羅 磊

董金龍1,2

朱文學1,2

薛依涵1,2

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 河南省農產品干燥裝備工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

金銀花過氧化物酶抑制動力學研究

羅 磊1,2

董金龍1,2

朱文學1,2

薛依涵1,2

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 河南省農產品干燥裝備工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

為分離純化金銀花過氧化物酶，對其酶學性質及抑制動力學進行研究，將三相法純化所得金銀花過氧化物酶，經DEAE纖維素DE-52離子交換層析分離，得到2種金銀花過氧化物酶HSPⅠ和HSPⅡ，其比活力分別為3 312.3，564.8 U/mg。HSPⅠ反應動力學分析表明金銀花過氧化物酶的雙底物酶促反應類型為乒乓機制。抑制動力學研究表明檸檬酸、偏重亞硫酸鈉對金銀花過氧化物酶的抑制類型為不可逆抑制。L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶的抑制類型為可逆抑制，可逆抑制類型為競爭性可逆抑制。L-半胱氨酸抑制常數(shù)KI為0.053 mmol/L。

金銀花；過氧化物酶；純化；抑制動力學

金銀花為忍冬屬植物干燥的花蕾或初開的花，含有揮發(fā)油、有機酸、黃酮環(huán)烯醚萜、皂苷等成分[1-3]，具有抗氧化、抗菌、抗病毒[4-5]等作用。作為一種“藥食同源”植物被廣泛應用于食品、保健品等生產[6-8]。新鮮金銀花不耐貯藏，采摘后需及時加工處理，且金銀花質地較嫩，處理不當易發(fā)生褐變，造成功效成分降解，導致產品品質下降[9]1-5。研究[9]5-10[10]表明，植物酶促褐變是在多酚氧化酶和過氧化物酶等相關酶的作用下，酚類物質氧化為醌，醌類物質聚合形成褐色素引起的。鄧波等[11]分離純化了藕帶過氧化物酶，并對其酶學性質進行了研究。夏炳樂[12]17-19從煙草中分離出了過氧化物酶TOP Ⅰ和TOP Ⅱ，并對其酶學性質及TOP Ⅰ的二級結構進行了研究。劉彩霞[13]1-4研究表明木素過氧化物酶的雙底物反應機制為乒乓反應機制。Perez等[14]對鷹爪豆過氧化物酶進行了純化，并研究了其二級結構和三級結構穩(wěn)定性。

目前金銀花過氧化物酶的相關研究尚不充分。劉娜娜[15]1-2對金銀花過氧化物酶進行了純化及酶學性質研究。在金銀花過氧化物酶雙底物反應機制及抑制動力學方面尚缺乏基礎研究。由于金銀花褐變過程代謝途徑復雜[16-17]，因此分離純化與褐變相關的酶，并進行酶學性質及抑制動力學研究，是控制褐變強度及闡明褐變代謝機理的有效途徑。本試驗在對金銀花過氧化物酶提取純化的基礎上，選擇抑制劑檸檬酸、L-半胱氨酸、偏重亞硫酸鈉，研究其對金銀花過氧化物酶抑制效應，并對抑制動力學及雙底物反應機制進行研究，為抑制金銀花加工過程中褐變發(fā)生提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硫酸銨、氫氧化鈉、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、磷酸、鹽酸、叔丁醇、無水乙醇、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷、丙烯酰胺、甲叉雙丙稀酰胺、甘氨酸、溴酚藍、甘油、四甲基乙二胺、過硫酸銨：分析純。

1.2 儀器與設備

攪拌機：HR2850型，飛利浦電子公司；

pH計：PHS-3C型，上海越平科學儀器有限公司；

紫外-可見分光光度計：UV2400型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：H1850R型，湘儀離心機儀器有限公司；

電泳儀：DYCZ-24DN型，北京六一儀器廠；

玻璃層析柱：1.6 cm×7 cm，上海方畦儀器有限公司；

恒流泵：HL-2型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

梯度混合器：TH-500型，上海滬西分析儀器廠有限公司；

電腦紫外檢測儀：HD-5型，上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金銀花過氧化物酶的提取純化 稱取一定量新鮮無損金銀花，按照料液比1∶7 (g/mL)加入4 ℃ pH 6的磷酸鹽緩沖液打漿2 min，打漿后，提取液于9 000 r/min冷凍(4 ℃)離心15 min，收集上清液即為粗酶液。

粗酶液的初步純化采用三相分離法[18-20]。基于前期試驗，在pH 5.6，硫酸銨質量分數(shù)39.49%，叔丁醇與提取液體積比為1.38的條件下進行。粗酶液在100 r/min攪拌條件下緩慢加入硫酸銨，至硫酸銨質量分數(shù)為39.49%，待硫酸銨固體充分溶解之后用1 mol/L HCl或NaOH溶液調節(jié)混合液的pH至5.6，加入叔丁醇，繼續(xù)攪拌10 min，在4 ℃環(huán)境中靜置1 h，再在4 000 r/min離心10 min。離心之后可以觀察到混合液分為明顯的三相(即上層的有機相，中間層和下層的水相)。用吸管吸除上層的有機相和下層水相，中間層用1 mL pH 6的磷酸鹽緩沖液溶解，透析除去鹽和有機溶劑，凍干備用。

將凍干粉溶于20 mmol/L，pH 7.5的Tris-HCl緩沖液，經10 000 r/min冷凍(4 ℃)離心20 min后，上樣于經預平衡的DEAE纖維素DE-52層析柱，用平衡緩沖液洗脫至基線穩(wěn)定后，用pH 7.5的Tris-HCl緩沖液配制的NaCl溶液進行梯度洗脫。NaCl濃度0～1 mol/L，流速1.8 mL/min，每5 mL收集一管，分別測定每管酶活與蛋白含量，收集酶活性峰，透析脫鹽后凍干備用。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE) 對提取純化的金銀花過氧化物酶進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析[15]23，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%。

1.3.3 酶活力測定 根據文獻[15]18，在比色杯中，以愈創(chuàng)木酚為反應底物，反應體系包括2.95 mL 18 mmol/L愈創(chuàng)木酚，1 mmol/L H2O2(pH 5磷酸緩沖液配制)，0.05 mL酶液。蓋上蓋子在比色皿中迅速混合均勻，在30 ℃下測定470 nm處測吸光度值，每隔20 s計1次數(shù)，以吸光度值每分鐘變化0.01為1個酶活單位。

1.3.4 底物濃度對金銀花過氧化物酶酶促反應速率的影響

在酶活測定反應體系中，固定愈創(chuàng)木酚濃度12 mmol/L，分別在過氧化氫濃度為0.062 5，0.125 0，0.187 5，0.250 0，0.312 5，0.437 5，0.500 0，1.000 0，2.000 0，3.000 0，4.000 0，5.000 0，6.000 0 mmol/L條件下測酶活，測定不同過氧化氫濃度對金銀花過氧化物酶酶促反應速率的影響；固定過氧化氫濃度1 mmol/L，分別在愈創(chuàng)木酚濃度為0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，12.0，24.0，48.0，96.0 mmol/L條件下測酶活，測定不同愈創(chuàng)木酚濃度對金銀花過氧化物酶酶促反應速率的影響。

1.3.5 金銀花過氧化物酶雙底物反應類型 分別固定愈創(chuàng)木酚濃度為2，4，6 mmol/L，在H2O2濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L條件下測得酶促反應速率；分別固定H2O2濃度為0.4，0.6，0.8 mmol/L，愈創(chuàng)木酚濃度為1，2，3，4，5 mmol/L條件下測得酶促反應速率。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，根據雙倒數(shù)動力學圖區(qū)分雙底物反應的乒乓機制和序列機制[21]363-367。

1.3.6 不同抑制劑的抑制效應 向酶反應體系中分別加入0.05 mL不同種類及不同濃度的抑制劑[分別為L-半胱氨酸(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L)，檸檬酸(2，4，6，8，10 mmol/L)，偏重亞硫酸鈉(0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mmol/L)]，混合均勻后，加入0.05 mL酶液，測定不同條件下酶活。通過計算不同抑制劑的半抑制濃度和遲滯時間[22-23]，判斷抑制劑的抑制效果。

1.3.7 不同抑制劑的抑制作用類型 向酶反應體系中加入0.05 mL不同濃度L-半胱氨酸(0.1.2，0.3，0.4，0.5 mmol/L)、檸檬酸(2，4，6，8，10 mmol/L)、偏重亞硫酸鈉(0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mmol/L)，分別加入0.05 mL不同質量濃度的金銀花過氧化物酶(0.1，0.2，0.3，0.4 g/L)，測定酶活，分析在不同抑制劑條件下酶濃度與酶活性的關系，判斷不同抑制劑的抑制類型[24]。

1.3.8 可逆抑制劑的抑制動力學 根據1.3.7對不同抑制劑抑制類型的判斷，選擇對具有可逆性抑制的抑制劑進行抑制動力學研究，向酶反應體系中加入0.05 mL不同濃度抑制劑，固定H2O2濃度，在不同愈創(chuàng)木酚濃度(2，4，6，8，10 mmol/L)下測定酶促反應的速率，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖判斷不同抑制劑可逆抑制類型。通過米氏方程的斜率和縱軸截距對抑制劑濃度二次作圖，所得兩條直線的橫軸截距分別為抑制劑對游離酶的抑制常數(shù)KI和對酶—底物絡合物的抑制常數(shù)KIS[25-27]。

H2O2濃度測定用經草酸鈉標定的高錳酸鉀溶液進行滴定。產物濃度[28]以愈創(chuàng)木酚氧化產物四聯(lián)甲氧基連酚的消光系數(shù)ε470=26.6 mL/(mmol·cm)計算。

2 結果與分析

2.1 金銀花過氧化物酶的DEAE纖維素DE-52離子交換層析

將三相法初步純化的金銀花過氧化物酶經DEAE纖維素DE-52進行離子交換層析，由圖1、2可知，用0～1 mol/L的NaCl進行梯度洗脫，可以得到4個洗脫峰。分別測定各洗脫峰的酶活和蛋白含量，結果表明前2個洗脫峰未表現(xiàn)出過氧化物酶酶活，第3、4洗脫峰有過氧化物酶活性，分別為HSPⅠ(honeysuckle peroxidaseⅠ)和HSPⅡ(honeysuckle peroxidaseⅡ)，出現(xiàn)第3、4洗脫峰時的NaCl濃度分別為0.215，0.291 mol/L。將第3、4個峰對應的洗脫液試管分別合并，由酶活和蛋白含量計算出HSP Ⅰ比活力為3 312.3 U/mg，HSPⅡ比活力為564.8 U/mg。所得HSPⅡ低于上樣所用三相法得到的比活力為1 021.6 U/mg的酶，可能是離子交換層析通過所帶電荷不同將蛋白組分分離，第4洗脫峰可能含有較多帶電相同的雜蛋白，因此選擇第3洗脫峰所得活性較高的HSPⅠ進行抑制動力學研究。

圖1 金銀花過氧化物酶洗脫曲線

1. 三相分離法純化金銀花過氧化物酶 2. 離子交換層析純化金銀花過氧化物酶

圖2 金銀花過氧化物酶聚丙烯酰胺凝膠電泳

Figure 2 PAGE ofLoniceraJaponicaThunbPeroxidase

2.2 底物濃度對金銀花過氧化物酶酶促反應速率的影響

由圖3、4可知，當愈創(chuàng)木酚濃度固定，過氧化氫濃度在0.062 5～1.000 0 mmol/L時，酶促反應速率隨底物濃度增大而增大；當過氧化氫濃度>1.000 0 mmol/L時，反應速率趨于穩(wěn)定。固定過氧化氫濃度，愈創(chuàng)木酚濃度在0.4～96.0 mmol/L時，反應速率隨底物濃度增大而增大，當愈創(chuàng)木酚濃度>96.0 mmol/L時，反應速率趨于穩(wěn)定。根據中間反應復合物學說[21]351，當酶濃度一定、底物濃度較小時，反應速率與底物濃度有關，隨著底物濃度的增大，酶—底物中間復合物生成增多，反應速率取決于酶—底物中間復合物濃度；當?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時，溶液中酶處于飽和狀態(tài)，即使增加底物濃度，也無法生成更多的酶—底物中間復合物，反應速率達到最大值。

圖3 過氧化氫濃度對酶促反應速率的影響

圖4 愈創(chuàng)木酚濃度對酶促反應速率的影響

2.3 金銀花過氧化物酶雙底物反應類型

雙底物酶促反應按動力學機制可分為序列反應和乒乓反應[21]363-367。這2種反應可以通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖區(qū)分。在乒乓機制中，將一種底物固定在幾個不同濃度，用另一種底物濃度與反應速率作圖，可以得到1組平行線，在序列反應機制中，可以得到1組相交直線。由圖5可知，固定幾個不同的愈創(chuàng)木酚濃度，過氧化氫濃度與反應速率的雙倒數(shù)曲線相互平行。固定幾個不同的過氧化氫濃度，愈創(chuàng)木酚濃度與反應速率的雙倒數(shù)曲線相互平行。說明在反應動力學方面金銀花過氧化物酶的雙底物酶促反應類型為乒乓機制。與煙草過氧化物酶[12]17-19和木素過氧化物酶[13]1-4雙底物反應類型類似。

2.4 不同抑制劑的抑制效應

2.4.1L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶的抑制效應 由圖6可知，L-半胱氨酸濃度在0.1～0.5 mmol/L時，L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶抑制作用表現(xiàn)在遲滯時間的延長與酶相對活性的下降，對酶活性的抑制作用隨抑制劑濃度增大而增強。酶的相對活性由79.1%下降到49.6%，遲滯時間由10.9 s上升到30.3 s，可能是L-半胱氨酸的存在使底物較難與酶活性位點結合，導致酶促反應遲滯時間延長，酶催化活性降低。

圖5 金銀花過氧化物酶雙底物反應類型

圖6 L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶抑制作用

2.4.2 檸檬酸對金銀花過氧化物酶的抑制效應 由圖7可知，檸檬酸濃度在2～10 mmol/L時，檸檬酸對金銀花過氧化物酶的抑制作用逐漸增強，酶的相對活性由87.1%下降到70.1%，遲滯時間由8.4 s上升到18.3 s。檸檬酸在對金銀花過氧化物酶的抑制作用一方面使酶的活性下降，另一方面延長了酶發(fā)揮作用的時間。在相同濃度條件下，與L-半胱氨酸相比，檸檬酸對金銀花過氧化物酶抑制作用較弱。

圖7 檸檬酸對金銀花過氧化物酶抑制作用

2.4.3 偏重亞硫酸鈉對金銀花過氧化物酶的抑制效應 由圖8可知，偏重亞硫酸鈉對金銀花過氧化物酶抑制作用表現(xiàn)在遲滯時間的延長與酶相對活性的下降。偏重亞硫酸鈉濃度在0.02～0.10 mmol/L時，酶的相對活性由55.5%下降到28.3%，遲滯時間由15.8 s上升到21.6 s。在相同濃度條件下，偏重亞硫酸鈉較檸檬酸和L-半胱氨酸表現(xiàn)出較強的抑制作用，原因可能是亞硫酸鹽能夠與酶蛋白鍵聯(lián)，修飾了酶蛋白使其活性降低[29]。

2.5 不同抑制劑的抑制作用類型

向酶反應體系中加入一定量抑制劑，在不同濃度抑制劑條件下，用酶濃度對反應初速率作圖，通過抑制劑濃度與酶量的關系，可以判斷抑制劑作用于酶的抑制類型是可逆抑制還是不可逆抑制[25]。由圖9可知，在不同濃度L-半胱氨酸條件下，酶活力與酶量是一組斜率不同的直線，說明L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶的抑制為可逆性抑制；在不同濃度檸檬酸和偏重亞硫酸鈉條件下，酶活力與酶量是一組平行直線，說明檸檬酸和偏重亞硫酸鈉對金銀花過氧化物酶的抑制為不可逆抑制。

圖8 偏重亞硫酸鈉對金銀花過氧化物酶抑制作用

2.6L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶的可逆抑制動力學

由圖10可知，在不同L-半胱氨酸濃度條件下，以酶促反應速率對底物濃度通過雙倒數(shù)作圖，雙倒數(shù)曲線相交于縱軸，直線的斜率隨抑制劑濃度的增大而增加，直線與縱軸截距不隨抑制劑濃度的增加而變化，即最大反應速率Vmax不變，米氏常數(shù)Km隨抑制劑濃度的增大而增加，這是競爭性抑制的特點，說明L-半胱氨酸只能與金銀花過氧化物酶結合，不能與酶—底物復合物結合。通過將抑制劑濃度與一次作圖的斜率和截距分別二次作圖可以得到酶抑制劑復合物的解離常數(shù)KI與酶底物抑制劑復合物的解離常數(shù)KIS，由圖11可知，抑制常數(shù)KI為0.053 mmol/L，KIS為0，即L-半胱氨酸不能與酶—底物復合物結合。

3 結論

(1) 將三相法提取純化的金銀花過氧化物酶經DEAE纖維素DE-52離子交換層析分離得到2種金銀花過氧化物酶HSP Ⅰ和HSP Ⅱ，其比活力為分別為3 312.3，564.8 U/mg。酶學性質及抑制動力學研究表明：當愈創(chuàng)木酚濃度固定，過氧化氫濃度在0.062 5～1.000 0 mmol/L時，酶促反應速率隨底物濃度增大而增大。當過氧化氫濃度>1.000 0 mmol/L時，反應速率趨于穩(wěn)定。固定過氧化氫濃度，愈創(chuàng)木酚濃度在0.4～96 mmol/L時，酶促反應速率隨底物濃度增大而增大，當愈創(chuàng)木酚濃度>96 mmol/L時，反應速率趨于穩(wěn)定。金銀花過氧化物酶的雙底物酶促反應類型為乒乓機制。檸檬酸、偏重亞硫酸鈉對金銀花過氧化物酶的抑制類型為不可逆抑制。L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶的抑制類型為可逆抑制，可逆抑制類型為競爭性可逆抑制。L-半胱氨酸抑制常數(shù)KI為0.053 mmol/L。

圖9 在不同濃度抑制劑下酶活力和酶量的關系

圖10 L-半胱氨酸對金銀花過氧化物酶抑制作用的雙倒數(shù)曲線

Figure 10 Lineweaver-Burk plots for inhibition ofL-cysteine onLoniceraJaponicaThunbPeroxidase

圖11 L-半胱氨酸濃度與Lineweaver-Burk曲線縱軸截距和斜率的關系

Figure 11 Effect of concentration ofL-cysteine on intercept and slope of Lineweaver-Burk plots

(2) 本試驗通過三相分離純化與離子交換柱層析相結合的方法對金銀花過氧化物酶進行純化，同時對金銀花過氧化物酶的雙底物酶促反應類型和抑制動力學進行了研究，對當前金銀花過氧化物酶的研究起到補充作用。

(3) 本試驗只對酶學性質和抑制動力學進行了研究，對金銀花過氧化物酶的蛋白質結構等尚缺乏研究。

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Study on inhibition kinetics of peroxidase from Lonicera Japonica Thunb

LUOLei1,2

DONGJin-long1,2

ZHUWen-xue1,2

XUEYi-han1,2

(1.CollegeofFoodandBioengineering,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang,Henan471023,China; 2.HenanAgriculturalProductsDryingEquipmentEngineeringTechnologyResearchCenter,Luoyang,Henan471023,China)

In order to purify honeysuckle peroxides and study the enzymatic properties and inhibition kinetics,DEAE cellulose DE-52 ion exchange chromatography was used for purification of peroxidase from Lonicera Japonica Thunb prepared preliminarily by three-phase partitioning. Two kinds of peroxidase, HSPⅠ(honeysuckle peroxidaseⅠ)and HSPⅡ(honeysuckle peroxidaseⅡ), were purified,the specific activity were 3 312.3 U/mg and 564.8 U/mg respectively. The double substrate enzymatic reaction type was PingPong reaction analyzed by the reaction kinetics. Citric acid, Sodium metabisulfite showed irreversible inhibition toLoniceraJaponicaThunbperoxidase,L-cysteine showed reversible inhibition, andL-cysteine was a competitive inhibitor that the inhibition constantKIwas 0.053 mmol/L.

LoniceraJaponicaThunb; peroxidase; purification; Inhibition kinetics

國家自然科學基金聯(lián)合基金項目(編號：U1304330)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊計劃(編號：17IRTSTHN016)

羅磊，男，河南科技大學教授，博士。

朱文學(1967—)，男，河南科技大學教授，博士。 E-mail：zwx@haust.edu.cn

2017—05—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.07.026