黃姝玲

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

菲律賓蛤仔過(guò)敏原的性質(zhì)研究

黃姝玲

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建 福州 350002）

文章以菲律賓蛤仔為對(duì)象，對(duì)其過(guò)敏原進(jìn)行性質(zhì)研究。采用丙酮沉淀、等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨鹽析及加熱處理等方法純化過(guò)敏原；采用SDS-PAGE和Western-blot鑒定該過(guò)敏原；通過(guò)pH穩(wěn)定性試驗(yàn)、消化穩(wěn)定性試驗(yàn)進(jìn)一步分析其性質(zhì)。結(jié)果顯示菲律賓蛤仔中主要過(guò)敏原的分子量為35kDa，耐酸堿性良好，且具有較高的消化穩(wěn)定性，其降解產(chǎn)物仍具有抗原性。研究驗(yàn)證了菲律賓蛤仔中的主要過(guò)敏原是原肌球蛋白（tropomyosin，TM），并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了分析，為過(guò)敏原的安全控制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

菲律賓蛤仔；過(guò)敏原；原肌球蛋白；性質(zhì)研究

過(guò)敏原是過(guò)敏發(fā)生的必要條件，是指能發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的抗原，常見(jiàn)的有2000-3000種，醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)記載接近2萬(wàn)種。與其他過(guò)敏原相比，食物過(guò)敏原的種類更多，成分更復(fù)雜，環(huán)境影響因素也較多。

貝類是最優(yōu)質(zhì)的食用蛋白質(zhì)資源之一，但貝類引起的過(guò)敏性現(xiàn)象較為常見(jiàn)，屬于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織公布的8大類容易引起過(guò)敏的食物之一[1-2]。菲律賓蛤仔，是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，產(chǎn)量占全世界的90%以上[3]。蛤肉蛋白質(zhì)含量高，脂肪含量低且含人體所需的必需氨基酸種類齊全，同時(shí)，富含脂肪酸、EPA和DHA，具有良好的保健作用[4]，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，但其卻是引發(fā)人過(guò)敏反應(yīng)較為常見(jiàn)的食用貝類之一。

研究以菲律賓蛤仔為對(duì)象，對(duì)其主要過(guò)敏原進(jìn)行分離純化，并通過(guò)SDS-PAGE分析其純化效果與分子量大小，隨之進(jìn)行pH穩(wěn)定性的研究，再通過(guò)模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)分析其消化穩(wěn)定性并在此基礎(chǔ)上采用熱處理方法研究加工工藝對(duì)菲律賓蛤仔主要過(guò)敏原的影響，同時(shí)通過(guò)Western-blot來(lái)檢測(cè)其抗原性。此研究可為開(kāi)發(fā)低過(guò)敏原甚至無(wú)過(guò)敏性的可食用貝類食品提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮的菲律賓蛤仔購(gòu)于廈門(mén)市集美菜市場(chǎng)，取肉后立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；Tris Base：美國(guó)Novon；SDS、TEMED（四甲基一烯二銨）、Pancreatin、麗春紅：美國(guó)Sigma；丙烯酰胺：美國(guó)Bio-Rad；脫脂奶粉：中國(guó)內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；DTT：美國(guó)Bio-Rdd；APS、考馬斯亮藍(lán)R-250：中國(guó)廈門(mén)星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；Glycine：美國(guó)Promega；β-巰基乙醇：美國(guó)Bio-Basic-Inc；Tween-20， C.P.：中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白：美國(guó)New Egnland Biolabs。

垂直電泳槽Mini protean：美國(guó)Bio-Rad；電轉(zhuǎn)移裝置PS-9：中國(guó)Jim-X；冷凍離心機(jī)Avanti-25：美國(guó)Beckman；凝膠成像儀Bio-profile：法國(guó)Vibler Lourmat；凝膠成像儀Alpha：美國(guó)Proteinsimple；超純水系統(tǒng)RIOS8：美國(guó)Millipore

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菲律賓蛤仔過(guò)敏原的純化[5]

取蛤肉100g，加入10倍體積Buffer A（50mmol/L KCl，2mmol/L NaHCO3，10 mmol/L EDTA），搗碎勻漿，4℃離心，取沉淀重復(fù)操作4次，取上清；丙酮攪拌過(guò)濾，風(fēng)干；加入10倍體積的Buffer B（20 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L β-巰基乙醇），4℃離心，得上清；調(diào)節(jié)pH至4.5，充分沉淀，4℃離心，取沉淀，用20mmol/L Tris-HCl（pH7.5）溶解；加入41%～60%(NH4)2SO4，攪拌，靜置，4℃離心，所得沉淀溶于20mmol/L Tris-HCl（pH7.5）并于95℃水浴10min，4℃離心，所得的上清溶液分裝并于-20℃保存。

1.2.2 菲律賓蛤仔過(guò)敏原pH穩(wěn)定性的研究

將純化過(guò)敏蛋白分別加入不同pH值的緩沖液中（pH值1.0、2.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、13.0），置于4℃冰箱內(nèi)分別反應(yīng)0.5h和6h，之后取出，調(diào)節(jié)pH至7.0，立即進(jìn)行SDS化，以置于pH7.0緩沖液的樣品為對(duì)照。

1.2.3 菲律賓蛤仔過(guò)敏原消化穩(wěn)定性的研究

1.2.3.1 體外模擬胃液消化[6]

總反應(yīng)體系為1mL，胃蛋白酶（12 U/mg）與純化過(guò)敏蛋白的比例為1:50（w:w）。將含有胃蛋白酶的模擬胃液SGF（50mmol/L NaCl，pH1.2）于37℃預(yù)熱15min，加入純化的過(guò)敏蛋白混勻，振蕩反應(yīng)；分別在反應(yīng)0、1、2、5、10、15、30、60 min時(shí)取100 μL反應(yīng)液，加入30μL、200mmol/L Na2CO3混勻，置于冰上。對(duì)照試驗(yàn)不加胃蛋白酶。

1.2.3.2 體外模擬腸液消化[7]

總反應(yīng)體系為1mL，胰蛋白酶（390 U/mg）與純化的過(guò)敏蛋白比例為1:50（w:w），胰凝乳蛋白酶（360 U/mg）與底物的比例是1:1000（w:w）。將含有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的模擬腸液S I F（50mmol/L KH2PO4，pH7.5）在37℃預(yù)熱15min，加入純化的過(guò)敏蛋白混勻，振蕩反應(yīng)；分別在反應(yīng)0、1、5、15、30、60、120、240 min時(shí)取100μL反應(yīng)液，95℃加熱5min，置于冰上。對(duì)照反應(yīng)不加蛋白酶。

1.2.3.3 二相模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)

將含有胃蛋白酶的SGF于37℃預(yù)熱15min，加入純化的過(guò)敏蛋白混勻，反應(yīng)一定時(shí)間后取出100μL反應(yīng)液，加入30μL 200mmol/L Na2CO3，混勻后置于冰上。加入Na2CO3中和終止反應(yīng)并使消化環(huán)境pH值在7.5左右，加入胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶或胰酶，反應(yīng)一定時(shí)間后取100μL反應(yīng)液，95℃下加熱5min，置于冰上。其中，0min樣品是將含有蛋白酶的SGF與SIF先加熱失活終止反應(yīng)，再加入底物。對(duì)照反應(yīng)不加蛋白酶，其余步驟相同。

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析

各階段的純化效果及純化蛋白質(zhì)的分子量用SDS-PAGE分析，以分子量為116.0-14.4kDa的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為對(duì)照，方法是在Leammli等[8]的基礎(chǔ)上略作改動(dòng)。分離膠和積層膠濃度均為12%，上樣量為8 μL，Marker上樣量為4μL，染色液為考馬斯亮藍(lán)R250。

1.2.5 Western-blotting免疫分析

Western-blotting參照Towbin[9]等的方法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)蛋白使用Prestained Marker，染液為麗春紅，用5%脫脂奶粉作封閉液，兔抗鋸緣青蟹TM特異性多克隆抗體作為一抗，羊抗兔多克隆抗體作為二抗，鋸緣青蟹TM作為陽(yáng)性對(duì)照，牛血清蛋白（BSA）作為陰性對(duì)照，并采用ECL法進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 菲律賓蛤仔過(guò)敏原的分離純化結(jié)果與Westernblotting確認(rèn)

菲律賓蛤仔肉經(jīng)過(guò)丙酮沉淀、等電點(diǎn)沉淀、硫酸銨鹽析及加熱處理等方法處理后，分離得到純化的過(guò)敏原，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示，該過(guò)敏原分子量在35kDa左右。

圖1 菲律賓蛤仔主要過(guò)敏原純化電泳圖

據(jù)國(guó)內(nèi)外研究表明，蝦和貝類動(dòng)物中的主要過(guò)敏原為原肌球蛋白（Tropomyosin，Tm），是一種種間交叉反應(yīng)明顯的糖蛋白[10-11]。研究以此為據(jù)，將通過(guò)電泳分離得到的菲律賓蛤仔蛋白質(zhì)凝膠進(jìn)行Western-blotting免疫分析，主要以兔抗鋸緣青蟹TM特異性多克隆抗體作為一抗、鋸緣青蟹TM為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行分析。經(jīng)ECL顯色，結(jié)果如圖2所示，純化的過(guò)敏蛋白（泳道1）和青蟹TM（泳道2）均與抗體發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，而B(niǎo)SA（泳道3）未與抗體發(fā)生特異性結(jié)合。因此，可確認(rèn)菲律賓蛤仔中的主要過(guò)敏蛋白為原肌球蛋白。

圖2 純化蛤仔TM的Western-blot分析

2.2 菲律賓蛤仔過(guò)敏原pH穩(wěn)定性的SDS-PAGE分析

菲律賓蛤仔原肌球蛋白pH穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，在不同pH條件下，分別反應(yīng)0.5h（圖3a）與6h（圖3b），TM條帶均未出現(xiàn)消減現(xiàn)象，由此說(shuō)明菲律賓蛤仔TM在酸堿條件下都具有良好的穩(wěn)定性。

圖3 純化蛤仔過(guò)敏蛋白的pH穩(wěn)定性電泳圖

2.3 純化菲律賓蛤仔TM的模擬胃腸液消化試驗(yàn)分析

2.3.1 純化菲律賓蛤仔TM單相模擬胃腸液消化

純化菲律賓蛤仔TM的體外SGF、SIF消化結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可知，胃蛋白酶與蛤仔TM比例為1/50進(jìn)行SGF消化，條帶幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，消化1h后TM仍然沒(méi)有被降解，說(shuō)明TM對(duì)胃蛋白酶有很強(qiáng)的耐降解性（圖4a）；而胰蛋白酶與蛤仔TM以1/100的比例反應(yīng)，1min后TM即開(kāi)始降解，60min后，TM被完全分解，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在20～30 kDa之間也逐漸產(chǎn)生降解條帶，消化4h后，僅在20 kDa處能觀察到一條微弱的蛋白條帶（圖4b）。同樣的，胰凝乳蛋白酶與TM以比值為1/1000進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)1min TM即開(kāi)始降解，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，原始TM條帶被分解，并主要在30 kDa左右逐漸產(chǎn)生降解條帶，消化4h后，在30kDa處仍能觀察到一條清晰的蛋白條帶（圖4c）。

圖4 純化蛤仔原肌球蛋白的模擬胃腸液消化

圖5 純化蛤仔原肌球蛋白的模擬二相胃腸液消化

2.3.2 純化菲律賓蛤仔TM二相模擬胃腸液消化

人的消化過(guò)程是由口腔開(kāi)始，經(jīng)食道進(jìn)入胃，再由小腸進(jìn)行消化與營(yíng)養(yǎng)吸收，一般而言，食物在胃部停留30～60min，在小腸停留約8h。過(guò)敏原若未經(jīng)過(guò)胃蛋白酶消化，可能導(dǎo)致胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用位點(diǎn)不會(huì)完全暴露出來(lái)。同時(shí)，相比于胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶，胰酶更接近于人體內(nèi)小腸中的消化酶。因此，按照人體的消化順序、消化時(shí)間分別進(jìn)行了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶對(duì)TM的消化試驗(yàn)以及胃蛋白酶與胰酶對(duì)TM的消化試驗(yàn)，然后通過(guò)SDS-PAGE分析，進(jìn)行對(duì)比。如圖5所示，菲律賓蛤仔TM對(duì)胃蛋白酶有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，反應(yīng)60 min完全沒(méi)有被降解（圖5a，圖5c）；相比之下，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶反應(yīng)15 min，菲律賓蛤仔TM即開(kāi)始降解，但在240 min后蛋白原始條帶仍然未完全降解（圖5b）；胰酶對(duì)菲律賓蛤仔TM的消解效果與之相似，反應(yīng)15 min出現(xiàn)降解條帶，但在240 min后原始蛋白條帶被完全降解(圖5d)。推測(cè)可能是由于胰酶中含有更多種類的消化酶從而促使了菲律賓蛤仔TM的降解。總體而言，2組實(shí)驗(yàn)對(duì)TM的降解效果差異不明顯。

圖6 免疫印跡檢測(cè)模擬胃腸液對(duì)TM的消化情況

2.4 純化菲律賓蛤仔TM模擬胃腸液消化Westernblotting分析

為了確認(rèn)蛤仔TM經(jīng)消化降解后其抗原性的變化情況，采用兔抗青蟹TM特異性多克隆抗體以Western-blot鑒定TM的降解過(guò)程及其產(chǎn)物。圖6a顯示，胃蛋白酶對(duì)原肌球蛋白的降解作用微弱，反應(yīng)60min后，主條帶仍然未被降解，其抗原性也沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。在模擬腸液消化實(shí)驗(yàn)中，以胰蛋白酶作為消化酶時(shí)，反應(yīng)5min即有降解產(chǎn)物生成，并在30kDa和23kDa處產(chǎn)生降解條帶。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這些降解條帶被進(jìn)一步分解（圖6b），這些降解條帶都存在一定的抗原性。胰凝乳蛋白酶分解TM的結(jié)果與胰蛋白酶相似，但胰凝乳蛋白酶作用后主要在28 kDa處產(chǎn)生1條帶（圖6c）。不同的酶作用TM產(chǎn)生的降解條帶不同，這與消化酶對(duì)底物的作用位點(diǎn)不同有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

雖然已有研究證實(shí)原肌球蛋白是貝類動(dòng)物的主要過(guò)敏原，但是不能排除不同物種間存在差異的可能性。文章以菲律賓蛤仔為研究對(duì)象，通過(guò)分離得到純化的過(guò)敏原，采用免疫印跡法，以兔抗青蟹TM特異性多克隆抗體對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該致敏蛋白分子量為35kDa，同國(guó)內(nèi)報(bào)道的原肌球蛋白分子量相近[12]，并且與蟹類TM抗體具有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)，故確認(rèn)菲律賓蛤仔中的主要過(guò)敏蛋白為原肌球蛋白TM。

過(guò)敏原通常具有良好的穩(wěn)定性，文章對(duì)TM的pH穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性進(jìn)行了研究、分析。從pH穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果可以看出，TM在不同酸堿環(huán)境中均能保持良好的穩(wěn)定性，由此可知，當(dāng)人體攝入TM后，胃酸并不能使TM降解；研究模擬人體消化酶對(duì)菲律賓蛤仔過(guò)敏蛋白的分解作用，結(jié)果表明TM對(duì)胃蛋白酶具有很強(qiáng)的耐消化性，酶/蛋白比值為1/50（w/w）反應(yīng)60min后，TM仍然沒(méi)有被降解；胰蛋白酶與蛤仔TM反應(yīng)，1min后TM即出現(xiàn)微弱的降解，60min后原始蛋白條帶已被完全降解，在分子量為23、30 kDa處出現(xiàn)降解產(chǎn)物條帶。同樣的，TM與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)1min開(kāi)始出現(xiàn)降解，并在28kDa左右出現(xiàn)降解條帶，隨后繼續(xù)消化1h，僅剩下小分子量的降解產(chǎn)物，TM原始蛋白條帶完全被分解。該結(jié)果與其他學(xué)者對(duì)食品過(guò)敏原的消化特征的研究結(jié)果相似[13，14]。菲律賓蛤仔TM被3種蛋白酶降解過(guò)程中，產(chǎn)生不同分子量的降解條帶，主要是因?yàn)椴煌笇?duì)肽段的特異性分解位點(diǎn)不同所致[15]。如胰蛋白酶特異選擇Lys和Arg殘基的P1位置，而胰凝乳蛋白酶則優(yōu)先選擇靠芳香族氨基酸（Tyr，Trp，Phe）和Leu的P1位置。但文章未探討酶解過(guò)程中過(guò)敏蛋白的結(jié)構(gòu)變化，尚待進(jìn)一步深入研究分析。

[1]Moneret-Vautrin DA. Epidemiologiede Ialler gieal imentaire etpreva-lencere lativede stroph allergenes[J].Cah Nutr Diet，2001，36(4): 247-252.

[2]Schafer T. Epidemiology of food allergy/food intolerance in adults: associations with other manifestations ofatopy[J].Allergy，2001，56(12): 1172-1179.

[3]張國(guó)范，閆喜武. 菲律賓蛤仔養(yǎng)殖學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社，2010:11-12.

[4]吳云霞，梁健，閆喜武，等. 菲律賓蛤仔營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，34(4): 409-413.

[5]Huang MC，Ochiai Y. Fish fast skeletal muscle tropomyosins show species-specific thermal stability[J]. Comp Biochem Physiol，2005，141(4): 461-471.

[6]Thomas K，Aalbers M，Bannon GA，et al. A multilaboratory evaluation of a common in vitro pepsin digestion assay protocolused in assess ing the safety of novel proteins[J]. Regul Toxico Pharmacol，2004，39(2): 87- 98.

[7]Astwood JD，Leach JN，F(xiàn)uchs RL. Stability of food allergens to digestion in vitro[J]. Nat Biotechnol，1996（14）:1269-1 273.

[8]Leammli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Natural，1970，227(15):680- 685.

[9]Towbin H，Staehelin T，Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocelluLose sheets:Procedure and some applications[J]. PNAS，1979，76(9): 4350-4354.

[10]Dual CB，Slattery M，Reese G，et al. Identification of the major brown shrimp (Penaeus aztecus) as the muscle protein tropomyosin[J]. Int Arch Allergy Immunol，1994，105(1): 49-55.

[11]Leung PS，Chu KH. cDNA cloning and molecular identification of the major oyster allergen from the Pacific oyster Crassostrea gigas[J]. Clin Exp Allergy，2001，31(8): 1287-1294.

[12]呂良濤，藺海鑫，高卿，等. 菲律賓蛤仔過(guò)敏原原肌球蛋白的鑒定與分子克隆[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015，6(11): 4538-4544.

[13]Fu TJ，Abbott UR，Hatzos C. Digestibility of food allergens and nonallergenic proteins in simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid-A comparative study[J]. Food Chem，2002，50: 7154-7160.

[14]Shimakura K，Tonomura Y，Hamada Y，et al. Allergenicity of crustacean extractives and its reduction by protease digestion[J]. Food Chem，2005，91: 247-253.

[15]劉光明，黃園園，蔡秋鳳，等. 淡水魚(yú)類主要過(guò)敏原的模擬腸胃液消化[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2010，34(7): 1136-1142.

TS254.7

：A

：1007-550X（2017）04-0038-06

10.3969/j.issn.1007-550X.2017.04.003

2017-02-13

黃姝玲（1989-），女，福州永泰人，助理工程師，碩士，主要研究方向：微生物學(xué)。