吳 耽，江婷婷，趙 青，楊傳玉，陳思穎，楊 暢，孫 佳，劉 亭，蘭燕宇

(1. 貴州省藥物制劑重點實驗室；2. 貴州醫(yī)科大學藥學院；3. 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，4. 國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004)

◇研究簡報◇

鐵皮石斛多糖抗阿司匹林誘導人胃黏膜上皮細胞GES-1損傷的保護作用機制研究

吳 耽1,2,4，江婷婷1,2，趙 青1,2，楊傳玉1,3，陳思穎1,3，楊 暢1,3，孫 佳1,3，劉 亭1,3，蘭燕宇1,3

(1. 貴州省藥物制劑重點實驗室；2. 貴州醫(yī)科大學藥學院；3. 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，4. 國家苗藥工程技術研究中心，貴州 貴陽 550004)

細胞因子(cytokine, CK)是由免疫細胞和非免疫細胞合成分泌的，存在于細胞間的一類具有調節(jié)機體免疫功能、介導炎癥反應、參與組織修復和提高機體抵抗力的一類高效的功能蛋白質，其能感受外界因素對機體的刺激，并將信息傳遞給體內，可分為蛋白質、多肽或糖蛋白。大量文獻報道，人胃黏膜上皮GES-1細胞受阿司匹林、乙醇、幽門螺桿菌損傷后，也會釋放多種能誘導炎癥發(fā)生的細胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等[1-3]。同時，研究發(fā)現非甾體抗炎藥可激活NF-κB通路，參與胃黏膜損傷的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)的干燥莖，為我國傳統(tǒng)名貴藥材，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[6]。在鐵皮石斛的前期的實驗中發(fā)現，鐵皮石斛多糖(polysaccharides fromDendrobiumofficinale, DOP)對阿司匹林損傷GES-1細胞具有保護作用[6]?；诖?，本實驗用DOP預處理GES-1細胞后加阿司匹林誘導損傷，對GES-1細胞分泌的炎癥因子TNF-α、IL-6及其mRNA，以及NF-κB通路相關蛋白表達進行研究，為研發(fā)鐵皮石斛抗胃黏膜損傷的機制研究提供理論基礎。

1 材料

1.1細胞人永生化胃黏膜上皮細胞GES-1，購于上海中科院細胞庫，接種于含10%胎牛血清、1% 100 kU·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、相對濕度為90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，每3 d按1 ∶3比例傳代。實驗用細胞均為指數生長期細胞。

1.2藥品與試劑阿司匹林(貴州圣都藥業(yè)有限公司)；鐵皮石斛藥材(批號：20151109 ，貴州醫(yī)科大學生藥教研室龍慶德副教授鑒定)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco)；TRIzol總RNA提取試劑(Invitrogen)；TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(大連寶生物有限公司)；TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒(欣波盛生物科技有限公司)。

2 方法

2.1樣品制備DOP的制備方法參見文獻[6]，經硫酸苯酚法檢測糖含量為30%。加DMSO溶解，配制成10g·L-1的母液，臨用前用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋。

2.2GES-1分組實驗共分為5組，每實驗組5個復孔。正常對照組，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，不加阿司匹林和藥液；模型阿司匹林對照組，終濃度18.5 mmol·L-1[6]；藥物組為濃度為50、100、300 ng·L-1的DOP預處理24 h后，加入阿司匹林，使其濃度為18.5 mmol·L-1混合液，各藥物組作用GES-1細胞24 h后，取上清液進行后續(xù)實驗。

2.3GES-1分泌TNF-α、IL-6及其mRNA表達水平GES-1細胞按“2.2”方法處理，按照相應試劑盒方法測定TNF-α、IL-6及其mRNA表達量。測定參照NCBI收錄TNF-α、IL-6、GAPDH的mRNA的序列，引物設計與合成由重慶貝輝科技有限公司完成。

Tab 1 Effects of DOP pretreatment on TNF-α, IL-6 and mRNA expression in aspirin-induced GES-1 cells (±s,n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

2.4GES-1損傷NF-κB通路p-IκBα、IκBα、p65和p-p65蛋白表達水平測定按“2.2”法處理GES-1細胞，采用RIPA裂解緩沖液提取細胞中的蛋白， BCA法測定蛋白含量。用Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，測定NF-κB通路相關蛋白和β-actin的灰度值的比值，反映蛋白p-IκBα、IκBα、p65和p-p65表達水平的影響。

3 結果

3.1DOP對GES-1分泌炎癥因子TNF-α、IL-6及其mRNA表達水平的影響ELISA結果表明(Tab 1)，阿司匹林刺激GES-1細胞后，釋放出大量的TNF-α、IL-6，與空白組比較差異有顯著性(P<0.01)。多糖與阿司匹林共同作用細胞后，與模型組相比，各組的TNF-α、IL-6釋放量明顯減少，隨藥物濃度的增高，其含量逐漸降低，中、高劑量效果明顯(P<0.05,P<0.01)。RT-PCR檢測數據顯示，阿司匹林刺激后IL-6、TNF-α mRNA表達與對照組比較均有所提高(P<0.01)，DOP能劑量依賴性地抑制相關mRNA表達(P<0.01)。

3.2DOP對阿司匹林誘導的GES-1細胞炎癥信號通路NF-κB的p-IκBα、IκBα、p65和p-p65蛋白表達水平的影響Western blot結果顯示(Tab 2)，與空白對照組相比，阿司匹林作用GES-1細胞24 h能明顯增加IκBα、p65磷酸化水平，明顯下調IκBα、p65的蛋白表達量。與模型組相比，DOP能劑量依賴性降低阿司匹林刺激引起的IκBα、p65磷酸化，上調IκBα、p65的蛋白表達量。

Tab 2 Effects of DOP on aspirin-induced expression ofNF-κB protein in GES-1 cells (±s,n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 討論

該研究發(fā)現在阿司匹林誘導GES-1損傷模型中，阿司匹林能刺激GES-1細胞分泌TNF-α、IL-6因子并上調相關mRNA的表達，以及使IκBα、p65磷酸化水平明顯上升、IκBα、p65的蛋白表達量明顯下降。DOP在實驗濃度內可下調TNF-α、IL-6的分泌和相關mRNA的表達、降低NF-κB通路中IκBα、p65磷酸化以及增加IκBα、p65的蛋白表達量，從而使GES-1損傷細胞炎癥因子釋放量及其mRNA表達水平趨于正常細胞，起到抗阿司匹林損傷作用。本實驗初步表明DOP抗阿司匹林誘導GES-1損傷與NF-κB信號通路有關。

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TheprotectionmechanismofpolysaccharidefromDendrobiumofficinaleoninjuryofhumangastricepithelialcellsGES-1inducedbyaspirin

WU Dan1,2,4, JIANG Ting-ting1,2, ZHAO Qing1,2, YANG Chuan-yu1,3, CHEN Si-ying1,3, YANG Chang1,3, SUN Jia1,3, LIU Ting1,3, LAN Yan-yu1,3

(1.GuizhouProvincialKeyLabofPharmaceutics; 2.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity; 3.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCM,MinistryofEducation; 4.NationalEngineeringResearchCenterofMiao'sMedicines,Guiyang550004,China)

鐵皮石斛；多糖；阿司匹林；GES-1細胞；NF-κB信號通路；機制

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; polysaccharide; aspirin; GES-1 cells; NF-κB pathway; mechanism

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.029

A

：1001-1978(2017)10-1479-02

R-332；R284.1；R322.44；R392.12；R573；R971.1；R973

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.058.html

2017-05-10,

2017-08-26

貴州省中藥現代化科技產業(yè)研究開發(fā)項目(黔科合SY字[2014]3032-2號)；貴州省科學技術廳人才團隊項目(黔科合平臺人才[2016]56135677)

吳 耽(1994-)，女，碩士生，研究方向：中藥新藥研發(fā)與藥代動力學，Tel: 0851-6908899，E-mail:695434494@qq.com; 蘭燕宇(1958- )，女，教授，研究方向：中藥藥效物質基礎及新藥開發(fā)，通訊作者，Tel: 0851-86908468，E-mail: yanyu626 @ 126.com