田方源，湯斌,2*，李松,2，楊倩

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

米根霉α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關(guān)氨基酸的初步分析

田方源1，湯斌1,2*，李松1,2，楊倩1

1(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

利用計(jì)算機(jī)輔助模擬分析技術(shù)對(duì)米根霉α-淀粉酶與麥芽三糖進(jìn)行分子對(duì)接，并選擇可能與該酶的高麥芽糖生成能力相關(guān)的氨基酸殘基進(jìn)行突變和分析。研究表明：突變體YHR和H286L最適作用溫度分別比原酶的最適作用溫度(50 ℃)提高了10 ℃和5 ℃；突變體H286L的最適作用pH下降了0.5。與原酶相比，突變體YHR和H286L作用麥芽三糖終產(chǎn)物中麥芽糖含量分別提高了18.87%和16.87%，作用可溶性淀粉終產(chǎn)物中麥芽糖含量分別提高了11.67%和10.32%。初步確定H286與該酶高麥芽糖生成能力之間的關(guān)系最為密切，其次為Y80和R333。

真菌α-淀粉酶；麥芽糖；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；定點(diǎn)突變

工業(yè)用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)按微生物來源不同可以分為細(xì)菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶2大類[1]。細(xì)菌α-淀粉酶水解淀粉的主要產(chǎn)物是糊精及少量寡糖和葡萄糖，其在淀粉質(zhì)原料的水解過程中主要起到液化作用(如高溫α-淀粉酶)或淀粉乳的降黏作用(如中溫α-淀粉酶)[2]。與細(xì)菌α-淀粉不同，真菌α-淀粉酶可以水解淀粉和麥芽三糖，終產(chǎn)物中主要物質(zhì)為麥芽糖和部分低聚寡糖及少量葡萄糖。其中，真菌來源的α-淀粉酶有很多種，主要指黑曲霉、米曲霉或米根霉等真菌來源并可分泌至細(xì)胞外的在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和底物催化特征等方面比較相似的一類α-淀粉酶，在現(xiàn)代研究或工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域統(tǒng)稱為真菌α-淀粉酶[1, 3]。

高麥芽糖漿是一種以麥芽糖為主(通常含量>50%)的淀粉糖，在食品和飲料行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[4-5]。在現(xiàn)代淀粉糖行業(yè)，高麥芽糖漿主要采用酶轉(zhuǎn)化淀粉工藝進(jìn)行生產(chǎn)。隨著糖化工藝的改進(jìn)，真菌α-淀粉酶已逐漸替代β-淀粉酶做為主要糖化劑用于高麥芽糖漿的生產(chǎn)，成為高麥芽糖漿生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶制劑[6]。真菌α-淀粉酶之所以能夠替代相對(duì)昂貴的β-淀粉酶，是因其具有特殊的產(chǎn)物生成能力——高麥芽糖生成能力。高麥芽糖漿品質(zhì)的高低依據(jù)糖漿中麥芽糖的含量而定，因此，在高麥芽糖漿的工業(yè)生產(chǎn)過程中，真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的終產(chǎn)物中麥芽糖濃度的高低是評(píng)價(jià)其應(yīng)用性能的一個(gè)重要特征指標(biāo)。目前，真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力的研究主要集中在酶的底物催化形式等生化性質(zhì)研究階段，其中一種研究認(rèn)為，α-淀粉酶對(duì)麥芽三糖的親和力的不同可能對(duì)麥芽糖的形成和終產(chǎn)物中麥芽糖的含量具有重要影響[7]；另一種研究認(rèn)為真菌α-淀粉酶具有高麥芽糖生成能力是由于該淀粉酶可以催化低濃度麥芽三糖發(fā)生轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)所致[8]。而有關(guān)真菌α-淀粉酶結(jié)構(gòu)與其高麥芽糖生成能力之間關(guān)系的研究則未見報(bào)道，即沒有結(jié)合酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析從根本的分子水平上加以研究，使得真菌α-淀粉酶的高麥芽糖生成能力及其作用機(jī)制一直沒有得到合理的闡釋。

因此，為了在分子水平上研究與真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關(guān)的關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)特征，本研究通過蛋白結(jié)構(gòu)建模和底物對(duì)接等生物信息學(xué)分析方法初步對(duì)米根霉α-淀粉酶中可能與高麥芽糖生成能力相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了分析，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了系列突變體。研究中進(jìn)一步對(duì)突變體的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和底物水解特征等進(jìn)行了分析，以期為深入研究真菌α-淀粉酶的高麥芽糖生成機(jī)制及其高麥芽糖生成能力這一重要催化功能的定向進(jìn)化方法提供參考。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109和巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115，以及質(zhì)粒pUC57和pPIC9k，為本實(shí)驗(yàn)室保藏；含有米根霉α-淀粉酶基因(ROAmy)的重組質(zhì)粒pUC57-ROAmy為本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中構(gòu)建。其中，基因ROAmy(GenBank：HM234170)克隆自菌株米根霉(Rhizopusoryzae)F0071(中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心，CICIM—CU)。實(shí)驗(yàn)中所使用的各種限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、T4DNA連接酶以及質(zhì)粒抽提、PCR產(chǎn)物純化和膠回收等試劑盒分別購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司或生工生物工程(上海)有限公司。酵母氮基(YNB)購(gòu)于北京拜爾迪生物公司；麥芽寡糖標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于日本林原生化研究所公司(Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc)。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的生化或分析純?cè)噭?/p>

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L；向LB液體培養(yǎng)基中添加15 g/L瓊脂粉即制得LB固體培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基MM、種子培養(yǎng)基YPD、初始發(fā)酵培養(yǎng)基BMGY以及誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基BMMY等培養(yǎng)基的配制按照畢赤酵母操作手冊(cè)[9]進(jìn)行。向MM固體培養(yǎng)基中添加5 g/L可溶性淀粉即制得突變體篩選培養(yǎng)基。

1.3儀器與設(shè)備

紫外可見光分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司，型號(hào)：YXLZ820KBSQ；蛋白質(zhì)純化設(shè)備，美國(guó)GE Healthcare公司，型號(hào)：AKTA-Explorer 100；電穿孔儀，美國(guó)BTX公司，型號(hào)：ECM 630；Ni親和柱，美國(guó)GE Healthcare公司，型號(hào)：His TrapTMHP 1 mL；高效液相色譜儀，美國(guó)Water公司，型號(hào)：Water 1525。

1.4方法

1.4.1 ROAmy分子建模及定點(diǎn)突變

基于7taa (PDB entry code)，利用同源建模軟件(SWISS-MODEL)構(gòu)建米根霉α-淀粉酶3D模型，運(yùn)用軟件Molegro Virtual Docker(MVD)對(duì)ROAmy與麥芽三糖底物進(jìn)行分子對(duì)接，分析并選擇ROAmy結(jié)構(gòu)中與麥芽三糖結(jié)合較為密切的氨基酸為待突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物并利用Overlapping PCR技術(shù)對(duì)待突變位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行突變。

1.4.2 突變體表達(dá)菌株的構(gòu)建及發(fā)酵

以含有原始基因的重組質(zhì)粒pUC57-ROAmy為模板，利用突變引物進(jìn)行擴(kuò)增，Overlapping PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoR Ⅰ和NotⅠ雙酶切后與相同雙酶切處理的質(zhì)粒pPIC9k相連接并導(dǎo)入E.coliJM109中，構(gòu)建得到含有突變基因的重組質(zhì)粒pPIC-rROAmy。抽提重組質(zhì)粒pPIC-rROAmy并對(duì)突變基因進(jìn)行序列測(cè)定，驗(yàn)證正確后進(jìn)一步使用SacI進(jìn)行線性化并利用電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入P.pastorisGS115。酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)劃線分離純化后再利用含淀粉的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于30 ℃培養(yǎng)48 h后使用稀碘液進(jìn)行染色，出現(xiàn)透明圈的菌落即為目標(biāo)重組表達(dá)菌株。重組菌的搖瓶發(fā)酵方法及步驟按照畢赤酵母操作手冊(cè)[9]進(jìn)行。

1.4.3 酶活測(cè)定

取1 mL可溶性淀粉(10 g/L)溶液與0.25 mL檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液(0.2 mol/L, pH 5.0)混合，50 ℃溫浴5 min后加入0.1 mL α-淀粉酶液，繼續(xù)保溫10 min后立即加入0.1 mL HCl溶液(0.1 mol/L)終止反應(yīng)。使用DNS[10]法對(duì)反應(yīng)液中的還原糖進(jìn)行定量。以烘干至恒重的麥芽糖為標(biāo)樣繪制DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線。1個(gè)α-淀粉酶活力單位(U)定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 mg麥芽糖所需要的酶量。

1.4.4 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定

在pH 5.0條件下，分別在25～75 ℃溫度下測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力確定酶的最適反應(yīng)溫度；將酶液用pH 5.0緩沖液(檸檬酸-磷酸氫鈉0.2 mol/L)稀釋后，分別在40～70 ℃溫度下保溫0～20 min，保溫一定時(shí)間后立即取出樣品，冰上放置30 min后對(duì)酶活力進(jìn)行檢測(cè)，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力以研究酶的熱穩(wěn)定性。

1.4.5 最適反應(yīng)pH測(cè)定

在55 ℃條件下分別使用不同pH(3.0～8.0)緩沖液進(jìn)行酶活力測(cè)定，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力以確定酶的最適反應(yīng)pH。

1.4.6 酶作用底物終產(chǎn)物分析

使用pH 5.0的檸檬酸-磷酸氫鈉緩沖液分別配置10 mg/mL的可溶性淀粉溶液與40 mmol/L的麥芽三糖溶液，在1.8 mL的溶液中加入0.2 mL酶液(10 U)，并在40 ℃下反應(yīng)8 h，酶反應(yīng)產(chǎn)物使用等體積三氯乙酸(100 g/L)終止反應(yīng)，4 ℃靜置沉淀3 h后于7 000 r/min離心30 min，取上清液用0.2 μm微孔濾膜過濾，濾液中糖組分及含量HPLC法進(jìn)行定量分析。HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為L(zhǎng)una-NH2，流動(dòng)相為甲醇+水(10+90,v/v)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1淀粉酶的底物分子對(duì)接和定點(diǎn)突變

研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，真菌α-淀粉酶的高麥芽糖形成能力可能與該淀粉酶水解麥芽三糖的能力有關(guān)，如與麥芽三糖親和常數(shù)的高低和低濃度麥芽三糖濃度下能夠發(fā)生的轉(zhuǎn)糖基化作用等[7-8]。因此，本研究選擇麥芽三糖(SID:22394327)為底物配體與ROAmy進(jìn)行分子對(duì)接。由于不同編號(hào)的麥芽三糖分子在計(jì)算機(jī)模擬結(jié)構(gòu)上的差異，在進(jìn)行生物信息學(xué)模擬時(shí)會(huì)引起對(duì)接結(jié)結(jié)果的不同，因此研究中只能先預(yù)設(shè)一個(gè)特定編號(hào)的底物進(jìn)行對(duì)接。在本研究中使用該編號(hào)底物進(jìn)行對(duì)接時(shí)，發(fā)現(xiàn)與麥芽三糖底物可形成氫鍵相互作用的氨基酸殘基有Y80、H286和R333三個(gè)位點(diǎn)(如圖1所示)，該3個(gè)位點(diǎn)氨基酸殘基雖然在一級(jí)結(jié)構(gòu)上距離較遠(yuǎn)，但在三級(jí)結(jié)構(gòu)中距離較近，均處于該淀粉酶的催化區(qū)域(Domain A)內(nèi)。其中，Y80、H286和R333其與麥芽三糖的親和力分別為：-1.613 1 kJ/mol、-1.545 3 kJ/mol和-1.361 2 kJ/mol。由于可能影響酶水解特性的氨基酸多為結(jié)合位點(diǎn)氨基酸[2, 11]，因此研究中初步選擇以Y80、H286和R333三個(gè)位點(diǎn)氨基酸為待突變位點(diǎn)。

a-ROAmy; b-Y80; c-R333; d-H286; e-YHR; f-L286圖1 ROAmy及其突變體與麥芽三糖對(duì)接結(jié)果Fig.1 Docking results of maltotriose with ROAmy and its mutants

研究中以亮氨酸(L)為替換氨基酸，設(shè)計(jì)引物對(duì)上述3個(gè)位點(diǎn)氨基酸進(jìn)行單位點(diǎn)突變和組合突變，分別獲得突變體Y80L、H286L、R333L和YHR(3個(gè)待突變氨基酸全部突變?yōu)榱涟彼?。同時(shí)，將4個(gè)突變體分別與麥芽三糖進(jìn)行對(duì)接模擬(如圖1所示)，結(jié)果顯示突變體YHR與麥芽三糖對(duì)接后，突變體中僅有L286與麥芽三糖有相互作用，且與麥芽三糖的親和力降低為-2.117 6 kJ/mol，而突變后的L80與L333與麥芽三糖之間沒有發(fā)現(xiàn)相互氫鍵作用(結(jié)果未顯示)。

2.2ROAmy及其突變體最適作用溫度研究

在不同溫度下測(cè)定原酶ROAmy及其突變體的酶活力并計(jì)算相對(duì)值，發(fā)現(xiàn)單突變體中H286L最適作用溫度為55 ℃，較原酶提高了5 ℃，組合突變體YHR最適作用溫度為60 ℃，較原酶提高了10 ℃；突變體YHR在65 ℃和70 ℃時(shí)相對(duì)酶活力分別為最適溫度(60 ℃)下的91.1%和42.1%；H286L在65 ℃和70 ℃時(shí)的酶活力為最適溫度(55 ℃)下的64.5%和23.1%(如圖2所示)。其他2個(gè)單突變體Y80L和R333L的最適作用溫度與原酶相同(其數(shù)據(jù)可參考ROAmy)。通過單突變體與組合突變體的最適作用溫度比較可以發(fā)現(xiàn)，雖然單突變Y80L和R333L的最適作用溫度與原酶相同，但通過與H286L突變進(jìn)行組合后會(huì)進(jìn)一步提高單突變體H286L最適作用溫度。

圖2 溫度對(duì)ROAmy及其突變體YHR和H286L催化活力的影響Fig.2 Effect of temperature on the catalytic activities of ROAmy, YHR and H286L

2.3ROAmy及其突變體溫度穩(wěn)定性研究

將原酶ROAmy及其突變體在不同溫度下保溫20 min后，測(cè)定殘留酶活力，通過比較發(fā)現(xiàn)在40 ℃、60 ℃和70 ℃條件下突變體YHR與原酶的熱穩(wěn)定性在總體趨勢(shì)上差異不明顯；在50 ℃條件下2者具有明顯差異，如原酶在該溫度下保溫20 min后酶活殘留為72.8%(圖3)，而突變體YHR殘留酶活僅為61.2%(圖4)。另，突變體H286L的熱穩(wěn)定性趨勢(shì)與突變體YHR相似，而突變體Y80L和R333L的熱穩(wěn)定性趨勢(shì)與原酶相近(其數(shù)據(jù)可參考ROAmy)。突變體YHR和H286L在最適催化溫度方面較原酶均有所提升，但是2者的熱穩(wěn)性卻有所下降，表明雖然本研究中引入的氨基酸殘基變化可提高突變體在更高溫度下的催化速率，但同時(shí)也在一定程度上破壞了原始酶蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖3 溫度對(duì)ROAmy穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the stability of ROAmy

圖4 溫度對(duì)突變體YHR穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the stability of YHB

2.4ROAmy及突變體最適作用pH研究

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明突變體YHR比原酶(ROAmy)的最適作用pH均為5.5，在其他pH范圍內(nèi)催化速率的總體趨勢(shì)較為相似(圖5)，而突變體H286L的最適作用pH為5.0，比原酶減低了0.5，且總體pH作用條件向酸性范圍內(nèi)偏移；突變體Y80L和R333L的最適作用pH與原酶相近(其數(shù)據(jù)可參考ROAmy)。與研究預(yù)期不同的是，雖然組合突變體YHR以及單突變體Y80L和R333L的pH作用條件與原酶相似，但是突變體H286L的最適作用pH卻明顯發(fā)生了偏移。

圖5 pH對(duì)ROAmy及其突變體YHR和H286L催化活力的影響Fig.5 Effect of pH on the catalytic activities of ROAmy, YHR and H286L

2.5ROAmy及突變體作用麥芽三糖終產(chǎn)物分析

以相同濃度的麥芽三糖為底物，加入酶活相同的ROAmy、YHR、Y80L、H286L和R333L于40 ℃、pH 5.0條件下反應(yīng)8 h后對(duì)形成的終產(chǎn)物進(jìn)行分析可知：與原酶相比，突變體YHR和H286L的作用產(chǎn)物中麥芽糖含量分別提高了18.87%和16.87%(如表1所示)，相應(yīng)的底物殘留變少；突變體Y80L的產(chǎn)物中底物殘留較多，相應(yīng)的產(chǎn)物葡萄糖和麥芽糖濃度略有降低；突變體R333L的產(chǎn)物中各組分濃度與原酶相當(dāng)。上述數(shù)據(jù)顯示突變體YHR和H286L對(duì)底物麥芽三糖的轉(zhuǎn)化率得到了提升，而突變體Y80L對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率卻有所下降，表明該蛋白中H286和Y80兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基可能與該酶的高麥芽糖性能能力有關(guān)。另，需要指出的是，H286的突變(L)對(duì)底物轉(zhuǎn)化能力具有提升作用，而Y80的突變(L)則會(huì)引起轉(zhuǎn)化率降低，然而兩者卻在組合突變體YHR中表現(xiàn)出了一定的正向疊加效應(yīng)。

表1 ROAmy及其突變體水解麥芽三糖終產(chǎn)物比較

注：G1-G6分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖。

2.6 ROAmy及突變體作用淀粉酶終產(chǎn)物分析

在以麥芽三糖為底物研究的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步分析各突變體在淀粉水解過程中的差異，研究中以相同濃度的可溶性淀粉為底物，加入相同酶活力的ROAmy、YHR、Y80L、H286L和R333L于40 ℃、pH 5.0條件下反應(yīng)8 h后可以發(fā)現(xiàn)，突變體YHR作用產(chǎn)物中麥芽糖的濃度最高，其次為突變體H286L，與原酶相比分別提高了11.67%和10.32%(如表2所示)；突變體Y80L的作用產(chǎn)物中麥芽糖濃度與原酶相近，而突變R333L的作用產(chǎn)物中麥芽糖濃度略低于原酶。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，突變體Y80L的作用產(chǎn)物中葡萄糖的量減少，麥芽三糖和麥芽四糖的濃度上升。上述數(shù)據(jù)表明，研究中所選擇的3個(gè)位點(diǎn)氨基酸殘基的變化對(duì)該酶作用淀粉終產(chǎn)物中糖組分含量均有不同程度的影響，其影響的規(guī)律與以麥芽三糖為底物獲得數(shù)據(jù)相似，表明該淀粉酶對(duì)麥芽三糖轉(zhuǎn)化能力的變化可直接影響水解淀粉生成麥芽糖的效率。

表2 ROAmy及其突變體水解可溶性終產(chǎn)物比較

注：G1-G6分別表示葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽六糖。

3 討論

在工業(yè)應(yīng)用過程中，真菌α-淀粉酶與細(xì)菌α-淀粉酶在水解淀粉的過程中最顯著的區(qū)別是真菌α-淀粉酶的作用產(chǎn)物中以麥芽糖為主，因此真菌α-淀粉酶有時(shí)又被稱為糖化型淀粉酶。然而針對(duì)真菌α-淀粉酶為什么具有高麥芽糖形成能力這一問題一直沒有得到明確的解釋，有關(guān)真菌α-淀粉酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其高麥芽糖形成能力之間的關(guān)系研究在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究領(lǐng)域中尚處于空白階段。為此，本文以探索真菌α-淀粉酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與高麥芽糖形成能力之間的關(guān)系為目的，以麥芽三糖為底物配體，通過生物信息學(xué)輔助分析對(duì)米根霉α-淀粉酶進(jìn)行了分子對(duì)接模型構(gòu)建，確定了3個(gè)可能與該淀粉酶高麥芽糖生成能力相關(guān)的氨基酸并利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了相應(yīng)的單突變體和組合突變體，同時(shí)對(duì)突變體的理化性質(zhì)和作用產(chǎn)物進(jìn)行了分析。研究中發(fā)現(xiàn)Y74和H286兩個(gè)殘基的變化對(duì)該酶以麥芽三糖和淀粉為底物形成麥芽糖的能力均有影響，且對(duì)麥芽三糖的作用規(guī)律與對(duì)淀粉的作用規(guī)律相似，表明真菌α-淀粉酶的麥芽糖生成能力與其對(duì)麥芽三糖的水解能力關(guān)系較為密切，這與其他部分有關(guān)該類酶的性質(zhì)研究報(bào)道相符[7, 12]。

研究中初步獲得了與米根霉α-淀粉酶麥芽糖生成能力相關(guān)的部分氨基酸，并使突變體的作用產(chǎn)物中麥芽糖含量得到明顯提升，結(jié)果可為真菌α-淀粉酶高麥芽糖形成機(jī)制以及高麥芽糖形成能力的定向進(jìn)化研究提供一定的理論和方法方面的參考。同時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究是一個(gè)長(zhǎng)期而無止境的過程，本研究中只初步選擇了3個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行單突變和組合突變研究，所獲得的數(shù)據(jù)尚不完整。因此，在以后的工作將選取更多的氨基酸殘基進(jìn)行單突變或定點(diǎn)飽和突變，以綜合比較各突變體性能并進(jìn)一步解釋本研究中無法解答的一些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，以期更為詳細(xì)的解析真菌α-淀粉酶高麥芽糖生成能力相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

[1] GUPTA R, GIGRAS P, MOHAPATRA H, et al. Microbial α-amylases: a biotechnological perspective [J]. Process Biochemistry, 2003, 38(11): 1 599-1 616.

[2] DEY T B, KUMAR A, BANERJEE R, et al. Improvement of microbial α-amylase stability: Strategic approaches [J]. Process Biochemistry, 2016, 51(10): 1 380-1 390.

[3] 劉仲敏, 郭士軍, 薛永梅, 等. 真菌α-淀粉酶固態(tài)發(fā)酵工藝及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 河南科學(xué), 2008, 26(2): 177-180.

[4] 方安然, 牛丹丹, 喬艦, 等. 耐熱異淀粉酶的高效表達(dá)及其在麥芽糖漿制備中的作用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(7): 23-29.

[5] 夏永軍, 沈哲, 艾連中, 等. 兩級(jí)酶解工藝制備超高麥芽糖漿的研究[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2015, 51(2): 70-73.

[6] SWETHA S, DHANYA G, KESAYAN M N, et al. α-Amylases from microbial sources—an overview on recent developments [J]. Food Technology and Biotechnology, 2006, 44(2): 173-184.

[7] MCMAHON H E M, KELLY C T, FORGARTY W M. High maltose-producing amylolytic system of aStreptomycessp. [J]. Biotechnology Letter, 1999, 21(1): 23-26.

[8] DOYEL E M, NOONE A M, KELLY C T, et al. Comparison of the action pattern of two high maltose-forming α-amylases on linear maltooligosaccharides [J]. Enzyme and Microbial Technology, 1999, 25(3): 330-335.

[9] Invitrogen Corporation. Pichia Expression Kit (Version F, Catalog No.: K1710-01): A manual of methods for expression of recombinant proteins inPichiapastoris[R]. San Diego: Invitrogen Corporation, 1997.

[10] MILLER G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar [J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 426-429.

[11] 諶容, 陳敏, 楊春賢. 基于SWISS-MODEL的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模[J]. 生命的化學(xué), 2006, 26(1): 54-56.

[12] COLLINS B S, KELLY C T, FORGAATY W M, et al. The high maltose-producing α-amylase of the thermophilic actinomycete,Thermomonosporacurvata[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1993, 39(1): 31-35.

Preliminaryanalysisofthekeyaminoacidsrelatedtothehighmaltose-formingabilityofRhizopusoryzaeα-amylase

TIAN Fang-yuan1，TANG Bin1,2*，LI Song1,2，YANG Qian1

1(School of Biological and Chemical Engineering, Anhui Polytechnic University, Wuhu 241000, China) 2(Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation, Wuhu 241000, China)

In this study, the computer-assisted simulation technique was used to perform molecular docking forRhizopusoryzaeα-amylase with maltotriose. The amino acid residues related to high maltose-forming ability of the enzyme were selected and mutated. The results showed that the optimum temperature of the mutants YHR and H286L was 10 ℃ and 5 ℃ higher than that of the native enzyme (50 ℃), respectively, and the optimum pH of the mutant H286L decreased by 0.5. Compared with the native enzyme, the content of maltose in the end-products formed from maltotriose by the mutants YHR and H286L increased by 18.87% and 16.87%, respectively, and the content of maltose in the end-products formed from soluble starch was increased by 11.67% and 10.32%, respectively. The results showed that the relationship between H286 and the high maltose production capacity of the enzyme was the closest, and followed by Y80 and R333.

fungal α-amylase; maltose; protein structure; site-directed mutation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014278

碩士研究生(湯斌教授為通訊作者,E-mail:tangbin@ahpu.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31401630)

2017-03-11，改回日期：2017-05-05