龍海林　李康強(qiáng)　　許文東　　傅玉萍

[摘要] 綜合運(yùn)用各種色譜分離技術(shù)對(duì)海綿共生真菌Emericella variecolor的固體大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)成分研究，利用各種波譜技術(shù)進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果從該真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到6個(gè)單體化合物，分別鑒定為 （+）2acetyldihydroterrein （1），（+）3acetyldihydroterrein（2），anditomin（3），andilesin A（4），andilesin C（5），andilesin B（6）。其中化合物1和2為新化合物。

[關(guān)鍵詞] 海綿共生真菌； Emericella variecolor； 化學(xué)成分

Study on metabolites from a spongederived fungus

LONG Hailin， LI Kangqiang， XU Wendong， FU Yuping*

（National Engineer Research Center for the Modernization of Extraction and Separation of Traditional Chinese Medicine，

Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangzhou 510240， China）

[Abstract] We have carried out the investigation on a spongederived fungus，which was identified as Emericella variecolor from the south sea of China. Two new chemical constituents，（+）2acetyldihydroterrein （1） and （+）3acetyldihydroterrein （2），with four known compounds，anditomin （3），andilesin A （4），andilesin C （5） and andilesin B （6），were isolated from this fungus by column chromatography over silica gel， Sephadex LH20， and ODS. The structures of 1 and 2 were elucidated by spectroscopic methods including NMR，HRESIMS，and CD.

[Key words] spongederived fungus； Emericella variecolor； chemical constituents

海洋真菌兼具種屬多樣、分布廣、代謝途經(jīng)復(fù)雜的特性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已知約71.2萬(wàn)種海洋真菌可棲身諸如水體、底泥、砂石等無(wú)機(jī)質(zhì)生境，也可共附生于如藻類、無(wú)脊椎動(dòng)物、魚(yú)類等活體[1]。海綿共生真菌所處的生態(tài)環(huán)境兼具陸地生態(tài)系統(tǒng)無(wú)法比擬的高壓、高鹽、低光照和寡營(yíng)養(yǎng)的物理脅迫，也存在與其宿主長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中生物選擇脅迫，這種脅迫使兩者之間發(fā)生很多次基因重組或改變[2]，其互擾性和易擾性直接影響它們的次生代謝[34]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從海洋動(dòng)植物共生真菌中發(fā)現(xiàn)一些活性分子，有些具有罕見(jiàn)的結(jié)構(gòu)，如從海綿共附生真菌Penicillium terrestre中發(fā)現(xiàn)的膽堿酯酶抑制劑sorbiterrin A[5]，以及從海綿共附生細(xì)菌Ruegeria sp.中發(fā)現(xiàn)的新穎抗菌環(huán)肽類成分[6]等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者早在二十世紀(jì)六七十年代就已經(jīng)開(kāi)始對(duì)真菌Emericella variecolor進(jìn)行化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)了多種類型的化合物，如酮類[7]、萜類[89]、多烯吡喃酮類[10]、苯甲醇類[11]等。為了獲得更多的活性化合物，本實(shí)驗(yàn)采用大米固體培養(yǎng)基進(jìn)行微生物發(fā)酵，在正常室溫條件下培養(yǎng)海綿共生真菌Emericella variecolor 30 d，再用乙酸乙酯萃取大米培養(yǎng)基，之后對(duì)提取物進(jìn)行化學(xué)成分分離。在提取物中分離得到6個(gè)單體化合物，其中化合物1和2為新化合物，其他4個(gè)為已知化合物（圖1）。

1 材料

UV譜用JASCO V550 紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)定；旋光值用Autopol Ⅲ automatic polarimeter型旋光儀測(cè)定；HRESIMS用Agilent 1100 series LC/MSD Trap SL型質(zhì)譜儀測(cè)定；NMR用Bruker AvanceⅢ 400 MHz核磁共振儀測(cè)定；分析型HPLC用Shimadzu LC20AD 液相色譜儀測(cè)定，檢測(cè)器為SPDM20A；半制備使用Alltech LabAlliance Series Ⅲ儀器，配備UV檢測(cè)器。

硅膠薄層分析使用青島海洋化工廠的GF254薄層預(yù)制板；柱色譜硅膠（200～300目）為青島海洋化工廠產(chǎn)品；常壓反相ODS柱色譜使用的C18填料為日本YMC公司產(chǎn)品；凝膠柱色譜Sephadex LH20使用的是Pharmacia公司產(chǎn)品；分析用HPLC色譜柱為T(mén)hermo Scientific BDS Hypersil的C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；半制備柱為Waters SunfireTM C18柱（10 mm×250 mm，5 μm）；所有試劑為分析純或色譜純。

實(shí)驗(yàn)用菌種E. variecolor分離自中國(guó)南海采集到的海綿，菌種保藏于北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

菌株E. variecolor在經(jīng)過(guò)30 d大米培養(yǎng)基發(fā)酵后，將大米發(fā)酵物充分破碎，用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮后得到粗提物20 g，粗提物用80%甲醇混懸后用石油醚萃取3次，減壓回收甲醇水部位得到粗浸膏約10 g。粗浸膏首先用常壓ODS柱色譜分離，洗脫劑為30%，40%，50%，60%，70%甲醇梯度洗脫，得到5個(gè)流分（Fr.1～Fr.5）。Fr.3（5.2 g）再次進(jìn)行硅膠 （200～300目，300 g） 柱色譜，以CH2Cl2CH3OH（100∶1，50∶1，30∶1，15∶1，10∶1）梯度洗脫，相同組分合并，得到6個(gè)流分（Fr.3.1～Fr.3.6），其中Fr.3.3為化合物3（1.8 g），F(xiàn)r.3.5為化合物4（1.6 g），F(xiàn)r.3.1（0.5 g）再經(jīng)半制備液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色譜分離，得到化合物1（8 mg）和2（10 mg），F(xiàn)r.3.4（180 mg）和Fr.3.6（160 mg）分別用半制備液相 [CH3CNH2O（70∶30）] 色譜純化，分別得到化合物5（52 mg）和化合物6（48 mg）。endprint

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 為白色粉末；[α]20D+ 40.1（c 1.15，MeOH）；高分辨電噴霧質(zhì)譜（HRESIMS）顯示其準(zhǔn)分子離子峰為m/z 221.079 5 [M+Na]+（計(jì)算值 C10H14O4Na，221.079 0），說(shuō)明其相對(duì)分子質(zhì)量為198，分子式為C10H14O4，不飽和度為4；首先，分析1HNMR圖譜，該化合物的氫譜與化合物dihydroterrein[12]非常相似，只多了1個(gè)甲基信號(hào)δH 2.11（3H，s，H10），可能為乙酰基的甲基，根據(jù)13CNMR和HMBC圖譜發(fā)現(xiàn)，H10與羰基碳（C9）有相關(guān)信號(hào)，可確定化合物中含有1個(gè)乙?；?，HMBC圖譜中，H2[δH 5.00（d，J=3.0 Hz）]與C9有相關(guān)信號(hào)，可確定乙酰基通過(guò)氧原子與C2相連（表1）；化合物1的相對(duì)構(gòu)型可根據(jù)H2與H3的偶合常數(shù)J=3.0 Hz來(lái)確定，可知H2與H3處于反式，絕對(duì)構(gòu)型通過(guò)比較計(jì)算ECD與實(shí)測(cè)ECD來(lái)確定，C2與C3分別為R和S構(gòu)型，命名為（+）2acetyldihydroterrein（圖2）。

4 討論

21世紀(jì)前，海綿一直是發(fā)現(xiàn)海洋天然產(chǎn)物的最主要生物來(lái)源[1620]，發(fā)現(xiàn)了許多化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，生物活性顯著、作用機(jī)制獨(dú)特的功能小分子，其中的一些已經(jīng)作為新藥候選先導(dǎo)化合物，處于臨床前或臨床研究階段；海綿共生真菌作為海綿宿主的重要組成部分，兩者互相協(xié)作，共同適應(yīng)海洋復(fù)雜的生存環(huán)境，海綿為真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和寄生產(chǎn)所，共生真菌為海綿抵御外來(lái)環(huán)境的威脅而釋放一些化學(xué)物質(zhì)；海綿共生真菌體內(nèi)蘊(yùn)藏著巨大的生物合成基因簇，大力挖掘海綿共生真菌的天然產(chǎn)物合成潛力，是獲得活性化學(xué)成分的又一寶貴途徑，總之，海綿及其共生微生物是開(kāi)發(fā)先導(dǎo)化合物的重要資源。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint