張樹松,樊月婷,孫興濱,仇天雷,高 敏,王旭明,3*(.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 50040；.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,北京 00097；3.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室,北京 00097)

環(huán)境微生物

菌株Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205的反硝化特性

張樹松1,2,樊月婷1,2,孫興濱1,仇天雷2,高 敏2,王旭明2,3*(1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150040；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心,北京 100097；3.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室,北京 100097)

為強化硝酸鹽污染水的反硝化脫氮,研究了反硝化新菌株Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T利用不同碳源的缺氧反硝化性能,以及利用固體碳源聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的好氧反硝化特性.結(jié)果表明,在缺氧狀態(tài)下,菌株 SL-205T分別以乙酸鈉、琥珀酸鈉和 PHBV為唯一碳源時,硝酸鹽去除率均達到 99%以上;當(dāng)初始硝態(tài)氮濃度為 315mg/L 時,PHBV的最適投加量為 2.0g/L.菌株SL-205T能利用PHBV進行好氧反硝化,當(dāng)反應(yīng)進行到36h時,硝酸鹽去除率達到94.54%,平均反硝化速率為8.69mg/(L·h),并且在反應(yīng)結(jié)束時沒有亞硝酸鹽和氧化亞氮的積累.以上結(jié)果為該菌株在廢水脫氮處理中的應(yīng)用奠定了實驗基礎(chǔ).

Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T；硝酸鹽；碳源；聚羥基丁酸戊酸共聚酯；好氧反硝化

近些年,由于人類活動,如工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和城鎮(zhèn)生活污水處理等大量含氮廢水的排放,導(dǎo)致地下水及地表水中硝酸鹽濃度明顯升高[1].過高的硝酸鹽含量會造成水體富營養(yǎng)化[2-3],水體中的溶解氧降低,使水生動物處于缺氧狀態(tài)甚至死亡,對自然生態(tài)造成巨大影響[4].同時也可以使地表水中藻類大量繁殖,不僅嚴(yán)重影響水體觀感,而且這些含藻水進入到城市供水系統(tǒng)中會增加水處理工藝的難度和成本[5-6].飲用水中硝酸鹽濃度過高時,會大大增加飲用者患高鐵血紅蛋白血癥和胃癌的風(fēng)險[7-8].在水產(chǎn)養(yǎng)殖中氮素污染也是主要危害之一,氮素含量過高使水生動物失去平衡能力、厭食、動作遲緩,甚至死亡[9].

利用微生物的反硝化作用去除硝酸鹽是一種常規(guī)的污水脫氮工藝,對于低C/N比的硝酸鹽污染水,需要向其提供碳源以滿足反硝化所需的電子供體[10].常規(guī)反硝化工藝通常加入甲醇、葡萄糖、醋酸鈉等可溶性有機物作為補充碳源[11-12],但存在可溶性碳源容易過量的風(fēng)險,而且系統(tǒng)運行和維護比較困難,碳源投加量不易控制[13].為避免常規(guī)可溶性碳源的弊端,可采用非水溶性固體有機物作為反硝化微生物的碳源. Ovez等[14]利用甘草等作為生物反硝化的碳源和生物載體去除水源水中的硝酸鹽,去除率達到了 100%;邵留等[15]在以稻草為碳源的實驗中發(fā)現(xiàn),稻草的浸出液中含有大量的微量元素,這些微量元素有利于提高反硝化菌等相關(guān)菌體的活性,并提高反硝化速率.除了天然纖維素類物質(zhì)的使用,近年來,人工合成可生物降解聚合物(BDPs)因其良好的生物相容性和生物降解性越來越受到研究者的關(guān)注.Boley等[16]利用聚己內(nèi)酯(PCL)等可降解聚合物作為碳源和生物膜載體,實現(xiàn)了循化水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝酸鹽的有效去除.賴才勝等[17]以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)作為固體碳源,利用響應(yīng)曲面法考察進水硝酸鹽濃度和水力停留時間對脫氮效率的影響,并建立了脫氮效果的預(yù)測模型.與常規(guī)反硝化工藝相比,固體碳源反硝化工藝不需要復(fù)雜的碳源投加控制系統(tǒng),操作簡單,運行穩(wěn)定[13].

目前,對于固體碳源反硝化的研究主要采用活性污泥作為接種物,以去除污染水中的硝酸鹽.利用純菌進行固體碳源反硝化的研究還鮮有報道.課題組前期分離到一株能降解聚羥基丁酸戊酸共聚酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV]的反硝化細菌 SL-205T菌株,經(jīng)鑒定為Diaphorobacter屬的一個新種,并命名為 D. polyhydroxybutyrativorans[18].本文首次研究了該菌種的模式菌株SL-205T利用固體碳源PHBV的反硝化性能,以期為該菌種在生物脫氮領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T:本實驗室分離自以 PHBV為碳源的反硝化反應(yīng)器,在中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心的保藏編號為 CGMCC No.6625.菌株 SL-205T于 50%甘油中-80℃保存,使用前在LB培養(yǎng)基中活化2次(28℃).

1.2 培養(yǎng)基

蛋白胨液體培養(yǎng)基(LB):蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L,,NaCl 10.0g/L,pH 7.2-7.4.

反硝化培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.2g/L, KNO31.0g/L,K2HPO41.0g/L,PHBV粉末(寧波天安生物科技有限公司)2.0g/L,微量元素溶液 2mL,pH 7.0-7.2.在研究可溶性碳源的反硝化作用時,分別用6.287g乙酸鈉、4.529g檸檬酸鈉和3.744g琥珀酸鈉代替上述培養(yǎng)基中的 PHBV,使培養(yǎng)基的C/N=8.微量元素溶液:EDTA 50.0g/L,ZnSO42.2g/L,CaCl25.5g/L,MnCl2·4H2O 5.06g/L, FeSO4·7H2O 5.0g/L,(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1g/L, CuSO4·5H2O 1.57g/L,CoCl2·6H2O 1.61g/L以上培養(yǎng)基在0.11MPa,121℃下滅菌20min后備用.

1.3 反硝化性能測定

缺氧反硝化:將 80mL的反硝化培養(yǎng)基裝入150mL血清瓶中,通入高純氦氣后用膠塞密封、滅菌.用一次性無菌注射器按 2%(V:V)的接種量將活化的菌株SL-205T接種至血清瓶中,28℃培養(yǎng).

好氧反硝化:將100mL的反硝化培養(yǎng)基注入到250mL血清瓶中通入高純氦氣,置換出血清瓶中的空氣,再通入50mL的氧氣,模擬空氣中氧氣含量,使血清瓶中處于有氧狀態(tài)[19].然后密封、滅菌.最后接種2%(V:V)的菌株SL-205T至血清瓶中,28℃,150r/min下恒溫培養(yǎng).

以未接種的反硝化培養(yǎng)基作為空白對照,所有實驗設(shè)置3個平行.每隔4h取樣測定樣品中溶解性有機碳(DOC)、硝態(tài)氮(NO3--N)、亞硝態(tài)氮(NO2--N)和好氧反硝化時的氣態(tài)產(chǎn)物氧化亞氮(N2O),氮氣(N2)的濃度,以及細菌生長狀況(用OD600表示).

1.4 分析方法

細菌的生長采用光電比濁法在波長 600nm下進行測定.硝酸鹽氮采用紫外分光光度比色法,亞硝酸鹽氮濃度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法測定,所用波長分別為220nm和540nm[20].樣品中DOC的測定使用總有機碳 vario TOC型(德國elementar公司)分析儀進行測定.好氧反硝化研究中,含氮氣體測定采用7890N型氣相色譜儀(美國安捷倫公司),其中N2O的測定使用GC/ECD檢測器,N2的檢測使用GC/TCD檢測器;pH值的測定使用雷磁PHSJ-3F型pH計(上海精科).

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株SL-205T的缺氧反硝化特性

圖1 PHBV投加量對菌株SL-205T生長和硝酸鹽去除的影響Fig.1 Effects of PHBV addition dosage on the growth and nitrate removal by strain SL-205T

2.1.1 PHBV投加量對反硝化的影響 菌株SL-205T是本實驗室分離鑒定的能降解 PHBV的反硝化細菌.在不同PHBV含量的培養(yǎng)基中,菌株SL-205T的生長曲線如圖1A所示.當(dāng)PHBV投加量為1.0g/L和1.5g/L時,OD600的最大值分別為 1.5和 1.9.此時,硝酸鹽的去除率分別為69.7%和79.53%(圖1B).亞硝酸鹽積累量分別為0.35mg/L和0.14g/L(圖2).PHBV投加量增加到2.0g/L,OD600的最大值升高至2.64,硝酸鹽去除率顯著升高到 99.4%,亞硝酸鹽沒有積累.這一結(jié)果說明,碳源投加量是菌體生長和硝酸鹽還原的限制性因素.碳源不足時,不能為反應(yīng)提供充足的電子流,以至于不能為反硝化提供充足的能量[21],使反應(yīng)不能徹底進行,造成中間產(chǎn)物亞硝酸鹽的積累.繼續(xù)增加碳源投加量至 2.5g/L,菌體生長和硝酸鹽去除率都沒有顯著變化.不同碳源投加量的DOC變化趨勢如圖3所示. PHBV能在解聚酶的作用下降解成可溶性的有機碳,引起 DOC濃度升高.隨著反應(yīng)持續(xù)進行,DOC又不斷被菌體利用,因此DOC呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢.

圖2 PHBV投加量對亞硝酸鹽生成的影響Fig.2 Effects of PHBV addition dosage on nitrite accumulation

圖3 PHBV投加量對溶解性有機碳的影響Fig.3 Effects of PHBV addition dosage on DOC accumulation

以上研究結(jié)果表明,當(dāng)初始硝酸鹽氮濃度為315mg/L時,菌株 SL-205T進行反硝化的最適PHBV最佳投加量為2.0g/L.

圖4 不同碳源對菌株SL-205T生長(a)、硝酸鹽去除(b)、亞硝酸鹽積累(c)和溶解性有機碳(d)變化的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on the growth, nitrate removal, nitrite accumulation and DOC change by strain SL-205T

2.1.2 不同碳源對反硝化的影響 碳源在反硝化過程中提供菌體生長所需要的能量,并作為硝酸鹽還原的電子供體.不同碳源會產(chǎn)生不同的氧化還原電位,進而導(dǎo)致脫氮效率不同[22].本研究選用3種可溶性碳源乙酸鈉、琥珀酸鈉、檸檬酸鈉和固體碳源 PHBV,研究碳源對菌株 SL-205T脫氮性能的影響,結(jié)果如圖5所示.以檸檬酸鈉作為唯一碳源時,培養(yǎng)液最大 OD值為 0.6(圖 4a),表明菌體幾乎沒有生長,硝態(tài)氮和 DOC濃度在反應(yīng)過程中沒有明顯變化(圖4b和圖4d),表明菌株 SL-205T不能利用檸檬酸鈉為碳源完成反硝化過程.當(dāng)以乙酸鈉、琥珀酸鈉和PHBV為碳源時,硝酸鹽的去除效率均達到99%以上;反應(yīng)20h時硝酸鹽的平均去除速率分別為16.14mg/(L·h)、13.44mg/(L·h)和 13.25mg/(L·h)(圖 4b).由于乙酸鈉分子結(jié)構(gòu)簡單,容易被細胞直接吸收利用[23],所以其脫氮效果最好.有研究表明,當(dāng)以PHBV做為碳源時,Diaphorobacter能分泌胞外解聚酶,使PHBV降解成乙酸和三羥基丁酸[24-25]才能被繼續(xù)利用.因此,在反應(yīng)的起始階段,以 PHBV為碳源的硝酸鹽去除速率要低于乙酸鈉和琥珀酸鈉(圖4b).由于PHBV逐漸被分解和利用,DOC呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖4d).

以上研究結(jié)果表明,菌株 D. polyhydroxybutyrativorans SL-205T不僅可以利用可溶性碳源乙酸鈉和琥珀酸鈉,同樣可以利用固體碳源PHBV進行反硝化脫氮,為該菌株生物脫氮過程中碳源的選擇提供了更大空間.

2.2 菌株SL-205T利用PHBV為碳源的好氧反硝化特性

目前,已發(fā)現(xiàn)了多種細菌具有好氧反硝化功能,但關(guān)于好氧反硝化研究應(yīng)用的大多是可溶性碳源,對于固體碳源的好氧反硝化還少有研究報道.為此,我們研究了菌株SL-205T利用固體碳源PHBV的好氧反硝化性能,結(jié)果如圖5所示.在反應(yīng)的初始8h,硝酸鹽濃度變化并不顯著.隨著反應(yīng)的進行,硝酸鹽濃度迅速降低.在反應(yīng)的32h,硝酸鹽去除率達到88.83%.此時菌株SL-205T生長旺盛,反硝化進程與細菌生長狀態(tài)密切相關(guān)[26].在反應(yīng)過程中,由于PHBV的降解產(chǎn)物為乙酸和三羥基丁酸[27],導(dǎo)致培養(yǎng)基pH略有降低,隨著反硝化反應(yīng)的進行,培養(yǎng)基內(nèi)會有OH-積累,pH在10h后逐漸升高.當(dāng)反應(yīng)進行到 36h時,硝酸鹽去除率達到 94.54%.菌株SL-205T在 36h內(nèi)去除硝酸鹽的平均速率達到8.69mg/(L·h),高于大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)好氧反硝化菌利用可溶性碳源的硝酸鹽去除速率(表1).比較表1中菌株SL-205T利用PHBV和可溶性乙酸鈉作為碳源的數(shù)據(jù)可知,菌株SL-205T利用PHBV的反硝化速率略低于該菌株利用乙酸鈉的反硝化速率,這是由于該菌株要先將PHBV降解成可溶性有機碳,才能使其有充足的碳源進行反硝化過程,同時引起DOC濃度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖5).

圖5 菌株SL-205T利用PHBV作為碳源的好氧反硝化特性Fig.5 Aerobic denitrification performance of strain SL-205Tusing PHBV as carbon source

表1 不同好氧反硝化菌的反硝化性能比較Table 1 A comparison for aerobic denitrification performance among different aerobic denitrifiers

亞硝酸鹽是一項重要的水質(zhì)理化指標(biāo),國際癌癥研究協(xié)會(International Agency for Research on Canncer, IARC)報告認(rèn)為,攝入亞硝酸鹽可能會導(dǎo)致癌癥[35].在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,亞硝酸鹽濃度超標(biāo)會造成水生動物厭食、反應(yīng)遲緩,甚至因缺氧而導(dǎo)致死亡等[8].在菌株 SL-205T的反硝化過程中,硝酸鹽被菌體中的硝酸鹽還原酶還原成亞硝酸,致使亞硝酸鹽在反應(yīng)的前16h有所積累,最高濃度為7.35mg/L.而亞硝酸鹽的存在又會誘導(dǎo)亞硝酸還原酶的產(chǎn)生,從而使亞硝酸鹽濃度降低[36].在反應(yīng)的 36h后,未檢測出亞硝酸鹽,這與 Sun等[37]報道的Pseudomonas stutzeri T13脫氮效果一致.

反硝化過程的重要氣態(tài)中間產(chǎn)物N2O 是一種重要的溫室氣體,對臭氧層有很強的破壞能力,在大氣中不易擴散,而且增溫能力強,是 CO2的150～300倍[38].因此,對于反硝化氣態(tài)產(chǎn)物的檢測很有意義.菌株 SL-205T發(fā)生好氧反硝化時氣態(tài)產(chǎn)物的生成狀況如圖 5所示.在好氧反硝化過程中,N2O在20h有少量積累(0.6mg/L),在隨后的反應(yīng)中并未檢測到N2O的存在.同時, N2在反應(yīng)過程中不斷積累,其濃度在32h達到237.88mg/L,隨后保持穩(wěn)定.這一結(jié)果表明,N2是菌株SL-205T好氧反硝化的最終氣態(tài)產(chǎn)物,75.38%的初始硝態(tài)氮以 N2的形式被去除.根據(jù)以上結(jié)果分析,該菌去除硝態(tài)氮的途徑是硝態(tài)氮首先轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽,隨后生成 N2O,最后被還原為 N2.該菌株利用硝態(tài)氮進行好氧反硝化的氮平衡特征如表 2所示.根據(jù)氮平衡可推測出, 19%的初始硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化成菌體生物量,用于菌體自身代謝合成.由此看出,本文研究的Diaphorobacter屬菌株SL-205T在反硝化方面不僅具有較高的脫氮速率,而且在好氧狀態(tài)下反硝化作用完全,不積累中間產(chǎn)物亞硝酸鹽和 N2O,表明該菌株在污水脫氮處理方面具有較好的應(yīng)用前景.

表2 菌株SL-205T好氧反硝化去除硝酸鹽的氮平衡(mg/L)Table 2 Nitrogen balance of nitrate removal during aerobic denitrification by strain SL-205T(mg/L)

3 結(jié)論

3.1 菌株D. polyhydroxybutyrativorans SL-205T可以利用可溶性碳源乙酸鈉、琥珀酸鈉以及固體碳源PHBV進行反硝化脫氮.以PHBV為唯一碳源進行缺氧反硝化反應(yīng),初始硝酸鹽濃度為315mg/L時, PHBV的最適投加量為2.0mg/L.

3.2 菌株D. polyhydroxybutyrativorans SL-205T以PHBV為唯一碳源進行好氧反硝化時,硝酸鹽的去除率高達 94.54%,平均去除速率達到8.69mg/(L·h),反應(yīng)結(jié)束時沒有中間產(chǎn)物亞硝酸鹽和N2O的積累.

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中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2017年環(huán)境科學(xué)與技術(shù)年會通知

中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2017年科學(xué)與技術(shù)年會(簡稱2017學(xué)術(shù)年會)定于10月20～22日在福建省廈門市舉辦.會議主題是:創(chuàng)新驅(qū)動助推綠色發(fā)展.年會的主要內(nèi)容包括:1)特邀主旨報告會(開幕式);2)第一屆環(huán)?？萍紕?chuàng)新發(fā)展高端論壇;3)分會場研討會和論壇;4)特邀主旨報告會(閉幕式);5)中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會第八屆理事會第四次常務(wù)理事會(擴大)會議;6)第一屆國家環(huán)境保護工程技術(shù)中心技術(shù)交流年會;7)環(huán)境科技創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化、發(fā)布和展示;8)全國環(huán)境科學(xué)學(xué)會秘書長工作交流會;9)頒發(fā)“環(huán)境保護科學(xué)技術(shù)獎”、“環(huán)?？茖W(xué)與技術(shù)創(chuàng)新應(yīng)用示范項目”、“中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會學(xué)術(shù)年會(2017)光大環(huán)保優(yōu)秀論文獎”、“《中國環(huán)境科學(xué)》優(yōu)秀論文獎”等.會議設(shè)開幕式和閉幕式主會場、二十六個分會場、六個論壇、二個國際研討會以及七個專題活動.屆時,來自全國環(huán)境學(xué)科的專家學(xué)者,政府環(huán)境部門管理者,企業(yè)單位的研究開發(fā)、工程技術(shù)人員等將出席會議.歡迎大家踴躍報名參加.

詳情請見http://www.chinacses.org/newsNotice/2137.jhtml(關(guān)于舉辦中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會2017年科學(xué)與技術(shù)年會的第二輪通知)

Denitrification performance of the bacterium Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205.

ZHANG Shu-song1,2, FAN Yue-ting1,2, SUN Xing-bin1, QIU Tian-lei2, GAO Min2, WANG Xu-ming2,3*(1.College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2.Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijng Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China；3.Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097, China). China Environmental Science, 2017,37(9)：3532～3539

In order to enhance nitrogen removal from nitrate-contaminated water, a novel bacterial strain, Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T, was investigated to use different carbon sources for anoxic denitrification. Additionally, the aerobic denitrification performance for strain SL-205Twas studied using poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) as the sole carbon source. The results showed that the removal efficiencies of nitrate reached up to over 99% by strain SL-205Tusing sodium acetate, sodium succinate and PHBV as carbon sources under the anoxic conditions. The optimum addition dosage of PHBV was 2.0g/L with 315mg/L of the initial nitrate nitrogen. Strain SL-205Thad the capability to fully remove as much as 97.4% of nitrate nitrogen, and the average removal rate for nitrate nitrogen was 8.69mg/(L·h) after 36h under the aerobic conditions. Meanwhile, both nitrite and nitrous oxide were not accumulated. The results above-mentioned would lay an experimental foundation for nitrogen removal from wastewater by strain SL-205T.

Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T；nitrate:carbon source；poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV)；aerobic denitrification

X172

A

1000-6923(2017)09-3532-08

2017-01-18

國家自然科學(xué)基金(21077014);北京市自然科學(xué)基金(8152016);北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(KJCX20140420)

* 責(zé)任作者, 研究員, wangxuming@baafs.net.cn

張樹松(1989-),女,黑龍江佳木斯人,東北林業(yè)大學(xué)博士研究生,研究方向為環(huán)境生物技術(shù)與水污染控制.發(fā)表論文3篇.