飼料化利用提供優(yōu)良出發(fā)菌株。

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ScreeningofHighYieldMultiEnzyme-ProducingStrainsandItsEffectonApplePomaceSolid-StateFermentation

LI Haiyang，LI Xiao，WEI Xiaomin，LAI Hangxian，DANG Nina，WAGN Xinyu，KONG Lingzhao，NIE Rongjie and LIU Zhuangzhuang
(College of Natural Resources and Environment，Northwest A&F University，Yangling Shaanxi 712100，China)

Several high enzyme-yield strains were screened through liquid fermentation and apple pomace solid state fermentation experiment by comparing the hydrolytic enzyme activity and product quality of apple pomace fermentation.The results showed that the activity of cellulose (64.7 U·mL-1), pectinase(66.9 U·mL-1) and xylanase (216.7 U·mL-1) produced byAspergillusnigerMHQ1 were comparably high, and the amylase(1 782.6 U·mL-1) and protease(83.0 U·mL-1) produced byAspergillusoryzaeMMQ1 were comparably high,and the activity of protease(128.9 U·mL-1) and pectinase (51.6 U·mL-1) produced byAspergillusfumigatesMYQ1 were comparably high. Among all,AspergillusnigerMHQ1 grew well on the apple pomace substrate, and fermenting combined with yeast could improve the products quality of apple residue fermentation: the crude protein and pure protein mass fraction of the products increased to 387.5 g·kg-1and 228.9 g·kg-1; the efficiency of seed inoculation was enhanced by 79.2% and 193.8% compared with blank samples, and the activities of cellulase, pectinase and protease were 178.0 U·g-1, 150.6 U·g-1and 57.5 U·g-1,respectively. Besides the anti-nutrients such as cellulose, pectin were degraded by 28.9% and 53.8%, and water soluble amino acid mass fraction increased to 2.7%. In all,AspergillusnigerMHQ1 fermentation with yeast could significantly improve protein level of fermentation product of apple pomace,reduced the anti-nutrient mass fraction, and increased the hydrolytic enzymes activity and the water soluble amino acids mass fraction.Therefore,AspergillusnigerMHQ1 combined with yeast, could effectively ferment apple pomace to biological protein-rich feed.

Mycete; Hydrolase; Apple pomace; Solid state fermentation; Protein

2016-04-29

2016-06-05

National Science & Technology Pillar Program of 12th Fve-year Plan(No.2012BAD14B11).

LI Haiyang, male,master student.Research area: microbial resources and utilization.E-mail:clisea@yeah.net

S816.6

A

1004-1389(2017)09-1301-10

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsibleeditor:GUYulan)

日期：2017-09-12

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170912.1740.014.html

2016-04-29

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“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD14B11)。

李海洋，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail:clisea@yeah.net

韋小敏，女，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail:weixiaomin@nusuaf.edu.cn

CorrespondingauthorWEI Xiaomin, female, master supervisor. Research area:microbial resources and utilization. E-mail:weixiaomin@nusuaf.edu.cn