唐柯，王梓萱，張偉宏，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室、食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室、江南大學(xué) 生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫，214122) 2(蘇州禾木田藍(lán)莓果園，江蘇 蘇州，215131)

不同品種藍(lán)莓酚類物質(zhì)組成特征及抗氧化能力比較分析

唐柯1，王梓萱1，張偉宏2，徐巖1*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室、食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室、江南大學(xué) 生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇 無錫，214122) 2(蘇州禾木田藍(lán)莓果園，江蘇 蘇州，215131)

以高叢、矮叢、兔眼藍(lán)莓為研究對象，比較了其總酚、花色苷、原花色素、單體酚以及抗氧化力差異。超高效液相色譜檢測結(jié)果表明，綠原酸為3種藍(lán)莓中含量最多的酚酸；表沒食子兒茶素是高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓含量最豐富的黃烷醇，表兒茶素沒食酸酯則是矮叢藍(lán)莓含量最高的黃烷醇；在3種藍(lán)莓中含量最高的黃酮醇均為蘆丁；矮叢藍(lán)莓單體酚總量顯著高于高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓。抗氧化分析結(jié)果則表明，無論從DPPH、ABTS還是FRAP測定結(jié)果來看，矮叢藍(lán)莓均具有最強(qiáng)的抗氧化能力。相關(guān)性分析結(jié)果表明，3種藍(lán)莓總酚、總花色苷和原花色素含量均與抗氧化能力存在明顯的正相關(guān)性。

藍(lán)莓；花色苷；原花色素；單體酚；抗氧化力

藍(lán)莓(blueberry)為杜鵑花科越橘屬植物，學(xué)名越橘。藍(lán)莓風(fēng)味獨特、色澤誘人、酸甜適口，而且營養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛。如今世界上栽培種藍(lán)莓主要包括高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓、兔眼藍(lán)莓三大類[1]。

藍(lán)莓果實中除了含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素、微量元素等常見營養(yǎng)物質(zhì)之外，還有花色苷、多糖、黃酮等多種生理活性成分。在具備營養(yǎng)保健功能的同時，還具有防止腦神經(jīng)老化、抗癌、軟化血管和增強(qiáng)人體免疫能力等功能。特別是它的強(qiáng)抗氧化功能，被譽(yù)為“漿果之王”[2-3]。近年來，國內(nèi)外研究人員也陸續(xù)對藍(lán)莓抗氧化活性展開研究。WANG等[4]以42種藍(lán)莓為實驗材料，證實藍(lán)莓具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠有效清除O2-·、·OH、ROO·以及H2O2。李穎暢等[5]研究了“圣云”藍(lán)莓花色苷不同組分的體外抗氧化性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明，“圣云”藍(lán)莓花色苷3個組分都具備抗脂質(zhì)體過氧化能力，可以有效的還原和清除·OH、DPPH·。藍(lán)莓除花色苷具有清除自由基的能力外，多糖、黃酮和總酚等也具有抗氧化能力。孟憲軍等[6]對藍(lán)莓多糖的抗氧化性進(jìn)行研究，結(jié)果表明藍(lán)莓對·OH、DPPH·具有較強(qiáng)的清除作用。劉瑋等[7]對藍(lán)莓黃酮抗氧化能力進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明藍(lán)莓黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，尤其是經(jīng)純化的黃酮類物質(zhì)，其抗氧化性顯著增加。高暢等[8]利用藍(lán)莓果渣提取總酚，結(jié)果表明總酚對DPPH·及O2-·均具有很好的清除能力。

藍(lán)莓作為一種具有高營養(yǎng)價值的水果越來越受到人們的關(guān)注，我國藍(lán)莓的種植面積也是逐年擴(kuò)大[9]，但是系統(tǒng)的關(guān)于不同品種藍(lán)莓果實抗氧化物質(zhì)的差異，特別是單體酚的研究仍較少見。本研究以3種主栽藍(lán)莓高叢、矮叢、兔眼藍(lán)莓為研究對象，通過對其總酚、花色苷、原花色素、單體酚以及抗氧化力進(jìn)行對比分析，明確不同品種藍(lán)莓主要功能成分的差異。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

材料：矮叢藍(lán)莓(長白山，美登，Blomidon)，高叢藍(lán)莓(安吉，奧尼爾，O’Neal)，兔眼藍(lán)莓(安吉，頂峰，Climax)。所有藍(lán)莓樣品均由蘇州禾木田藍(lán)莓果園提供。

試劑：12種黃酮醇標(biāo)準(zhǔn)品(桑黃素、山奈酚、楊梅酮、鼠李素、異鼠李素、高良姜、非瑟酮、芹菜素、木犀草素、蘆丁、槲皮素、槲皮苷)購自Sigma(St. Louis, MO)公司，純度95%以上；11種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、p-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、p-香豆酸、阿魏酸、芥子酸)購自Sigma(St. Louis, MO)公司，純度95%以上；5種黃烷醇標(biāo)準(zhǔn)品(EGC 表沒食子兒茶素、CAT 兒茶素、EGCG 表沒食子兒茶素沒食子酸酯、EC 表兒茶素、ECG 表兒茶素沒食酸酯)購自Sigma(St. Louis, MO)公司，純度98%以上；ABTS試劑盒、FRAP試劑盒、DPPH購自上海哈靈生物有限公司；實驗用水為自制超純水(電導(dǎo)度18M)；甲醇、乙腈，CNW公司，色譜純(純度≥98%)。

1.2儀器與設(shè)備

Waters Acquity H-Class 超高效液相色譜儀(配置二極管陣列檢測器、樣品管理器、溶劑管理器、柱溫箱、Empower色譜工作站)，美國Waters公司；WFZ UV-2802H型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；超低溫冰箱Forma-86C Thermo Electron Corporation；循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ) 鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司；純水儀Millipore Simplicity UV Bedford，MA，USA；恒溫烘箱，上海實驗儀器廠有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1 藍(lán)莓樣品處理

取冰凍藍(lán)莓果實，去籽，加液氮冷凍，用打漿機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取2.5 g研磨好的粉末于離心管中，加入30 mL體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，40 ℃水浴浸提2 h，離心，取上清液，提取3次，合并上清液，35 ℃下，減壓旋蒸，去除乙醇。避光低溫保存，待用。

1.3.2 總酚、花色苷、原花色素含量測定

總酚測定：福林肖卡法測定藍(lán)莓果實中的總酚含量。酶標(biāo)儀測定765 nm下的吸光值，以沒食子酸計。

總花色苷測定：采用pH示差法，配制pH=1.5 [V(0.2 mol/L KCl)∶V(0.2 mol/L HCl)=25∶67]和pH=4.5[V(0.2 mol/L NaAc·H2O)∶V(0.2 mol/L HAc)=1∶1]的緩沖液。取0.4 mL提取液，分別用2種緩沖液定容至10 mL容量瓶在520 nm下測吸光度?；ㄉ沼嬎愎饺缦拢?/p>

(1)

式中：A為吸光度；n為用緩沖液稀釋倍數(shù)(25倍)；V提取液總體積；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷相對分子質(zhì)量(449 g/mol)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷消光系數(shù)(26 900 L/(mol·cm)-1);m樣為樣品質(zhì)量。

原花色素測定：取5 mL 提取液經(jīng)乙醚除脂，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯上相，取0.5 mL樣液加入試管中加4%香草醛甲醇液3 mL混合，再加入1.5 mL濃HCl，混勻。室溫下顯色15 min左右，在500 nm下測吸光度。用4%香草醛甲醇液做空白，避光操作。原花色素含量計算公式如下：

原花色素/(×103mg)=A500÷0.55×100×樣液稀釋倍數(shù)

(2)

式中：A為吸光度；0.55為0.1 g的原花色素波長為0.55。

1.3.3 酚類物質(zhì)超高效液相色譜分析

ACQUITY UPLC BEH C18(i.d 2.1×150 mm，1.7 μm)色譜柱，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL，以峰面積外標(biāo)法定量。

酚酸、黃烷醇、黃酮醇洗脫程序參照課題組前期已建立的方法進(jìn)行[10]。

藍(lán)莓提取液測定前經(jīng) 0.22 μm水相微孔濾膜過濾。

1.3.4 DPPH分析

12.5 mg DPPH溶解到甲醇溶液中，定容到100 mL，使用時再稀釋5倍到25 mg/L。取0.1 mL提取液或酒樣加到3.9 mL DPPH甲醇溶液中，在黑暗中反應(yīng)20 min后在515 nm處測定吸光值，對照以相同體積15%乙醇代替待測液。Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行DPPH抗氧化能力檢測，樣品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (TE)來表示。

1.3.5 ABTS分析

將提取液適當(dāng)稀釋后，按照ABTS試劑盒說明書提供方法進(jìn)行檢測。Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行ABTS抗氧化能力檢測，樣品的抗氧化能力用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (TE)來表示。

1.3.6 FRAP分析

將提取液適當(dāng)稀釋后，按照FRAP試劑盒說明書提供方法進(jìn)行檢測。對于FRAP方法，總抗氧化能力用FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有樣品檢測均重復(fù)3次，單因素方差分析和相關(guān)性分析由SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件實現(xiàn)(SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA)，所有統(tǒng)計分析的顯著性水平為0.05(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1總酚、總花色苷、原花色素含量及抗氧化力比較分析

表1為3種藍(lán)莓果實的總酚、花色苷、原花色素及抗氧化力的分析。從結(jié)果可以看出，不同藍(lán)莓品種之間總酚含量和花色苷含量差異比較大，其中矮叢藍(lán)莓(美登)的總酚和花色苷含量最為豐富，分別為649.1 mg/100 g FW和301.8 mg/100 g FW。含量最低為兔眼藍(lán)莓，只有266.4 mg/100 g FW和88.8 mg/100 g FW。3種藍(lán)莓的原花色素含量最高仍是矮叢藍(lán)莓(美登)為43.5 mg/100 g FW，高叢藍(lán)莓(奧尼爾)和兔眼藍(lán)莓(頂峰)則差異不大，分別為25.7 mg/100 g FW和29.7 mg/100 g FW。

表1 不同地區(qū)藍(lán)莓果實花色苷、原花色素含量及抗氧化活性分析

此外，高叢藍(lán)莓(奧尼爾)和矮叢藍(lán)莓(美登)在抗氧化能力方面明顯強(qiáng)于兔眼藍(lán)莓(頂峰)，矮叢藍(lán)莓(美登)在抗氧化能力較高叢藍(lán)莓(奧尼爾)則更強(qiáng)。結(jié)合圖1～圖3相關(guān)性分析結(jié)果可以看出，總酚和總花色苷含量跟藍(lán)莓果實的抗氧化能力存在明顯的正相關(guān)性?？偡雍亢虳PPH、ABTS、FRAP三種抗氧化能力測定結(jié)果的相關(guān)性分別為0.854 7、0.980 6、0.604 3；總花色苷含量和DPPH、ABTS、FRAP三種抗氧化能力測定結(jié)果的相關(guān)性分別為0.527 9、0.786 1、0.899 0。充分驗證了總酚含量和總花色苷含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性。而原花色素含量與3種抗氧化能力測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)相對較低，分別為0.853 8、0.624 5、0.430 2。姜愛麗等以4 個北高叢藍(lán)莓品種為試驗，比較了總花色苷、可溶性多糖、Vc 以及還原型谷胱甘肽含量4 種抗氧化物質(zhì)與DPPH 自由基清除能力之間的相關(guān)性，結(jié)果表明總花色苷含量、Vc 含量以及還原型谷胱甘肽含量與DPPH 自由基清除能力間存在顯著的正相關(guān)[11]。本文研究結(jié)果也與GRACE等的研究結(jié)果基本一致[12]。

圖1 藍(lán)莓中總花色苷、總酚和原花色素含量與DPPH法測定抗氧化能力的相關(guān)性Fig.1 Correlation between totalanthocyanins and proanthocyanidins total phenol content of blueberry and DPPH assay correlation between antioxidant capacity

圖2 藍(lán)莓中總花色苷、總酚和原花色素含量與ABTS法測定抗氧化能力的相關(guān)性Fig.2 Correlation between totalanthocyanins and proanthocyanidins total phenol content of blueberry and ABTS assay correlation between antioxidant capacity

圖3 藍(lán)莓中總花色苷、總酚和原花色素含量與FRAP法測定抗氧化能力的相關(guān)性Fig.3 Correlation between totalanthocyanins and proanthocyanidins total phenol content of blueberry and FRAP assay correlation between antioxidant capacity

2.2酚類物質(zhì)組成及含量比較分析

酚酸分析結(jié)果表明，3種藍(lán)莓均未檢測到對羥基苯甲酸，此外，矮叢藍(lán)莓未檢測到丁香酸，兔眼藍(lán)莓未檢測到丁香酸和龍膽酸。綠原酸為3種藍(lán)莓中含量最多的酚酸，其中矮叢藍(lán)莓含量最高，為9.54 mg/100g FW；除綠原酸外其他酚酸含量均較低，大多低于1 mg/100g FW。此外，3個不同藍(lán)莓品種的總酚酸含量在9.19～20.92 mg/100g FW之間，與ZHANG等[13]對藍(lán)莓果實酚類物質(zhì)含量測定結(jié)果基本一致。矮叢藍(lán)莓的酚酸含量高于高叢藍(lán)莓，高于兔眼藍(lán)莓。

表2 不同品種藍(lán)莓酚酸含量 單位：mg/100 g FW

注：表中不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

表3 不同品種藍(lán)莓黃烷醇含量 單位：mg/100 g FWTable 3 Flavanols content of different kinds of

注：表中不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

表3可以看出，3種藍(lán)莓黃烷醇含量差別較大，其中矮叢藍(lán)莓黃烷醇總含量達(dá)到31.52 mg/100 g FW，顯著高于高叢藍(lán)莓(6.05 mg/100 g FW)和兔眼藍(lán)莓(3.55 mg/100 g FW)。單體黃烷醇方面，EGC是高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓含量最豐富的黃烷醇，ECG則是矮叢藍(lán)莓含量最高的黃烷醇。

表4 不同品種藍(lán)莓黃酮醇含量 單位：mg/100g FW

注：表中不同字母代表差異顯著(p<0.05)。

表4為不同品種藍(lán)莓黃酮醇的UPLC測定結(jié)果。從表4可以看出，在3種藍(lán)莓中蘆丁均為含量最高的黃酮醇。而矮叢藍(lán)莓的總黃酮醇含量最豐富，達(dá)到25.50 mg/100 g FW，高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓的總黃酮醇含量較低，均不足2 mg/100 g FW。除矮叢藍(lán)莓外，高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓的總黃酮醇含量與CHUN等研究結(jié)果基本一致[14]。

3 結(jié)論

本實驗以高叢藍(lán)莓(奧尼爾)、矮叢藍(lán)莓(美登)、兔眼藍(lán)莓(頂峰)為研究對象，通過UPLC技術(shù)對其主要單體酚進(jìn)行了定性定量分析。結(jié)果表明，綠原酸為3種藍(lán)莓中含量最多的酚酸；EGC是高叢藍(lán)莓(奧尼爾)和兔眼藍(lán)莓(頂峰)含量最豐富的黃烷醇，ECG則是矮叢藍(lán)莓(美登)含量最高的黃烷醇；在3種藍(lán)莓中含量最高的黃酮醇均為蘆??；矮叢藍(lán)莓單體酚總量顯著高于高叢藍(lán)莓(奧尼爾)和兔眼藍(lán)莓(頂峰)。

不同藍(lán)莓品種之間總酚含量和花色苷含量差異比較大，其中矮叢藍(lán)莓(美登)的總酚和花色苷含量最為豐富，兔眼藍(lán)莓(頂峰)含量最低。3種藍(lán)莓的原花色素的含量最高仍是矮叢藍(lán)莓(美登)，高叢藍(lán)莓(奧尼爾)和兔眼藍(lán)莓(頂峰)則無顯著性差異?？寡趸治鼋Y(jié)果則表明，無論從DPPH、ABTS、FRAP還是總酚含量測定來看，矮叢藍(lán)莓(美登)均具有最強(qiáng)的抗氧化能力。相關(guān)性分析結(jié)果表明，3種藍(lán)莓總酚、總花色苷和原花色素含量均跟藍(lán)莓果實的抗氧化能力存在明顯的正相關(guān)性。

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Comparativeanalysisofphenoliccontentandprofile,andantioxidantcapacityindifferentblueberryvarieties

TANG Ke1, WANG Zi-xuan1, ZHANG Wei-hong2, XU Yan1*

1 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; State Key Laboratory of Food Science & Technology;Centre for Brewing Science and Enzyme Biotechnology, School of BiotechnologyJiangnan University, Wuxi 214122, China) 2 (Hemutian Blueberry orchard, Suzhou 215131, China)

The total phenols, anthocyanins, proanthocyanidin, monomer polyphenol and antioxidant activities of three varieties of blueberry were compared. The results of UPLC showed that chlorogenic acid was the highest in phenolic in three blueberries; EGC was the highest flavanols in highbush blueberries and rabbiteye blueberries; ECG was the highest flavanol in lowbush blueberry. The highest flavonol in three blueberries was rutin, the total phenolic compounds in lowbush blueberry were more than highbush blueberries and rabbiteye blueberries. The antioxidant activities results showed that lowbush blueberry have the strongest antioxidant capacity in DPPH, ABTS and FRAP. Correlation analysis showed that total phenolics, total anthocyanin and proanthocyanidin content in blueberries were all significantly positive correlated with antioxidant capacity.

blueberry; anthocyanins; proanthocyanidin; monomer polyphenol; antioxidant activities

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013342

博士，副教授(徐巖教授為通訊作者,E-mail:yxu@jiang￣nan.edu.cn)。

2016-11-04，改回日期：2017-01-18