張關(guān)亭， 王保蜂

(河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 河南 鄭州 450004)

miRNA-93在急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)

張關(guān)亭△， 王保蜂

(河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 河南 鄭州 450004)

目的： 探討微小RNA(miRNA)-93在急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)情況及其對急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat增殖的影響和潛在作用機(jī)制。方法: Real-time PCR技術(shù)檢測急性白血病患者骨髓樣本中miRNA-93的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染miRNA-93 inhibitor下調(diào)Jurkat細(xì)胞中miRNA-93的表達(dá)，分別采用CCK-8法、EdU法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活力、增殖及周期，Western blot檢測周期相關(guān)調(diào)控因子cyclin D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、p-Rb及P27的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: miRNA-93在急性白血病患者中呈現(xiàn)高表達(dá)，且在高?；颊咧斜磉_(dá)水平最高；沉默miRNA-93后，Jurkat細(xì)胞的活力下降并出現(xiàn)明顯的G1/S期阻滯，同時細(xì)胞中cyclin D1、CDK4、p-Rb的蛋白水平顯著降低，而P27的蛋白水平顯著升高。結(jié)論: miRNA-93在急性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)顯著升高；沉默miRNA-93可通過調(diào)控周期相關(guān)因子的表達(dá)抑制急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat的增殖。

微小RNA-93; 急性淋巴細(xì)胞白血病; 細(xì)胞增殖

急性白血病(acute leukemia，AL)是血液系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，是由于造血干細(xì)胞惡性克隆，骨髓中原始、幼稚細(xì)胞異常增殖從而抑制正常造血，嚴(yán)重威脅了人類的生命健康。按FAB分型系統(tǒng)分類，AL可分為急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)和急性非淋巴細(xì)胞白血病(acute nonlymphocytic leukemia，ANLL)2大類。其中，ANLL常發(fā)生于成年人，而兒童以ALL多見。有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，一些微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在急性白血病和正常人之間存在表達(dá)譜的差異。此外， Mi等[3]報道，有27個miRNA在ANLL與ALL間表達(dá)有明顯差異，比如Let-7b和miR-223在ANLL中明顯上調(diào)，而miR-128a和miR-128b則在ALL中則明顯高表達(dá)，利用這些差異區(qū)分ANLL與ALL的準(zhǔn)確率在95%以上。這為我們診斷AL提供了新的思路和方法。

miRNA-93是miRNA-106b～25基因簇的一種，其編碼基因位于常染色體7q22.1。研究顯示，miRNA-106b～25基因簇作為miRNA-17～92家族的同源物，在體內(nèi)有致癌作用，如在頭頸鱗癌、結(jié)直腸癌、胃癌及肝癌等腫瘤組織中均可檢測到該家族成員的高表達(dá)[4-7]。然而該家族中每一個miRNA在不同腫瘤中的確切作用不盡相同，Li等[8]研究提示，miRNA-93可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制PTEN基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生長。但關(guān)于miRNA-93與白血病的相關(guān)研究還很少。

基于以上研究背景及本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作，本課題選擇可能與ALL的疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的miRNA-93為研究對象，檢測ALL患者骨髓中的miRNA-93表達(dá)水平，同時分析了miRNA-93對急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞增殖的影響。

材料和方法

1材料與試劑

急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat由鄭州大學(xué)干細(xì)胞中心提供；人淋巴細(xì)胞分離液購自GE Healthcare；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、RPMI-1640培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基均購于Gibco；LipofectamineTM2000及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen； 抗cyclin D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-depen-dent kinase，CDK)4、p-Rb、Rb、P27及GAPDH抗體購于CST；CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購于廣州賴德生物技術(shù)有限公司；EdU細(xì)胞增殖試劑盒購于廣州市銳博生物科技有限公司；細(xì)胞周期檢測試劑盒購于南京凱基公司；miRNA-93 inhibitor序列及SYBR Green I real-time PCR 試劑盒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

2方法

2.1臨床標(biāo)本制備 收集經(jīng)醫(yī)院收診的44例急性淋巴細(xì)胞性白血病患兒和5例行骨骼矯正手術(shù)并排除腫瘤和血液系統(tǒng)疾病患兒的骨髓樣本。采用中國兒童血液病研究組2008方案對選取的ALL患兒進(jìn)行治療及臨床危險度分型：其中ALL標(biāo)?；純?7例，中?；純?5例，高?；純?2例。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)家屬知情同意，并報醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。骨髓穿刺抽取初診或者臨床化療前患兒新鮮骨髓2～4 mL，置于EDTA抗凝管中。另取離心管加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(1.077 g/L)，再加入骨髓液(骨髓液：Ficoll=2∶1或者3∶2)，100×g離心20 min。小心吸取界面層的單核細(xì)胞，PBS洗2次。收集細(xì)胞凍存于-80 ℃冰箱中備用。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 實(shí)驗(yàn)用Jurkat細(xì)胞接種在預(yù)先配制好并過濾除菌的 RPMI-1640 培養(yǎng)基中，于飽和濕度、37 ℃、且5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱的瓶口擰開 1 圈，換液間隔為 2～3 d。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按說明書要求進(jìn)行，組別設(shè)置為對照(control)組，陰性對照(miRNA-negative control，NC)組，miRNA-93 inhibitor轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染步驟如下：轉(zhuǎn)染前 1 d取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長密度達(dá)60%時轉(zhuǎn)入質(zhì)粒；將miRNA-93 inhibitor和miRNA-negative control分別加入Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫條件下孵育5 min；同時另取LipofectamineTM2000加入Opti-MEM培養(yǎng)基中室溫孵育5 min。將兩者混合后室溫反應(yīng)20 min，然后將混合物加入到相應(yīng)組別的細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱中孵育6 h，更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。對照組則為非轉(zhuǎn)染細(xì)胞正常培養(yǎng)相應(yīng)時間。提取總RNA測定轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.3CCK-8法測定細(xì)胞活力 將細(xì)胞以2×108/L密度接種于96孔板，經(jīng)過相應(yīng)處理后，按照操作說明，加入10 μL CCK-8試劑，放置于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，于酶標(biāo)儀上測450 nm處吸光度(A)值。每組設(shè)置3個復(fù)孔取均值，另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對照。

2.4EDU法測定細(xì)胞DNA變化 將細(xì)胞以2×108/L密度接種于96孔板，經(jīng)過相應(yīng)處理后，按照操作說明，加入50 μmol/L EDU試劑孵育2.5 h，棄培養(yǎng)液，加入100 μL 4%多聚甲醛固定30 min，再加入0.2%甘氨酸孵育30 min，PBS洗去反應(yīng)液。0.5% Triton X-100打孔5 min，染色反應(yīng)液孵育30 min。熒光酶標(biāo)儀檢測激發(fā)波長550 nm處紅色熒光強(qiáng)度。每組設(shè)置3個復(fù)孔取均值，另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對照。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 離心收集各組細(xì)胞，冰PBS漂洗2次后離心棄上清；用70%冰乙醇4 ℃固定24 h，1 000×g離心洗去乙醇。依據(jù)試劑盒說明，先后加入RNase及碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液在相應(yīng)的條件下孵育，用流式細(xì)胞儀收集20 000個細(xì)胞，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光強(qiáng)度，分析DNA周期，計算出細(xì)胞各期比例。

2.6Western blot測定蛋白水平 加RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白， BCA蛋白定量試劑盒定量后，調(diào)整各組上樣蛋白總量至60 μg，加入4倍體積的蛋白上樣緩沖液，95 ℃變性5 min，而后上樣進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，按說明書要求加入相應(yīng)比例的 I 抗4 ℃孵育過夜，復(fù)溫，TBST洗滌3次，每次5 min；加入對應(yīng)的 II 抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中顯影、定影，沖洗膠片后經(jīng)Image J軟件行蛋白半定量灰度分析。

2.7Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Trizol說明書提取各組細(xì)胞中的總RNA，測定RNA樣品的純度并定量。取2 μg總RNA經(jīng) SuperScript III reverse transcriptase逆轉(zhuǎn)錄至終體積為20 μL的cDNA，然后依照說明書采用SYBR Green實(shí)時熒光定量PCR試劑盒通過ABI 7300 PCR系統(tǒng)檢測miRNA-93的表達(dá)。PCR反應(yīng)體系包括：1 μL RT逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10 μL SYBR Green PCR Master Mix和500 nmol/L正向以及反向引物。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，循環(huán)50次。U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)量。引物設(shè)計見表1。

表1 引物名稱和序列

F: forward； R: reverse.

3統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組計量資料的組間差異采用t檢驗(yàn)，多組計量資料行單因素方差分析，同時采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)組間的兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1miRNA-93在急性淋巴細(xì)胞白血病患兒體內(nèi)的表達(dá)

Real-time PCR的檢測結(jié)果顯示，其中17例ALL標(biāo)?；純后w內(nèi)miRNA-93相對表達(dá)水平為1.67±0.09，15例中?；純后w內(nèi)miRNA-93相對表達(dá)水平為2.02±0.15，12例高?；純后w內(nèi)miRNA-93相對表達(dá)水平為2.73±0.14，顯著高于5例對照患兒體內(nèi)miRNA-93的表達(dá)水平(0.95±0.06)(P<0.05)。組間兩兩比較結(jié)果顯示高危組患兒miRNA-93的表達(dá)水平最高，中危組次之，標(biāo)危組最低。

2沉默miRNA-93對細(xì)胞活力的影響

通過轉(zhuǎn)染miRNA-93 inhibitor下調(diào)Jurkat細(xì)胞中miRNA-93的表達(dá)，采用real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miRNA-93 inhibitor后，Jurkat細(xì)胞中的miRNA-93表達(dá)水平降低至0.47±0.03(P<0.05)。

采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力的變化，結(jié)果顯示沉默miRNA-93后，Jurkat細(xì)胞活力降低至79.42%±5.01%(P<0.05)。采用EDU法檢測細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果顯示沉默miRNA-93后，Jurkat細(xì)胞的增殖率降低至72.15%±8.01%(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Detection of transfect efficacy (A) and the effect of miRNA-93 down-regulation on the cell viability (B) and cell proliferation (C) in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1轉(zhuǎn)染效率檢測及沉默miRNA-93對細(xì)胞活力和增殖的影響

3沉默miRNA-93對細(xì)胞周期的影響

進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了Jurkat細(xì)胞的周期分布情況，沉默miRNA-93后，G0/G1期的細(xì)胞所占百分比增加至78.71%±4.93%(P<0.05)，S期細(xì)胞所占百分比減少至10.42%±3.17%(P<0.05)，說明沉默miRNA-93可抑制Jurkat細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，見圖2。

4沉默miRNA-93對周期相關(guān)分子蛋白水平的影響

相較于對照組，沉默miRNA-93后周期相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK4、p-Rb 的蛋白水平均顯著降低，而P27的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。提示沉默miRNA-93所致的細(xì)胞增殖抑制作用可能與周期相關(guān)因子有關(guān)，見圖3。

Figure 2. The effect of miRNA-93 down-regulation on the cell cycle distribution in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖2沉默miRNA-93對Jurkat細(xì)胞周期的影響

Figure 3. The effect of miRNA-93 down-regulation on the protein levels of cell cycle-related molecules in the Jurkat cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖3沉默miRNA-93對Jurkat細(xì)胞周期相關(guān)因子蛋白水平的影響

討 論

miRNA是一種單鏈小分子RNA，約由19～25個核苷酸組成。目前相當(dāng)多的研究顯示[1-3]，人體中有許多miRNA在腫瘤中起著類似原癌基因或者抑癌基因的作用。且有研究提示，miRNA-93在多種腫瘤中可發(fā)揮癌基因樣作用。本研究檢測到急性淋巴細(xì)胞白血病患兒體內(nèi)miRNA-93的平均表達(dá)水平顯著升高，與既往的研究具有一致性。通過對患者的臨床資料進(jìn)行進(jìn)一步的分析，本研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-93的表達(dá)與患者的臨床危險度分級具有一定的相關(guān)性，危險度越高，miRNA-93的表達(dá)水平越高。結(jié)果表明，miRNA-93可以作為急性白血病患兒危重分級的一個重要指標(biāo)來指導(dǎo)臨床診斷。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的改變密切相關(guān)，大量研究顯示，腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤形成及發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染miRNA-93 inhibitor，下調(diào)急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat中miRNA-93的表達(dá)，分析其對Jurkat細(xì)胞增殖的影響。CCK-8細(xì)胞活力檢測、EDU細(xì)胞DNA檢測和流式細(xì)胞周期檢測的結(jié)果顯示，沉默miRNA-93可降低Jurkat細(xì)胞活力，抑制DNA復(fù)制，并抑制細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明沉默miRNA-93可抑制Jurkat細(xì)胞增殖。關(guān)于miRNA-93影響白血病細(xì)胞增殖的機(jī)制目前并沒有系統(tǒng)的研究。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)miRNA-93的表達(dá)后，Jurkat細(xì)胞中幾種周期相關(guān)因子cyclin D1、CDK4、、p-Rb 的蛋白水平顯著降低，而P27的表達(dá)則明顯升高。眾所周知，miRNA調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制中，細(xì)胞周期的變化是一個關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[9-11]。調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)因子包括：細(xì)胞周期素(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶以及細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑。其中cyclins可與CDKs結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)Rb的磷酸化，進(jìn)而促使細(xì)胞順利通過周期G1/S調(diào)控點(diǎn)進(jìn)入S期開始DNA復(fù)制；而CDK抑制劑(如P21CIP及P27KIP)則可競爭性與CDK結(jié)合，使其催化亞基失活，從而抑制細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期[12-14]。我們的結(jié)果表明，下調(diào)miRNA-93所致的Jurkat細(xì)胞周期G1/S阻滯，可能是通過調(diào)控周期相關(guān)因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但是這一作用是否涉及其它信號通路以及其中具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入地研究。

綜上所述，miRNA-93在急性白血病中表達(dá)顯著升高，且與患者的臨床危險度相關(guān)；此外，沉默miRNA-93可通過調(diào)控周期相關(guān)因子的表達(dá)抑制細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換，進(jìn)而抑制急性 T 細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat的增殖。

[1] Kumar S, Bakhshi S. Diagnostic & prognostic role of microRNAs in paediatric acute myeloid leukaemia[J]. Indian J Med Res, 2016, 144(6):807-814.

[2] Xu L, Guo Y, Yan W, et al. High level of miR-196b at newly diagnosed pediatric acute myeloid leukemia predicts a poor outcome[J].EXCLI J, 2017, 16:197-209.

[3] Mi S, Lu J, Sun M, et al. MicroRNA expression signatures accurately discriminate acute lymphoblastic leukemia from acute myeloid leukemia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(50):19971-19976.

[4] Zhang R, Wang W, Li F, et al. MicroRNA-106b～25 expressions in tumor tissues and plasma of patients with gastric cancers[J]. Med Oncol, 2014, 31(10):243.

[5] Wang YX, Lang F, Liu YX, et al.Insituhybridization analysis of the expression of miR-106b in colonic cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(1):786-792.

[6] Jiang L, Li X, Cheng Q, et al. Plasma microRNA might as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma and chronic liver disease screening[J]. Tumour Biol, 2015, 36(9):7167-7174.

[7] Xu M, Zhang YY, Wang HF, et al. The expression and function of miRNA-106 in pediatric osteosarcoma[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(4):715-722.

[8] Li N, Miao Y, Shan Y, et al. miR-106b and miR-93 regulate cell progression by suppression of PTEN via PI3K/Akt pathway in breast cancer[J]. Cell Death Dis, 2017, 8(5):e2796.

[9] 唐夏莉， 焦德敏， 陳 君， 等. miRNA-126對肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及EGFR/AKT/mTOR信號通路的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32 (3):458-463.

[10] 孫棟勛，黃棟棟，金巧智，等. miRNA-7通過EGFR/PI3K/Akt通路抑制鼻咽癌5-8F細(xì)胞增殖[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(10):1807-1812.

[11] Hydbring P, Wang Y, Fassl A, et al. Cell-cycle-targeting microRNAs as therapeutic tools against refractory cancers[J]. Cancer Cell, 2017, 31(4):576-590.

[12] Barnum KJ, O’Connell MJ. Cell cycle regulation by checkpoints[J]. Methods Mol Biol, 2014, 1170:29-40.

[13] Prasad R, Katiyar SK. Down-regulation of miRNA-106b inhibits growth of melanoma cells by promoting G1-phase cellcycle arrest and reactivation of p21/WAF1/Cip1 protein[J]. Oncotarget, 2014, 5(21):10636-10649.

[14] He Y, Yu B.MicroRNA-93 promotes cell proliferation by directly targeting P21 in osteosarcoma cells[J]. Exp Ther Med, 2017, 13(5):2003-2011.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 余小慧)

Expression of miRNA-93 in acute lymphocytic leukemia

ZHANG Guan-ting, WANG Bao-feng

(Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Hospital of Henan Province Chinese Medicine Institute, Zhengzhou 450004, China. E-mail:2757002991@qq.com)

AIM: To investigate the expression of microRNA (miRNA)-93 in acute lymphocytic leukemia (ALL) and its effect on the proliferation of acute T-cell leukemia Jurkat cells.METHODS: The expression of miRNA-93 in the bone marrow samples of patients with ALL was measured by real-time PCR. After down-regulation of miRNA-93 by transfection with miRNA-93 inhibitor in the Jurkat cells, the cell viability, cell proliferation and cell cycle distribution were detected by CCK-8 assay, EdU assay and flow cytometry, respectively. Furthermore, the protein levels of cell cycle-related molecules such as cyclin D1, cyclin-dependent kinase 4 (CDK4)， phosphorylation retinoblastoma (Rb) and P27 were measured by Western blot.RESULTS: miRNA-93 was highly expressed in the patients with ALL, and the expression level was highest in the high risk patients. Down-regulation of miRNA-93 inhibited Jurkat cell viability, arrested cell cycle in G1/S transition. In addition, the protein levels of cyclin D1, CDK4 and p-Rb were significantly decreased, the protein expression of P27 was increased in Jurkat cells trasfected with miRNA-93 inhibitor.CONCLUSION: miRNA-93 expression is increased in ALL patients. Down-regulation of miRNA-93 restrains cell proliferation in the acute T cell leukemia cell line Jurkat via regulating cell cycle-related molecules.

MicroRNA-93; Acute lymphocytic leukemia; Cell proliferation

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

1000- 4718(2017)09- 1713- 05

2017- 06- 19 [

] 2017- 07- 21

R733.71； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.029

△通訊作者 Tel： 0371-66347655； E-mail: 2757002991@qq.com