李國(guó)停，鐘瑞華，周潔蕓，謝淑武，陳 平，錢(qián)越英，朱 焰

(1. 復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥物發(fā)展室生殖藥理組，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2.浙江大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，浙江 杭州 310028；3.中國(guó)科學(xué)院物理化學(xué)研究所，北京 100190)

◇論著◇

鬼臼毒素誘導(dǎo)離體大鼠附睪上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

李國(guó)停1，鐘瑞華1，周潔蕓1，謝淑武1，陳 平2，錢(qián)越英3，朱 焰1

(1. 復(fù)旦大學(xué)生殖與發(fā)育研究院上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥物發(fā)展室生殖藥理組，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育藥具重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；2.浙江大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，浙江 杭州 310028；3.中國(guó)科學(xué)院物理化學(xué)研究所，北京 100190)

目的探討鬼臼毒素(podophyllotoxin, PPT)抑制SD大鼠附睪上皮細(xì)胞增殖作用，揭示其誘導(dǎo)凋亡的相關(guān)分子機(jī)制。方法體外培養(yǎng)大鼠原代附睪上皮細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)鬼臼毒素作用24、48、72 h后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化；AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)； RT-PCR技術(shù)研究TNF-α mRNA的變化；ELISA法檢測(cè)鬼臼毒素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液TNF-α水平的影響；Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞色素C、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示，鬼臼毒素能明顯抑制大鼠附睪上皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，并呈劑量及時(shí)間依賴性(P<0.05)，24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(95%置信區(qū)間)分別為59.36(15.50～227.41)、0.37(0.080～1.70)、0.077(0.017～0.35) μmol·L-1；透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，鬼臼毒素引起附睪上皮細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞核破碎，線粒體空泡化；RT-PCR和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，鬼臼毒素能升高TNF-α mRNA水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量；Western blot結(jié)果顯示，鬼臼毒素能明顯增加細(xì)胞中細(xì)胞色素C、caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白表達(dá)。結(jié)論鬼臼毒素可通過(guò)線粒體調(diào)控的內(nèi)源性通路和TNF受體介導(dǎo)的外源性通路，誘導(dǎo)大鼠附睪上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。

鬼臼毒素；生育力；大鼠附睪上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線粒體；TNF-α；caspase活化

鬼臼毒素(podophyllotoxin, PPT)是從鬼臼屬、八角蓮屬、山荷葉屬和刺柏植物中提取的木質(zhì)素類化合物。研究表明，鬼臼毒素具有明顯的抗腫瘤[1-2]和抗病毒活性[3]。鬼臼毒素的軟膏劑及酊劑(尤脫欣)已在臨床上用于治療人乳頭狀瘤病毒引起的尖銳濕疣[4]。已有報(bào)道稱鬼臼樹(shù)脂類在治療女性妊娠期尖銳濕疣時(shí)具有致畸作用[5]，但鬼臼毒素作為尖銳濕疣外用藥，頻繁甚至過(guò)量用藥后對(duì)男性用藥部位正常細(xì)胞的可能影響方面報(bào)道較少。課題組前期研究大鼠體內(nèi)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含鬼臼毒素的球果提取物可降低雄性大鼠的生育力，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)附睪有一定的損傷。本文對(duì)鬼臼毒素體外對(duì)大鼠附睪上皮細(xì)胞的增殖抑制活性及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague Dawley(SD)大鼠，♂,體質(zhì)量200～220 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(滬)2013-0016。

1.1.2藥物與試劑 鬼臼毒素(C22H22O8)：高效液相色譜(high performance liquid chromatography , HPLC)≥98%，美國(guó)Enzo Life Sciences公司；DMEM/F12培養(yǎng)液(批號(hào)：1580817)、胎牛血清(批號(hào):1502284)、漢克平衡鹽緩沖液(Hank′s balanced salt solution, HBSS)(批號(hào)：1491037)、胰蛋白酶，美國(guó)Gibco公司； 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)(批號(hào)：GB719)，日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；Ⅰ型膠原酶(批號(hào)：1001424536)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide , DMSO)，美國(guó)Sigma公司； Annexin V- FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：3337788)、PI/RNase 染液(批號(hào)：2216713)，美國(guó)BD公司；原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒-Fluorescein(批號(hào)：10131400),德國(guó)Roche公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)ELISA試劑盒(批號(hào)：320850)，R&D Systems；蛋白酶抑制劑(批號(hào)：ME156877)，美國(guó)Thermo公司；蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物科技有限公司；β-actin、細(xì)胞色素C、caspase-3、caspase-8、caspase-9抗體，英國(guó)Abcam公司。1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；細(xì)胞離心機(jī)(無(wú)錫瑞江離心機(jī)廠)；AE31型倒置相差顯微鏡(廈門(mén)麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；恒溫水浴鍋(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；ESCO超凈工作臺(tái)(新加坡藝思高生物科技有限公司)；Synergy 2酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)；透射電子顯微鏡(日本飛利浦公司)；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司)；CFX-96型熒光定量PCR儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、Western blot 凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)方法稍作修改，進(jìn)行大鼠附睪上皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[6]。將大鼠乙醚麻醉處死，解剖，取出雙側(cè)附睪置于含有HBSS的培養(yǎng)皿中，小心剝除脂肪等其他組織。分離好的附睪組織剪碎，用不含Ca2+、Mg2+的HBSS沖洗并過(guò)濾3遍，除去精子。附睪組織碎塊移入0.25%胰酶(含EDTA)溶液中， 32℃水浴振蕩(80 r·min-1)消化20 min。組織樣懸液離心(800 r·min-1, 5 min)，棄上清，沉淀用Ⅰ型膠原酶(1 g·L-1)混懸，32℃水浴振蕩(80 r·min-1)消化30～40 min，細(xì)胞團(tuán)處于完全解離狀態(tài)，靜置5 min，70 μm孔徑篩網(wǎng)過(guò)濾后，濾液離心(800 r·min-1，6 min)。棄上清，沉淀物大部分為附睪上皮細(xì)胞，分別用HBSS及培養(yǎng)液重懸。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24 h后，換液以去除未貼壁細(xì)胞，此后按1 ∶2反復(fù)傳代純化附睪上皮細(xì)胞。原代培養(yǎng)和傳代過(guò)程中均于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，實(shí)驗(yàn)使用第3～5代細(xì)胞。

1.2.2CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化，按每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)液中依次加入不同濃度的鬼臼毒素，使培養(yǎng)液的總體積是100 μL。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μL的CCK-8，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，在450 nm處測(cè)其OD值。按下式計(jì)算增殖抑制率：

1.2.3透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞加入鬼臼毒素，使其終濃度分別為0.024、0.24、2.4 μmol·L-1，對(duì)照組加等體積DMSO，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，消化、離心、收集細(xì)胞，用戊二醛與鋨酸固定液固定細(xì)胞，乙醇脫水，LR White樹(shù)脂滲透包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，不同濃度鬼臼毒素作用48 h后收集細(xì)胞，PBS 洗細(xì)胞2次，按照試劑盒方法將細(xì)胞重懸于100 μL含Annexin V-FITC和PI的緩沖液中，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率。

1.2.5TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將細(xì)胞接種于6孔板中(含多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片)，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，更換新培養(yǎng)液并加入不同濃度的鬼臼毒素，藥物作用48 h后取出細(xì)胞爬片。PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min后，PBS清洗2遍，0.25% Triton X-100處理10 min后，PBS浸洗2遍，待玻片干后，加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(5 μL TdT+45 μL熒光素標(biāo)記的dUTP混勻)于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中反應(yīng)1 h(37℃)，PBS漂洗3次，加1滴PBS，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞(激發(fā)光波長(zhǎng)為450～500 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為515～565 nm)。

1.2.6RT-PCR法檢測(cè)鬼臼毒素對(duì)TNF-α mRNA表達(dá)的影響 不同濃度鬼臼毒素(2.4、0.24、0.024、0 μmol·L-1) 處理細(xì)胞48 h后，TRIzol Reagent提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。TNF-α引物設(shè)計(jì)序列為forward: 5′-CACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3′, reverse:5′-TCCGCTTGGTGGTTTGC-3′，同時(shí)以GAPDH 為內(nèi)參照，GAPDH引物序列為forward:5′-AGTGCCAGCCTCGTCTCATAG-3′, reverse:5′-CGTTGAACTTGCCGTGGGTAG-3′。以合成的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(按SYBR Green 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行)。PCR體系為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 10.0 μL、cDNA 1 μL、上、下游引物各0.4 μL、去離子水8.2 μL。反應(yīng)條件: 預(yù)變性95℃ 15 min，變性95℃ 15 s，退火60℃ 25 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，Ct取其均值，以GAPDH做為內(nèi)參。△Ct=CtTNF-α-CtGAPDH，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對(duì)照組。不同樣本的目的基因表達(dá)的相對(duì)差異量=2-△△Ct。

1.2.7ELISA法檢測(cè)鬼臼毒素對(duì)TNF-α分泌水平的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后加入終濃度分別為0(對(duì)照組)、0.0024、0.024、0.24、2.4 μmol·L-1的鬼臼毒素，每個(gè)藥物組各設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。作用48 h后取上清液，按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明加上清液樣品，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)490 nm處讀OD值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算條件培養(yǎng)液中TNF-α含量。

1.2.8Western blot 技術(shù)檢測(cè)鬼臼毒素對(duì)caspase-8、細(xì)胞色素C、caspase-9、procaspase-3和活性caspase-3蛋白表達(dá)的影響 將5組(0、0.0024、0.024、0.24、2.4 μmol·L-1)鬼臼毒素分別作用細(xì)胞48 h后，冰上提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。40 μg蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗，4℃孵育過(guò)夜；PBS洗膜(15 min×3次)后，二抗(1 ∶4 000)室溫孵育2 h；PBS充分洗滌，加ECL顯影液，將膜置于凝膠成像儀中曝光，各目的條帶與β-actin 條帶灰度值比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1鬼臼毒素對(duì)附睪上皮細(xì)胞增殖的抑制作用CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同劑量組鬼臼毒素(0、0.00024、0.0024、0.024、0.24、2.4、24 μmol·L-1)分別作用于大鼠附睪上皮細(xì)胞24、48、72 h后，均能抑制細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，各組抑制率見(jiàn)Fig 1。由Fig 1可看出，鬼臼毒素作用24 h抑制增殖作用不及48、72 h；48 h的半數(shù)抑制率IC50為(0.37±0.01)μmol·L-1、72 h的半數(shù)抑制率IC50為(0.077±0.0009)μmol·L-1。

Fig 1 Podophyllotoxin inhibits growth of culturedrat epididymal epithelial cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol

2.2鬼臼毒素作用附睪上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化如Fig 2所示，正常細(xì)胞的細(xì)胞核較大，細(xì)胞器豐富，尤其是線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，線粒體圓形或橢圓形；基質(zhì)豐富，核內(nèi)染色體分布均勻(Fig 2A)。當(dāng)鬼臼毒素劑量為0.024 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞核固縮，大量線粒體腫脹并空泡化，細(xì)胞質(zhì)變性(Fig 2B)。當(dāng)鬼臼毒素劑量為0.24 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮，細(xì)胞質(zhì)空泡化嚴(yán)重(Fig 2C)。當(dāng)鬼臼毒素劑量為2.4 μmol·L-1時(shí)，微絨毛脫落，胞質(zhì)變性，出現(xiàn)細(xì)胞核碎片，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的中晚期凋亡形態(tài)改變(Fig 2D)。

Fig 2 The ultra structural change of epedidymal epithelial cells

A:Control group;B:Treated with 0.024 μmol·L-1podophyllotoxin;C:Treated with 0.24 μmol·L-1podophyllotoxin;D:Treated with 2.4 μmol·L-1podophyllotoxin. ☆,microtubule; ★,chromatin condensation and fragmentation; △,mitochondria; ▲,mitochondrial vacuolation;■,nucleus fragments

2.3鬼臼毒素誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中呈現(xiàn)了不同標(biāo)志的細(xì)胞群：正常細(xì)胞即雙陰性細(xì)胞(Annexin V-/PI-)、早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)、晚期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI+)和壞死細(xì)胞(Annexin V-/PI+)。不同濃度的鬼臼毒素作用附睪上皮細(xì)胞48 h后，各給藥組與對(duì)照組(0 μmol·L-1鬼臼毒素)相比，細(xì)胞凋亡率均明顯增加，且呈劑量依賴性，說(shuō)明鬼臼毒素能明顯誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞凋亡(Tab 1、Fig 3)。

Tab 1 Cell apoptotic rate of podophyllotoxininduced epididymal epithelial cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol

Fig 3 Apoptotic rate of epididymal epithelial cells treated with podophyllotoxin for 48 h detected by Annexin V-FITC/PI double-staining

The apoptotic rate of podophyllotoxin-treated cells increased in a dose-dependent manner after 48 h treatment

Fig 4 Podophyllotoxin-induced apoptosis of epididymal epithelial cells assessed by TUNEL method

A:0 μmol·L-1PPT;B:0.024 μmol·L-1PPT;C:0.24 μmol·L-1PPT;D:2.4 μmol·L-1PPT

2.4鬼臼毒素誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)如Fig 4 所示，用原位末端標(biāo)記法觀察細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組中活細(xì)胞核不顯示綠色熒光，而在加藥組中發(fā)現(xiàn)了凋亡細(xì)胞，它的核染色質(zhì)著綠色熒光，呈固縮狀，并且在鬼臼毒素2.4 μmol·L-1時(shí)出現(xiàn)明顯的凋亡小體。

2.5鬼臼毒素增加附睪上皮細(xì)胞TNF-αmRNA的表達(dá)RT-PCR數(shù)據(jù)分析顯示，鬼臼毒素各劑量組均能升高TNF-α mRNA的表達(dá)，且呈劑量依賴性(Fig 5)；當(dāng)鬼臼毒素濃度為2.4 μmol·L-1時(shí)，TNF-α mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的38.7倍，反映了鬼臼毒素能明顯提高細(xì)胞中TNF-α mRNA的表達(dá)。

2.6鬼臼毒素增加附睪上皮細(xì)胞TNF-α的分泌水平ELISA結(jié)果顯示(Tab 2)，與對(duì)照組相比，鬼臼毒素能夠明顯增加細(xì)胞上清中TNF-α的水平(P<0.05),其效應(yīng)具有明顯的劑量依賴性。

2.7鬼臼毒素對(duì)細(xì)胞色素C和caspase蛋白家族的影響Western blot結(jié)果顯示(Fig 6)，不同濃度鬼臼毒素作用于附睪上皮細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照組相比，caspase-8、細(xì)胞色素C、caspase-9、procaspase-3和活性caspase-3蛋白條帶灰度逐漸加深。圖像分析結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加，caspase-8、細(xì)胞色素C、caspase-9、procaspase-3和活性caspase-3蛋白表達(dá)均有不同程度的增加,同時(shí)活性caspase-3表達(dá)量高于procaspase-3 2倍，提示鬼臼毒素能上調(diào)附睪上皮細(xì)胞細(xì)胞色素C和caspase家族蛋白的表達(dá)。

Tab 2 Podophyllotoxin-induced increaseof released TNF-α in epididymal epithelial cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol

3 討論

鬼臼毒素作為良好的抗病毒及抗腫瘤藥物近年來(lái)備受關(guān)注，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)雄性大鼠口服含鬼臼毒素的提取物7周后，大鼠生育力明顯下降，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)附睪上皮出現(xiàn)損傷，附睪內(nèi)精子數(shù)量明顯下降。為了進(jìn)一步研究鬼臼毒素對(duì)附睪上皮的影響機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)體外原代培養(yǎng)附睪上皮細(xì)胞給藥，發(fā)現(xiàn)鬼臼毒素明顯抑制附睪上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、透射電鏡觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率等，我們觀察到鬼臼毒素具有明顯誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。

Fig 5 Effect of podophyllotoxin on expression of TNF-α mRNAin epididymal epithelial cells by real time RT-PCR(±s,n=3)

*P<0.05vscontrol

細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到多基因調(diào)控的細(xì)胞自發(fā)的死亡，是一種程序性的生物學(xué)過(guò)程，又稱為細(xì)胞程序性死亡。細(xì)胞凋亡主要的2種途徑是線粒體途徑和死亡受體途徑[7]。線粒體途徑的主要起始因子是細(xì)胞色素C和caspase-9, 細(xì)胞色素C自線粒體的釋放標(biāo)志著線粒體凋亡通路的激活，而caspase-9被募集到細(xì)胞色素C/dATP/Apaf-1組成的凋亡體，參與線粒體通路的細(xì)胞凋亡[8]。死亡受體途徑的關(guān)鍵起始因子是caspase-8，活化的caspase-8被募集到Fas和腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)死亡受體復(fù)合物，參與死亡受體通路[9]。最終活化caspase-8、caspase-9等，激活caspase家族的關(guān)鍵效應(yīng)因子caspase-3，活化的caspase-3通過(guò)對(duì)其底物蛋白的切割而使許多與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期及DNA修復(fù)相關(guān)蛋白或激酶失活，從而使細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡[10]。

TNF-α具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其通過(guò)與細(xì)胞膜表面的特異性受體TNFR結(jié)合，活化初始caspase-8[11-12]，活化的caspase-8一方面剪切Bid，剪切后的Bid促使Bax同源二聚體與線粒體膜結(jié)合，介導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等，在細(xì)胞色素C、凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1和caspase-9的參與下，形成有活性的二聚體，進(jìn)一步激活caspase-3；另一方面，活化的caspase-8還可以直接激活下游的caspase-3[7]?；罨腸aspase-3能裂解DNA修復(fù)相關(guān)分子、凋亡抑制蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及骨架蛋白等，促使細(xì)胞凋亡，從而連接起內(nèi)源性和外源性凋亡途徑。

在本研究中，RT-PCR及ELISA結(jié)果顯示，鬼臼毒素可使TNF-α的mRNA水平及翻譯水平升高，同時(shí)Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鬼臼毒素作用附睪上皮細(xì)胞48 h后，可使caspase-8、細(xì)胞色素C、caspase-9、procaspase-3、活性caspase-3等蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性升高，且活性caspase-3表達(dá)量高于procaspase-3，用藥組活性caspase-3和procaspase-3二者總表達(dá)量遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組，表明鬼臼毒素對(duì)外源性和內(nèi)源性細(xì)胞凋亡均有明顯的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，鬼臼毒素對(duì)大鼠附睪上皮細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，其機(jī)制可能與鬼臼毒素促進(jìn)附睪上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，該凋亡作用可能通過(guò)上調(diào)TNF-α及caspase家族蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性和外源性凋亡。

Fig 6 Podophyllotoxin-induced activation of caspases and cytochrome C in epididymal epithelial cells(±s，n=3)

*P<0.05vscontrol

(致謝：本實(shí)驗(yàn)全部由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所藥物發(fā)展室生殖藥理組實(shí)驗(yàn)室朱焰老師課題組獨(dú)立完成，曹霖教授給予了本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)性的意見(jiàn)；實(shí)驗(yàn)室桂幼倫、郭湘潔、李釗等老師均在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予了重要幫助，謹(jǐn)此致以誠(chéng)摯的謝意！)

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Studyonpodophyllotoxininducedratepididymalepithelialcellapoptosisanditsmechanisminvitro

LI Guo-ting1, ZHONG Rui-hua1, ZHOU Jie-yun1, XIE Shu-wu1, CHEN Ping2, QIAN Yue-ying3, ZHU Yan1

(1.DeptofReproductivePharmacology,KeyLabofReproductionRegulationofNPFPC,SIPPR,IRD,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2.DeptofChemistry,FacultyofScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310028,China;3.TechnicalInstituteofPhysicsandChemistry,ChineseAcademyofSciences,Beijing100190,China)

AimTo investigate the proliferative effect and the apoptosis of rat epididymal epithelial cells induced by podophyllotoxin and its underlying mechanisms.MethodsPrimary epididymal epithelial cells were culturedinvitro.CCK-8 assay was used to analyze proliferation of epididymal epithelial cells induced by podophyllotoxin on 24, 48 and 72 h. The ultra structural changes of the epididymal epithelial cells were observed by transmission electron microscope. AnnexinV-FITC/PI staining was used to quantify the percentages of apoptosis in the total cell population. The TdTmediated dUTP nick end labeling(TUNEL) technique was applied to observe the morphological changes of apoptotic cells. The expression of tumor necrosis factor alpha(TNF-α) mRNA was investigated by real-time RT-PCR. The level of TNF-α in cell culture supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) technology. Western blot was per-formed to determine the protein expression of cytochrome C, caspase-3, caspase-8, caspase-9.ResultsPodophyllotoxin significantly inhibited the activity of proliferation and induced apoptosis of epididymal epithelial cells in a dose- and time-dependent manner(P<0.05), with a 50% inhibitory concentration(IC50) value and corresponding 95% confidence intervals(CI) of 59.36(15.50～227.41), 0.37(0.080～1.70), 0.077(0.017～0.35) μmol·L-1at 24, 48 and 72 h, respectively. Podophyllotoxin induced cell volume turned round and cell nuclear fragmentation and mitochondrial vacuolation. RT-PCR and ELISA results showed that podophyllotoxin improved the expression of TNF-α mRNA and protein. Western blot results demonstrated that podophyllotoxin activated the protein expression of cytochrome C, caspase-3, caspase-8 and caspase-9.ConclusionPodophyllotoxin can induce rat epididymal epithelial cell apoptosis through both the mitochondria-regulated intrinsic pathway and the TNF receptor-mediated extrinsic pathway.

podophyllotoxin; fertility; rat epididymal epithelial cell; cell apoptosis; mitochondria;TNF-α;caspase activation

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.007

A

：1001-1978(2017)10-1357-07

R-332；R284.1；R322.64；R329.25；R697；R977.6

時(shí)間：2017-9-5 9:25 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.014.html

2017-04-20,

2017-07-18

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No 2012BAI31B08)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81100463)

李國(guó)停(1989-)，女，碩士生，研究方向：生殖藥理學(xué)， E-mail：ligt89@sippr.org; 朱 焰(1970-)，女，博士，研究員，研究方向：避孕藥和生殖藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:zhuyan@sippr.org