劉碩，陶曉奇

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

β-興奮劑在動(dòng)物性食品中殘留的免疫分析方法研究進(jìn)展

劉碩，陶曉奇*

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

β-興奮劑能夠降低動(dòng)物體內(nèi)脂肪含量，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，提高瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率，常被用作飼料添加劑。但是由于β-興奮劑會(huì)在動(dòng)物組織內(nèi)殘留，通過(guò)動(dòng)物源食品進(jìn)入人體內(nèi)，會(huì)引起心悸、頭疼、毒害肝腎等嚴(yán)重危害，包括我國(guó)在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家已禁止畜牧業(yè)中應(yīng)用此類藥物。文章就免疫分析法總結(jié)介紹其基本原理、研究進(jìn)展、優(yōu)缺點(diǎn)、發(fā)展趨勢(shì)，涵蓋放射免疫分析、酶免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、熒光免疫分析、膠體金標(biāo)記免疫分析、免疫傳感器、免疫芯片、流動(dòng)注射免疫分析、免疫PCR等技術(shù)。

β-興奮劑；免疫分析法；快速檢測(cè)

β-興奮劑，又稱為β-腎上腺素受體興奮劑，是一組結(jié)構(gòu)和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，用于哮喘和產(chǎn)后疼痛的臨床治療[1]，同時(shí)能夠通過(guò)刺激β-腎上腺素受體促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，增加肌肉生長(zhǎng)和減少脂肪沉積[2]。根據(jù)苯環(huán)上取代基的不同分為苯胺型、苯酚型以及苯二酚型三大類，常見(jiàn)有克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特羅等。

然而，若動(dòng)物攝入β-興奮劑且殘留于動(dòng)物體內(nèi)的藥物通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體中，輕則引起心悸、頭疼、目眩、惡心，重則對(duì)肝、腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生毒副作用[3]。目前，歐盟已禁止在畜牧業(yè)中使用此類藥物[4]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)文件規(guī)定：克倫特羅、沙丁胺醇、西馬特羅及其鹽、酯在所有食品動(dòng)物及所有可食組織中禁止使用，并且不得檢出[5]。

免疫分析法(immunoassays，IAS)是以抗原抗體特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的分析方法。本文主要對(duì)各種免疫分析法在β-興奮劑類獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 放射免疫分析

放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原(抗體)同抗體(抗原)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)的放射性同位素體外微量分析方法，最早由美國(guó)科學(xué)家YALOW和BERSON[6]利用131I標(biāo)記的胰島素與血漿中的胰島素競(jìng)爭(zhēng)有限的抗體。GRANJA等[7]對(duì)于β-興奮劑(克倫特羅，馬布特羅，溴布特羅，西馬特羅，辛可特羅)的多殘留篩選方法和在牛肝臟中沙丁胺醇的多殘基篩選方法進(jìn)行了驗(yàn)證研究，8種目標(biāo)化合物的檢測(cè)能力值為0.25～0.5 g/kg。該法靈敏度達(dá)10-12～10-13mol/L、特異性強(qiáng)、精確度佳且樣品用量少，但放射性核素對(duì)人體存在一定的危害，限制其在農(nóng)獸藥殘留分析中的應(yīng)用，甚至趨向于被淘汰。

2 熒光免疫分析

熒光免疫分析(fluorescent immunoassay，F(xiàn)IA)是以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤物的一種免疫測(cè)定方法，分為熒光偏振免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析、量子點(diǎn)熒光免疫分析、熒光猝滅免疫分析和熒光增強(qiáng)免疫分析等幾類：

1.1熒光偏振免疫分析(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PIA)

熒光偏振免疫分析采用均相反應(yīng)模式，是一種基于熒光偏振和免疫競(jìng)爭(zhēng)原理的定量免疫分析技術(shù)，游離的藥物分子體積小，受到偏振光照射后產(chǎn)生熒光的偏振方向被分散，而小分子藥物與抗體結(jié)合后，增大了分子體積，受到偏振光照射后能產(chǎn)生偏振光，且隨著濃度的增大而增大[8]。袁利鵬等[9]將沙丁胺醇半琥珀酸與異硫氫酸熒光素己二胺衍生物反應(yīng)合成熒光示蹤物SAL-HDF，利用熒光偏振免疫分析法檢測(cè)沙丁胺醇，通過(guò)優(yōu)化示蹤物和抗體的最適工作質(zhì)量濃度，結(jié)果表明，該法的LOD值為72.36 ng/mL，IC50為975.18 ng/mL，檢測(cè)范圍為178.08～4 871.15 ng/mL，平均回收率為(99.91±2.60)%，變異系數(shù)為2.60%。FPIA的優(yōu)點(diǎn)為在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不需要分離，反應(yīng)僅需要幾秒鐘到幾分鐘。同時(shí)，F(xiàn)P是一個(gè)比值，不會(huì)受到溶液顏色轉(zhuǎn)變及儀器靈敏度的影響。因此，F(xiàn)PIA的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，近年來(lái)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用日趨廣泛，但這種方法，靈敏度比ELISA低，檢測(cè)限一般在0.1～10 ng之間，檢測(cè)過(guò)程中容易受到光散射和樣本基質(zhì)的影響[10]。

1.2時(shí)間分辨熒光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)

該法為消除生物材料中的背景干擾，根據(jù)背景具有熒光衰變期短的特點(diǎn)，利用長(zhǎng)壽命的熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)壽命較短的生物材料背景熒光完全衰減后再進(jìn)行檢測(cè)以此消除本底的干擾，采用鑭系元素作標(biāo)記物，可保存1～2年，靈敏度達(dá)到RIA水平。侯文慧[11]用銪標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)沙丁胺醇，IC50為1.6 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.39 ng/mL～12.77 ng/mL，LOD值為0.136 ng/mL，其特異選擇性高，與克倫特羅的交叉率較小(2.29%)，而與萊克多巴胺沒(méi)有交叉，在豬肉、豬肝、豬尿、飼料4 種基質(zhì)的平均加標(biāo)回收率分別為98.02%、96.03%、108.73%、 106.09%。

1.3熒光猝滅免疫分析(fluorescencequenchingimmunoassay，F(xiàn)QIA)和熒光增強(qiáng)免疫分析(fluorescenceenhancedimmunoassay，F(xiàn)EIA)

熒光淬滅免疫分析法的原理是當(dāng)熒光標(biāo)記物與抗體結(jié)合發(fā)生熒光淬滅，熒光增強(qiáng)免疫分析法的原理是熒光標(biāo)記物與抗體結(jié)合后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。史聰穎等[12]建立高靈敏度的熒光猝滅試紙條技術(shù)用于檢測(cè)豬尿、豬肉中萊克多巴胺，靈敏度為0.16 ng/mL，檢測(cè)范圍為0.16～20 ng/mL。該方法回收率為97.2%～106.1%，最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.84%(批內(nèi))；對(duì)于批間重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，回收率為89.0%～109.1%，最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.34%。ZHANG等[13]采用以膠體金為基礎(chǔ)的熒光猝滅免疫層析分析法測(cè)定樣品中的β-興奮劑，當(dāng)抗體量為0.8 μg/mL，檢測(cè)時(shí)間為15 min時(shí)，免疫層析測(cè)試條的LOD值為0.12 ng/mL，可同時(shí)測(cè)定五種β-興奮劑，當(dāng)通過(guò)該法測(cè)試加標(biāo)的豬尿液樣品(5.0 ng/mL和10.0 ng/mL)時(shí)，回收率分別為(39.00±3.0)%和(32.00±2.0)%。

1.4量子點(diǎn)熒光免疫分析

量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度比傳統(tǒng)有機(jī)熒光強(qiáng)度高100倍，具有狹窄的熒光發(fā)射光譜和較大的Stokes位移。以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記的探針開發(fā)的熒光免疫分析方法，能夠大幅度的提高農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)靈敏度[14]。WANG等[15]用量子點(diǎn)熒光免疫分析法對(duì)樣品中的萊克多巴胺進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，熒光免疫法LOD值為1 ng/mL，分析時(shí)間為4 h，適合痕量檢測(cè)。ZHOU等[16]制備超穩(wěn)定水溶性CdSe / ZnS量子點(diǎn)(QDs)作為熒光標(biāo)簽，用競(jìng)爭(zhēng)性側(cè)流免疫(LFIA)生物傳感器系統(tǒng)檢測(cè)萊克多巴胺在豬尿液中的殘留，其可靠檢測(cè)限被成功地減至0.1 ng/mL，這比商業(yè)RAC側(cè)流免疫分析帶高了30多倍。

傳統(tǒng)熒光物質(zhì)干擾性大、靈敏度低。熒光偏振免疫測(cè)定法、時(shí)間分辨熒光免疫法及量子點(diǎn)熒光免疫法等的出現(xiàn)使得FIA的靈敏度得到了大幅度提升。FIA可進(jìn)行全自動(dòng)大批量檢測(cè)，相信其在獸藥殘留檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景[17]。

3 酶免疫分析

酶免疫分析(enzyme immunoassay，EIA)是20世紀(jì)70年代后迅速發(fā)展起來(lái)的非同位素免疫測(cè)定法，其原理是在抗體或抗原分子上標(biāo)記特定的酶，根據(jù)抗原和抗體反應(yīng)的特異性以及具有高效性的酶催化顯色反應(yīng)對(duì)一些超微量殘留物進(jìn)行檢測(cè)[10]。根據(jù)其反應(yīng)介質(zhì)和步驟的不同分為非均相酶免疫分析和均相酶免疫分析2大類，后者大多用于治療藥物的檢測(cè)，此處不作詳細(xì)介紹：

非均相酶免疫分析即抗原、抗體反應(yīng)在固液相間進(jìn)行，反應(yīng)平衡后進(jìn)行兩相分離，其典型代表是Engvall和Perlman創(chuàng)立的酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[18]，用于獸藥殘留分析，分為抗體包被直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA、抗原包被直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA三種模式，此處主要介紹后2種：

3.1抗原包被直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(directcompetitiveELISAwithantigenscoatedonthesolidphase)

將抗原包被到聚苯乙烯96孔板上，加入待測(cè)物和酶標(biāo)記抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被抗原，平衡后洗滌，加底物顯色并檢測(cè)。DU等[19]用抗原包被直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)組織和飼料樣品中的殘留溴布特羅進(jìn)行測(cè)定，其IC50和LOD值分別為0.165 ng/mL和0.007 ng/mL，與克倫特羅，特布他林和西布特羅的交叉反應(yīng)性小于6.2%，與9種其他化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)性，對(duì)肝、肉和飼料樣品加入不同濃度的溴布特羅并通過(guò)ELISA分析，其回收率為91.9%～115.4%，分析內(nèi)變異系數(shù)為1.5%～9.5%(n= 3)。

3.2間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(indirectcompetitiveELISA)

間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA與抗原包被直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA競(jìng)爭(zhēng)方式的相同，一抗與抗原結(jié)合后與二抗結(jié)合，顯色的位點(diǎn)由一抗變成酶標(biāo)記后的二抗。WANG等[20]建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定豬肉樣品中的苯乙醇胺A殘留，其LOD值低于0.08 μg/kg，IC50值為0.93 pmol/mL(0.32 ng/mL)，對(duì)一些其他β-興奮劑顯示出可忽略的交叉反應(yīng)性。CAO等[21]建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)組織和飼料樣品中的苯乙醇胺A，試驗(yàn)結(jié)果顯示IC50和LOD值分別為0.049 ng/mL和0.003 ng/mL，3種常用的β-興奮劑(克倫特羅，沙丁胺醇和萊克多巴胺)的抗血清的交叉反應(yīng)性小于0.39%，與其他6種化合物沒(méi)有交叉反應(yīng)性，對(duì)豬腎、肝、肉和飼料樣品用不同含量的苯乙醇胺A強(qiáng)化，并通過(guò)ELISA分析，其回收率為92.2%～113.7%，分析內(nèi)變異系數(shù)為3.8%～10.9%(n= 3)。

近年來(lái)，各專業(yè)性公司在ELISA 的緩沖液系統(tǒng)、反應(yīng)條件以及包被抗原、特異性抗體、顯色系統(tǒng)制備、酶等方面取得了突破性的進(jìn)展，使得商業(yè)化 ELISA 試劑盒在靈敏度、精密度、穩(wěn)定性等方面均達(dá)到了動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)的要求。同時(shí)，ELISA方法具有儀器化程度較低、操作簡(jiǎn)便和成本適中等優(yōu)點(diǎn)，ELISA試劑盒已成為目前食品安全中藥殘留檢測(cè)的主流技術(shù)[22]。

EIA使用酶標(biāo)記，避免了RIA的放射性污染，操作方便，靈敏度可達(dá)10-10～10-11mol/L。但仍存在不足之處，如ELISA法是固相免疫反應(yīng)，抗原抗體完全反應(yīng)需要1～2 h，實(shí)際操作中，需要經(jīng)洗滌分離結(jié)合的和未結(jié)合的抗體，操作過(guò)程難以完全自動(dòng)化。

4 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法兩者的特點(diǎn)以發(fā)光物質(zhì)或酶來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記的抗原或抗體與待測(cè)物反應(yīng)后經(jīng)過(guò)理化處理(如洗滌和離心分離等步驟)加入酶底物或氧化劑而發(fā)光，通過(guò)測(cè)量化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)物的含量。根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析體所選標(biāo)記物的不同，將化學(xué)發(fā)光免疫分析方法分為以下三大類：

4.1化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)

化學(xué)發(fā)光免疫分析是化學(xué)發(fā)光試劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一種免疫測(cè)定方法。目前使用最多的是魯米諾類和吖啶酯類這兩類物質(zhì)[23]。GAO等[24]通過(guò)利用萊克多巴胺和沙丁胺醇作為模型，提出了用于β-興奮劑的快速和多重測(cè)定的新的免疫層析分析法，引入了化學(xué)發(fā)光方法，所提出的方案顯示出更高的靈敏度，在最佳條件下，可以在0.50～40 ng/mL和0.10～50 ng/mL的線性范圍內(nèi)分別檢測(cè)到萊克多巴胺和沙丁胺醇，LOD值分別為0.20 ng/mL和0.040 ng/mL。

4.2化學(xué)發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA)

CLEISA檢測(cè)原理與ELISA法基本相同，不同的是用化學(xué)發(fā)光劑代替顯色劑作為酶的底物。目前常用的標(biāo)記酶是辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。WU等[25]合成沙丁胺醇-牛血清白蛋白和沙丁胺醇-卵白蛋白包被抗原，并用免疫原處理6只新西蘭白兔以獲得多克隆抗體，以開發(fā)快速、靈敏的間接化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定(CICLEIA)用于分析樣品中的β-興奮劑，在優(yōu)化條件下，沙丁胺醇的線性動(dòng)態(tài)范圍和LOD值分別為0.007～0.17 μg/L和0.003 μg/L，相關(guān)系數(shù)為0.996 5，最大抑制濃度為0.028 μg/L，沙丁胺醇、克倫特羅和溴布特羅的回收率分別為78.8%至119.0%?；跁r(shí)間分辨可以同時(shí)檢測(cè)兩種獸藥，WANG等[26]以萊克多巴胺和克倫特羅作為目標(biāo)藥物，開發(fā)了基于時(shí)間分辨化學(xué)發(fā)光策略的新型多重免疫層析測(cè)定用于β-激動(dòng)劑的定量檢測(cè)，萊克多巴胺和克倫特羅的LOD值分別為0.17 ng/mL和0.067 ng/mL(S/N=3)，整個(gè)反應(yīng)可以在20 min內(nèi)完成。

4.3電化學(xué)發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)

電化學(xué)發(fā)光免疫分析是將電化學(xué)發(fā)光、免疫分析和化學(xué)分析相結(jié)合的一類化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，是由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過(guò)程。DONG[27]基于金納米粒子和L-半胱氨酸封端的CdSe量子點(diǎn)設(shè)計(jì)電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的信號(hào)放大策略，用于在K2S2O8作為共反應(yīng)物的情況下高度靈敏地檢測(cè)溴布特羅，在最佳條件下，該法具有0.01～1 000 ng/mL的良好線性范圍和0.003 ng/mL的較低LOD值，還研究了該法的特異性和穩(wěn)定性，其已經(jīng)用于在實(shí)際樣品中測(cè)定溴布特羅，具有令人滿意的結(jié)果。CAI等[28]建立了一種超靈敏的新型電化學(xué)免疫傳感器用于沙丁胺醇的檢測(cè)，使用量子點(diǎn)和金納米粒子結(jié)合HRP作為電化學(xué)發(fā)光信號(hào)，LOD值為0.017 ng/mL，該法靈敏度高，重現(xiàn)性和選擇性好。

近年來(lái)，各種分離技術(shù)與CLIA的聯(lián)用，如流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫分析(FI-CLIA)徐明霞等[29]構(gòu)建了一種酶放大的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫傳感器分別向豬肉、豬肝樣品中加入0.5、5、20 ng/mL的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，回收率為88.6%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在9.0%以內(nèi)。由于新的標(biāo)記技術(shù)和發(fā)光標(biāo)記物的出現(xiàn)，CLIA的靈敏度顯著提高，極大地促進(jìn)了CLIA應(yīng)用研究的發(fā)展[22]?；诖判晕⒘Ｗ雍徒鸺{米粒子的化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究越來(lái)越多，在快速分離與提高靈敏度上取得突破性的進(jìn)展[30]。

5 膠體金標(biāo)記免疫分析

膠體金標(biāo)記免疫分析(colloidal gold immunoassay，CGIA)采用納米金顆粒標(biāo)記抗體，當(dāng)被標(biāo)記的抗體聚集達(dá)到一定程度時(shí)，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紫紅色，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)抗體和抗原反應(yīng)結(jié)果的測(cè)定。LIU等[31]利用納米膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)肉類樣品中的沙丁胺醇，LOD值是5.0 μg/kg，靈敏度較高。WU等[32]基于膠體金納米粒子的免疫層析測(cè)定法結(jié)合磁性固相萃取法用于豬肉中克倫特羅殘留的定量檢測(cè)，檢測(cè)限和定量限分別為0.10 ng/g和0.24 ng/g。由于膠體金本身具有顏色，與ELISA相比省去了顯色和終止的步驟，大大簡(jiǎn)化了操作[33]。CGIA操作簡(jiǎn)單、快捷迅速、安全簡(jiǎn)便且不需任何設(shè)備和儀器。但是由于基質(zhì)干擾易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，一般只能完成定性或半定量檢測(cè)，不能達(dá)到準(zhǔn)確的定量檢測(cè)[34]，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)試紙的定量、高靈敏度和多元檢測(cè)成為膠體金免疫層析技術(shù)重要的發(fā)展方向。

6 免疫芯片

免疫芯片探針(根據(jù)不同的研究目的選用抗原、抗體、受體等不同的具有生物活性的蛋白質(zhì))高密度固定于芯片上，通過(guò)特異性免疫反應(yīng)捕獲樣品中的目標(biāo)物[35]。SUHERMAN[36]等使用裝配有一種制備免疫傳感器芯片的表面等離子體共振傳感器檢測(cè)克倫特羅，用于制造免疫表面的最低濃度的二硫雙(琥珀酰亞胺基)丙酸酯(DSP)溶液(0.1 mmol/L)對(duì)于克倫特羅顯示出3 ppt的檢測(cè)靈敏度，是報(bào)道過(guò)的最高靈敏度。ZHENG等[37]為了方便在表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)免疫分析中更易處理樣品，使用了3D芯片，制造了芯片上多層微流體紙基分析裝置，以向操作者提供關(guān)于不同微流體之間的相互作用的手動(dòng)開關(guān)，對(duì)鹽酸克倫特羅定量檢測(cè)，LOD值為0.1 pg/mL。這種方法具有高通量、自動(dòng)化、靈敏度高等其他方法所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，我國(guó)在免疫芯片技術(shù)領(lǐng)域取得了突破性的進(jìn)步，已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)，具有越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。

7 免疫傳感器

免疫傳感器是生物傳感器的一種，是傳感器的感受器與樣品中的目標(biāo)物之間發(fā)生抗原抗體的識(shí)別作用，進(jìn)而產(chǎn)生一些物理化學(xué)變化，這些變化通過(guò)不同原理的換能器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)或其他形式的信息輸出并記錄。WEI等[38]研究用由表面被L-半胱氨酸和戊二醛修飾的絲網(wǎng)印刷金電極(SPGE)構(gòu)成的便攜式無(wú)標(biāo)簽免疫阻抗免疫傳感器檢測(cè)克倫特羅，在優(yōu)化的條件下，免疫傳感器可以檢測(cè)到1.0×10-4～1.0 mg/L(R=0.998)范圍內(nèi)的克倫特羅，LOD值為2.0×10-5mg/L，加標(biāo)豬肉樣品的平均回收率為92.4%～104.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～5.2%。ZHANG等[39]將由硫化鋅量子點(diǎn)和聚苯胺(ZnSQD @ PANI)組成的納米復(fù)合物與抗克倫特羅的抗體一起置于金電極上，得到檢測(cè)克倫特羅的電流型免疫傳感器，當(dāng)在0.21 V(相對(duì)于Ag / AgCl)的工作電位下操作時(shí)，免疫傳感器顯示出低至5.5 pg/mL的LOD值，并且在0.01～10 ng/mL的濃度范圍內(nèi)工作，與使用原始PANI相比，用ZnSQD @ PANI納米復(fù)合材料改性的電極吸收克倫特羅抗體更好，因此對(duì)克倫特羅顯示出更高的敏感性。免疫傳感器專一性強(qiáng)，便攜性好，且由于其具有高度的自動(dòng)化、微型化和集成化，減少了對(duì)環(huán)境技術(shù)條件和使用者的依賴性。

8 流動(dòng)注射免疫分析

流動(dòng)注射免疫分析(flow injection chemiluminescence immunoassay，F(xiàn)IIA)：有兩大類型：均相流動(dòng)注射免疫分析和非均相流動(dòng)注射免疫分析。在獸藥殘留檢測(cè)中常將化學(xué)發(fā)光免疫分析與流動(dòng)注射聯(lián)用，SONG等[40]用流注射化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)樣品中的克倫特羅，使用競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定形式，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的降低與在0.40～120 ng/mL范圍內(nèi)的克倫特羅濃度的增加成比例，相關(guān)系數(shù)為0.999(n=9)，LOD值為0.20 ng/mL。XU等[41]用流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測(cè)定食品中的沙丁胺醇，其LOD值為0.15 ng/mL，該方法具有良好的穩(wěn)定性、特異性和重復(fù)性，應(yīng)用于實(shí)際樣品，結(jié)果令人滿意。FIIA可以大大縮短測(cè)定時(shí)間，節(jié)約免疫試劑，并且方便自動(dòng)化。

9 免疫PCR

免疫PCR(immuno-PCR，IPCR)1992年SANO等[42]將ELISA和PCR技術(shù)結(jié)合在一起建立了一種新型的檢測(cè)技術(shù)即IPCR。戴明雁[43]在酶聯(lián)免疫方法的基礎(chǔ)上，用熒光定量PCR作為信號(hào)檢測(cè)手段，建立實(shí)時(shí)定量IPCR法檢測(cè)萊克多巴胺。該方法的LOD值為0.003 9 ng/mL，IC50=0.18 ng/mL，與ELISA方法相比，靈敏度提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)，在萊克多巴胺濃度為0.25～1.0 ng/mL時(shí)，板內(nèi)回收率在80%～120%，板內(nèi)及板間變異系數(shù)小于10%。LEI[44]等研究一種新的以預(yù)組裝DNA免疫探針為基礎(chǔ)的IPCR方法檢測(cè)樣品中的沙丁胺醇，在優(yōu)化條件下，檢測(cè)結(jié)果顯示線性范圍超過(guò)7個(gè)數(shù)量級(jí)，在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中沙丁胺醇的檢測(cè)限為21 fg/mL，與使用相同抗體的直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA相比，靈敏度提高300倍。IPCR技術(shù)應(yīng)用對(duì)象廣泛，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，因此在獸藥殘留檢測(cè)中將會(huì)有更深入的研究。

10 其他免疫方法

近年來(lái)科研工作者不斷研究開發(fā)新的免疫分析方法檢測(cè)食品中β-興奮劑殘留，CHENG等[45]將聚集的氧化石墨烯/金納米顆粒雜化物的SERS與免疫磁珠樣品制備方法結(jié)合，開發(fā)了確定動(dòng)物尿中克倫特羅含量的高靈敏度方法，檢測(cè)時(shí)間僅需15 min/樣品，尿液中的檢測(cè)限和定量限分別為0.5 ng/mL和1 ng/mL，回收率為82.8%～92.4%，變異系數(shù)小于9.4%，檢測(cè)的日常變化小于6.41%。WANG等[46]開發(fā)了基于上轉(zhuǎn)換熒光體(UCP)用于定量檢測(cè)克倫特羅的新型的、超靈敏的免疫層析測(cè)定傳感器，感應(yīng)結(jié)果可在10 min內(nèi)獲得，在優(yōu)化的條件下，該傳感器對(duì)克倫特羅的視覺(jué)檢測(cè)限(VLOD)為0.1 ng/mL，使用該傳感器可以實(shí)現(xiàn)低至0.01 ng/mL的克倫特羅的計(jì)算檢出限(CLOD)。各種樣品基質(zhì)中克倫特羅的回收率為73.0%～92.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于12%。

11 多組分殘留

近年來(lái)人們更趨向于研究將檢測(cè)范圍由單一檢測(cè)轉(zhuǎn)向多殘留檢測(cè)，多殘留檢測(cè)既指同時(shí)檢測(cè)一類獸藥中的幾種，又指同時(shí)檢測(cè)幾類獸藥，上文已涉及幾種多殘留檢測(cè)的方法，如：以時(shí)間分辨為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光免疫法等。除此之外還有一些其他免疫分析方法，WANG等[47]開發(fā)了一種靈敏的、定量的熒光多組分免疫色譜傳感器用于檢測(cè)克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種β-興奮劑殘留，反應(yīng)時(shí)間僅為10 min，克倫特羅，萊克多巴胺和沙丁胺醇的LOD值分別為0.10、0.10和0.09 ng/mL，回收率范圍為70.0%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15%。HAN等[48]開發(fā)多重浸漬免疫測(cè)定法同時(shí)測(cè)定牛奶，尿液和血清中的多種獸藥殘留，如β-興奮劑，磺胺類藥物和四環(huán)素，樣品不需要預(yù)處理并且可以在10 min內(nèi)直接分析，肉眼估計(jì)不同樣品基質(zhì)中克倫特羅、磺胺嘧啶和四環(huán)素的閾值水平分別為0.3～0.45 ng/mL、3～4 ng/mL和4.5～6 ng/mL，加標(biāo)樣品中克倫特羅，磺胺嘧啶和四環(huán)素的回收率為78.4%～112.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于11.2%。

12 結(jié)語(yǔ)

盡管自“瘦肉精事件”后，國(guó)家對(duì)β-興奮劑類獸藥殘留加大了監(jiān)管力度，檢測(cè)方法也有了突破性進(jìn)展，但非法使用的現(xiàn)象還時(shí)有發(fā)生，由于免疫分析技術(shù)仍存在一定的問(wèn)題和局限，尚待進(jìn)一步發(fā)展和完善，所以將其應(yīng)用于β-興奮劑類獸藥殘留的檢測(cè)仍須科研人員的不懈努力。食品是一個(gè)復(fù)雜的體系，小分子藥物也具有多樣性，檢測(cè)時(shí)需要多種技術(shù)的聯(lián)合使用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，獲得單一分析技術(shù)難以達(dá)到的效果，追求更高的檢測(cè)通量、靈敏度、特異性和更低的檢測(cè)限。在科研人員的共同努力下，免疫分析法會(huì)在β-興奮劑類藥物殘留檢測(cè)中發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值，為保障動(dòng)物性食品安全全做出更大的貢獻(xiàn)。

[1] SALPETER S R,BUCKLEY N S,ORMISTON T M,et al．Meta-analysis: effect of long-acting β-agonists on severe asthma exacerbations and asthma-related deaths[J]．Annals of Internal Medicine,2006,144(12):904-912.

[2] SEARS M R．Adverse effects of beta-agonists[J]．The Journal of Allergy And Clinical Immunology,2002,110(6): S332-328.

[3] 翟福麗,賴克強(qiáng),張衍亮,等．動(dòng)物性食品中β-興奮劑殘留概述[J]．食品科學(xué),2011,32(5): 351-356.

[4] Council Directive 96/22/EC,Concerning the prohibition on the use in stockfarming of certain substances having a hormonal or thyrostatic action and of β-agonists,and repealing Directives 81/602/EEC,88/146/EEC and 88/299/EEC[S].

[5] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部．農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S]．北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002.

[6] YALOW R S,BERSON S A．Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods[J]．Nature,1959,184: 1 648-1 649.

[7] GRANJA R H M M,NINO A M M,RABONE F,et al．Validation of radioimmunoassay screening methods for -agonists in bovine liver according to Commission Decision 2002/657/EC[J]．Food Additives And Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure & Risk Assesment,2008,25(12): 1 475-1 481.

[8] 呂珍珍,蔣小玲,劉金釧,等．免疫分析技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2012,S1: 76-79.

[9] 袁利鵬,楊金易,徐振林,等．熒光偏振免疫分析法檢測(cè)沙丁胺醇[J]．食品科學(xué),2013,34(16): 139-142.

[10] 楊代鳳,劉騰飛,鄧金花,等．標(biāo)記免疫分析在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(30): 218-225.

[11] 侯文慧．沙丁胺醇銪標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的建立[J]．食品研究與開發(fā),2016,37(7): 154-160.

[12] 史聰穎．萊克多巴胺新型免疫熒光猝滅檢測(cè)技術(shù)研究[D]．廣州: 暨南大學(xué),2014: 5-54.

[13] ZHANG G G,CHEN M H,LIU D F,et al．Quantitative detection of beta(2)-adrenergic agonists using fluorescence quenching by immunochromatographic assay[J]．Analytical,2016,8(3): 627-631.

[14] 潘明飛,王俊平,方國(guó)臻,等．食品中農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)新技術(shù)研究進(jìn)展[J]．食品科學(xué),2014,35(15): 277-282.

[15] WANG S B,ZHANG Y,WEI Y L,et al．Fluoroimmunoassay and magnetic lateral flow immunoassay for the detection of ractopamine[J]．Spectroscopy And Spectral Analysis,2015,35(11): 3 100-3 104．

[16] ZHOU C H,YUAN H,WANG X,et al．CdSe/ZnS quantum dots with multi-shell protection: synthesis and application in the detection of ractopamine residue in swine urine[J].Science of Advanced Materials,2013,5(3): 285-294.

[17] 蘇茂．畜禽產(chǎn)品獸藥殘留的免疫學(xué)檢測(cè)方法探討[J].南方農(nóng)業(yè),2016,10(12): 192,194.

[18] ENGVALL E,PERLMANN P．Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G[J]．Immunochemistry,1971,8(9): 871-874.

[19] DU H J,CHU Y X,YANG H,et al．Sensitive and specific detection of a new beta-agonist brombuterol in tissue and feed samples by a competitive polyclonal antibody based ELISA[J]．Analytical Methods,2016,8(17): 3 578-3 586.

[20] WANG X M,LIUFU T L,BELOGLAZOVA N V,et al．Development of a competitive indirect enzyme-linked immunosorbent assay for screening phenylethanolamine a residues in pork samples[J]．Food Analytical Methods,2016,9(11): 3 099-3 106.

[21] CAO B Y,HE G Z,YANG H,et al．Development of a highly sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of phenylethanolamine a in tissue and feed samples and confirmed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)[J]．Talanta,2013,115: 624-630.

[22] 張素霞．獸藥殘留分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]．動(dòng)物保健,2005,9: 30-33.

[23] 金茂俊,王靜,楊麗華,等．化學(xué)發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展[J]．食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,5(3): 840-845.

[24] GAO H F,HAN J,YANG S J,et al．Highly sensitive multianalyte immunochromatographic test strip for rapid chemiluminescent detection of ractopamine and salbutamol[J]．Analytical Chimica Acta,2014,839: 91-96.

[25] WU Y P,XU F,JIANG H Y,et al．Determination of salbutamol,clenbuterol,and brombuterol in urine by a highly sensitive chemiluminescence enzymeimmunoassay[J]．Analytical Letters,2014,47(16): 2 761-2 773.

[26] WANG W W,SU X X,OUYANG H,et al．A novel immunochromatographic assay based on a time-resolved chemiluminescence strategy for the multiplexed detection of ractopamine and clenbuterol[J]．Analytical Chimica Acta,2016,917: 79-84.

[27] DONG T T,YANGXIAO K,ZHAO K et al．Signal amplification strategy for highly sensitive detecting brombuterol with electrochemiluminescent immunoassay by using CdSe QDs as label and gold nanoparticle as substrate[J]．Electroanalysis,2016,28(8): 1 847-1 855.

[28] CAI F D,WANG N,DONG T T,et al．Dual-signal amplified electrochemiluminescence immunoassay for salbutamol based on quantum dots and gold nanoparticle-labeled horseradish peroxidase[J].Analyst,2015,140(17): 5 885-5 890.

[29] 徐明霞．酶放大的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的構(gòu)建及在食品違禁添加劑中的應(yīng)用[D]．蘇州: 蘇州大學(xué),2016: 1-52.

[30] XIAO Q,LIN J M．Advances and applications of chemiluminescence immunoassay in clinical diagnosis and foods safety[J]．Chinese Journal of Analytical Chemistry,2015,43(6): 929-938.

[31] LIU B,WANG L L,TONG B,et al．Development and comparison of immunochromatographic strips with three nanomaterial labels: Colloidal gold,nanogold-polyaniline-nanogold microspheres (GPGs) and colloidal carbon for visual detection of salbutamol[J]．Biosensors & Bioelectronics,2016,85: 337-342.

[32] WU K S,GUO L,XU W,et al．Sulfonated polystyrene magnetic nanobeads coupled with immunochromatographic strip for clenbuterol determination in pork muscle[J]．Talanta,2014,129: 431-437.

[33] 杜兵耀,臧長(zhǎng)江,馬晨,等．免疫學(xué)技術(shù)在牛奶檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)畜牧獸醫(yī),2016,43(2): 457-461.

[34] 張銘潤(rùn),張燕,王弘,等．食品污染物殘留的快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用綜述及展望[J]．食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2014,5(7): 1 951-1 959.

[35] 曲信芹,凌紅麗,蔣貽海,等．免疫芯片技術(shù)在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J]．中國(guó)動(dòng)物檢疫,2015,32(10): 21-24.

[36] SUHERMAN,MORITA K,KAWAGUCHI T．Surfaceplasmon resonance for detecting clenbuterol: Influence of monolayer structure[J]．Applied Surface Science,2015,332: 229-236.

[37] ZHENG T T,GAO Z G,LUO Y,et al．Manual-slide-engaged paper chip for parallel SERS-immunoassay measurement of clenbuterol from swine hair[J]．Electrophoresis,2016,27(3): 418-424.

[38] WEI L H,LIU L,KANG H M,et al．Development of a disposable label-free impedance immunosensor for direct and sensitive clenbuterol determination in pork[J]．Food Analytical Methods,2016,9(6): 1 781-1 788.

[39] ZHANG Z H,DUAN F H,HE L H,et al．Electrochemical clenbuterol immunosensor based on a gold electrode modified with zinc sulfide quantum dots and polyaniline[J]．Microchimica Acta,2016,183(3): 1 089-1 097.

[40] SONG J,XU M,ZHAO K,et al．Flow injectionchemiluminescence immunosensor for the determination of clenbuterol by immobilizing coating-antigen on carboxylic resin beads[J]．Analytical Methods,2014,6(9): 3 152-3 158.

[41] XU M X,QIAN X L,ZHAO K,et al．Flow injection chemiluminescent competitive immunoassay for the beta-adrenergic agonist salbutamol using carboxylic resin beads and enzymatic amplification[J]．Sensors And Actuators B-Chemical,2015,215: 323-329.

[42] SANO T,SMITH C L,CANTOR C R．Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates[J]．Science,1992,258(5 079): 120-122.

[43] 戴明雁．萊克多巴胺免疫PCR檢測(cè)方法學(xué)基礎(chǔ)研究[D]．杭州: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院,2015： 1-77.

[44] LEI Y J,LI X Y,AKASH M S H,et al．Development of analytical method for ultrasensitive detection of salbutamol utilizing DNA labeled-immunoprobe[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2015,107: 204-208.

[45] CHENG J,SU X O,WANG S,et al．Highly sensitive detection of clenbuterol in animal urine using immunomagnetic bead treatment and surface-enhanced raman spectroscopy[J]．Scientific Reports,2016,6: 1-10.

[46] WANG P L,WANG R G,ZHANG W,et al．Novel fabrication of immunochromatographic assay based on up conversion phosphors for sensitive detection of clenbuterol[J].Biosensors& Bioelectronics,2016,77: 866-870.

[47] WANG P L,WANG Z,SU X O．A sensitive and quantitative fluorescent multi-component immuno-chromatographic sensor for beta-agonist residues[J]．Biosensors & Bioelectronics,2015,64: 511-516.

[48] HAN S J,ZHOU T J,YIN B J,et al．A sensitive and semi-quantitative method for determination of multi-drug residues in animal body fluids using multiplex dipstick immunoassay[J]．Analytica Chimica Acta,2016,927: 64-71．

Immunoassaysfordeterminationofβ-agonistsresiduesinanimal-derivedfood

LIU Shuo,TAO Xiao-qi*

(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The beta-agonists can reduce animals’ fat content,promote protein synthesis,improve the ratio of lean muscle and increase feed efficiency.Hence,it is often used as a feed additive.However,because the beta-agonists residues can still remain in animal tissues,it causes heart palpitations,headaches,liver and kidney poisoning and other serious harm to human being.Most countries including China,have banned the use of beta-agonists in animal products.Nowadays,the various detection methods of beta-agonists residues in animal-derived food have been reported.This paper mainly introduces the principles,advantages and disadvantages,the research progress and development trend of immunoassay methods,including radioimmunoassay,enzyme immunoassay,chemiluminescence immunoassay,fluorescent immunoassay,colloidal gold immunoassay,immunosensor,immunochip,flow injection chemiluminescence immunoassay and immuno-PCR. This article provides a reference for the fatrge development.

β-agonists; immunoassay; animal-derived food

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013744

本科生(陶曉奇副教授為通訊作者,E-mail:77179000@qq.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31672605)；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上資助(2016M590855)

2017-01-03，改回日期：2017-03-28