張 韡， 李 忠

(南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院， 河南 南陽 473004)

枸橘苷對胃癌細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制研究

張 韡， 李 忠△

(南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院， 河南 南陽 473004)

目的： 探究枸橘苷對AGS胃癌細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制。方法: MTT實(shí)驗(yàn)檢測枸橘苷對AGS細(xì)胞活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞凋亡；細(xì)胞核染色分析AGS細(xì)胞在枸橘苷處理之后的形態(tài)學(xué)變化；Western blot檢測枸橘苷對AGS細(xì)胞中外源性凋亡通路相關(guān)蛋白 FasL、caspase-8、caspase-3和PARP，以及內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白Bak、Bcl-xL、Bax和caspase-9蛋白水平的影響。結(jié)果: MTT實(shí)驗(yàn)表明枸橘苷抑制AGS胃癌細(xì)胞活力，并且呈時(shí)間、劑量依賴性(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明枸橘苷使細(xì)胞停滯在G1期，凋亡數(shù)量增加(P<0.05);核染色結(jié)果說明，與對照組相比，150 μmol/L枸橘苷處理后細(xì)胞核明顯濃縮， 細(xì)胞凋亡數(shù)量增加；Western blot實(shí)驗(yàn)表明枸橘苷上調(diào)FasL，激活caspase-8和caspase-3，促使活化的caspase-3底物PARP切割(P<0.05)，而對線粒體調(diào)節(jié)的內(nèi)源性凋亡通路相關(guān)蛋白沒有影響。結(jié)論: 枸橘苷通過激活外源性凋亡通路促使AGs細(xì)胞凋亡，抑制胃癌細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，在臨床上可能成為治療胃癌的新型藥物。

枸橘苷； 胃癌細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

胃癌是全球第二大與癌癥相關(guān)的死亡率最高的疾病[1]。AGS細(xì)胞是一種人胃癌細(xì)胞系，可以表達(dá)野生型p53[2]，可用于多種抗腫瘤藥物對于胃癌細(xì)胞的作用研究。而野生型p53是腫瘤抑制蛋白，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期與凋亡[3]。

近年來天然產(chǎn)物在控制腫瘤方面?zhèn)涫荜P(guān)注。已有報(bào)道多種蔬菜和水果含有豐富的黃酮類成分與低癌癥發(fā)病率相關(guān)[4-5]。柑橘類水果含有豐富的黃酮類化合物，例如橘皮苷、川陳皮素、枸橘苷等[6-8]。枸橘苷是二氫黃酮類類化合物，味道苦澀，具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗菌、抗炎和抗腫瘤的作用[9-11]。然而很少研究報(bào)道橘皮苷對胃癌的作用及作用機(jī)制。

材料和方法

1主要試劑

噻唑藍(lán)溴化四唑(MTT)購自上海日初生物技術(shù)公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自Sigma；Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自Bio Vision；所有的抗體及 II 抗購自Cell Signaling Technology;枸橘苷購自上海同田生物技術(shù)公司。

2細(xì)胞來源以及培養(yǎng)

AGS細(xì)胞購自中國生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)在含有10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中。在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)用0.25%的胰酶處理。

3方法

3.1MTT實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞活力用MTT實(shí)驗(yàn)測定。AGS細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，接種密度為1×104，接種24 h，并且設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。之后分2組處理。第1組用不同濃度枸橘苷處理細(xì)胞48 h，將枸橘苷溶解于DMSO中，濃度分別為0(對照組，control group)、50、100和150 μmol/L。另外一組用100 μmol/L枸橘苷處理AGS細(xì)胞不同時(shí)間，分別為24 h、48 h和72 h。用PBS洗滌細(xì)胞之后，用20 μL的5 g/L MTT 37 ℃處理細(xì)胞4 h。棄掉MTT之后，每孔加入100 μL DMSO溶液。96孔板在室溫下溫和搖蕩10 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測吸光度值。

3.2細(xì)胞周期檢測實(shí)驗(yàn) 枸橘苷處理AGS細(xì)胞24 h之后，PBS洗滌細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞于流式管中。用預(yù)冷的70%的乙醇在-20 ℃固定過夜。離心之后，PBS洗滌細(xì)胞。加入500 μL PBS (含有50 mg/L PI、100 mg/L RNase A和 0.2% Triton X-100)，4 ℃避光孵育30 min。采取標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)數(shù)(2～3)×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。

3.3凋亡檢測 使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商說明檢測細(xì)胞凋亡，然后用流式細(xì)胞術(shù)分析。不同濃度(0、50和150 μmol/L)枸橘苷處理AGS細(xì)胞24 h。之后用PBS洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞并且離心(5 min, 4 ℃, 1 000 r/min)。細(xì)胞重懸于200 μL PBS中。再次離心，重懸于500 μL 1×Annexin V Binding Buffer。然后將100 μL細(xì)胞與5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶在室溫下孵育15 min。之后用FACScan流式分析儀分析細(xì)胞凋亡情況。

3.4Western bolt實(shí)驗(yàn) 將AGS胃癌細(xì)胞中培養(yǎng)基棄掉，用PBS洗2次。每個(gè)小皿加入80 μL裂解液，在冰上裂解20 min。刮蛋白，離心(13 min, 4 ℃, 13 000 r/min)收集總蛋白裂解液。BCA工作液根據(jù)BSA(0.5 g/L)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測不同處理細(xì)胞蛋白濃度。制備上樣蛋白。等量蛋白總量在8% SDS-PAGE中分離。之后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶在室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育anti-FasL、anti-caspase-8、anti-caspase-3、anti-PARP、anti-Bak、anti-caspase-9、anti-Bax、anti-Bcl-xL和anti-β-actin抗體，放在4 ℃，過夜。PBS洗3次，每次5min。孵育相應(yīng)的 II 抗。PBS洗3次，每次10 min，在膜上均勻覆蓋ECL化學(xué)發(fā)光液在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

3.5細(xì)胞核染色 不同濃度(0、50和150 μmol/L)枸橘苷處理AGS細(xì)胞24 h之后，PBS洗滌細(xì)胞3次。之后細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌細(xì)胞3次。在常溫避光下，DAPI染色10 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察拍照。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)。計(jì)量資料行one-way ANOVA檢驗(yàn)，組間的兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1枸橘苷抑制AGS細(xì)胞的活力

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明枸橘苷可顯著抑制AGS細(xì)胞活力，并且具有時(shí)間和劑量依賴關(guān)系(P<0.01)，見圖1。

2枸橘苷對人胃癌AGS細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度枸橘苷處理AGS細(xì)胞之后細(xì)胞周期分布和凋亡情況。當(dāng)枸橘苷濃度為50和150 μmol/L時(shí)，AGS細(xì)胞在G1分布分別增加到10.61%和21.88%。Annexin V-FITC/PI分析細(xì)胞凋亡分布情況，用0、50和150 μmol/L枸橘苷處理AGS細(xì)胞之后，細(xì)胞總凋亡率從2.6%增加到14.5%和27.2%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。DAPI染色表明隨著枸橘苷濃度增加，AGS細(xì)胞形態(tài)改變，凋亡數(shù)量增加，見圖2。

Figure 1. The effect of poncirin on AGS cell viability measured by MTT assay. A： the effect of different concentrations of poncirin for 48 h on AGS cell viability; B： the effect of 100 μmol/L poncirin for different time on AGS cell viability. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs24 h.

圖1MTT實(shí)驗(yàn)分析枸橘苷對AGS細(xì)胞活力的影響

3枸橘苷對胃癌細(xì)胞中FasL依賴的外源性凋亡途徑影響

為了檢測FasL是否參與枸橘苷誘發(fā)的配體激發(fā)外源性凋亡途徑，我們采用Western blot法檢測FasL的表達(dá)。結(jié)果顯示枸橘苷呈劑量依賴性地上調(diào)FasL和Fas的表達(dá)(P<0.05)，且枸橘苷能夠以劑量依賴性方式激活FasL的下游靶蛋白caspase-8、caspase-3和PARP的切割，見圖3。

4枸橘苷對胃癌細(xì)胞中線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑影響

為了檢測枸橘苷是否對內(nèi)源性線粒體介導(dǎo)的凋亡通路有作用，用Western blot法分析枸橘苷對線粒體相關(guān)凋亡蛋白影響。與對照組相比，50和150 μmol/L枸橘苷處理細(xì)胞之后Bax/Bcl-xL比值沒有變化，Bak蛋白水平也沒有變化，同時(shí)與線粒體凋亡途經(jīng)相關(guān)的凋亡蛋白caspase-9沒有激活，見圖4。

討 論

幾千年來，柑橘類植物在亞洲被廣泛用于傳統(tǒng)醫(yī)藥[12]。柑橘類果實(shí)中含有豐富的黃酮類化合物，例如橘皮苷、川陳皮素、枸橘苷等通過抑制細(xì)胞周期，促進(jìn)凋亡、自噬、焦亡等途經(jīng)抑制不同的腫瘤細(xì)胞系[13-15]。我們的研究闡明枸橘苷誘導(dǎo)AGS胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。我們的研究主要集中研究凋亡的2條途經(jīng)(內(nèi)源性凋亡途經(jīng)和外源性凋亡途經(jīng))。首先，枸橘苷能夠以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制AGS腫瘤細(xì)胞增殖，以劑量依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；其次，枸橘苷對于AGS細(xì)胞的抑制作用涉及caspase的激活。枸橘苷誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是通過上調(diào)FasL外源性凋亡途經(jīng)，但是不依賴于線粒體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)。

凋亡過程在維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要的作用。凋亡涉及一系列的生物化學(xué)過程導(dǎo)致細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)改變以及細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡涉及的分子信號途經(jīng)有外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡途徑[16-18]。細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明150 μmol/L枸橘苷顯著抑制AGS胃癌細(xì)胞增殖。近年來有研究表明導(dǎo)致多種細(xì)胞系凋亡是細(xì)胞周期被改變所致[19-20]。我們研究發(fā)現(xiàn)枸橘苷處理之后AGS細(xì)胞被阻滯于G1期，而在S期和G2/M期的細(xì)胞比例降低。Annexin V-PI凋亡檢測表明枸橘苷以劑量依賴性方式增加總凋亡細(xì)胞群。這些研究表明枸橘苷使AGS腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Western blot結(jié)果顯示通過上調(diào)FasL蛋白表達(dá)，相繼激活caspase-8和caspase-3，切割PARP，而切割的PARP是活化caspase-3的底物蛋白[21]。這些結(jié)果說明在AGS細(xì)胞中枸橘苷誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞死亡是Fas死亡受體介導(dǎo)的隨后caspase依賴的外源性凋亡途徑。而我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明枸橘苷處理AGS細(xì)胞之后線粒體依賴的凋亡通路并沒有變化。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，過表達(dá)此蛋白會抑制內(nèi)源性凋亡途徑；Bax是促凋亡蛋白，過表達(dá)之后會促進(jìn)內(nèi)源性凋亡通路[22]。枸橘苷處理細(xì)胞之后并沒有發(fā)現(xiàn)Bcl-xL蛋白與Bax蛋白變化，Bcl-xL/Bax比值也沒有發(fā)生變化。此外，內(nèi)源性凋亡相關(guān)蛋白caspase-9在枸橘苷處理AGS胃癌細(xì)胞之后沒有變化。這些結(jié)果表明線粒體誘導(dǎo)凋亡通路并不參與枸橘苷誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞凋亡。

Figure 2. Effect of poncirin on cell cycle distribution and apoptosis of AGS cells. The cells were incubated with different concentrations of poncirin for 24 h. A: representative images and statistical analysis of cell cycle distribution; B: representative images and statistical analysis of cell apoptosis; C: DAPI staining showed nuclear condensation in AGS cells, as indicated by white arrows. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖2枸橘苷對AGS細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及凋亡的影響

Figure 3. The effects of poncirin on Fas ligand (FasL)-mediated extrinsic apoptosis pathway in AGS cells determined by Western blot analysis. The cells were incubated with different concentrations (0, 50, 100 and 150 μmol/L) of poncirin for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖3Westernblot檢測不同濃度枸橘苷對AGS胃癌細(xì)胞中FasL介導(dǎo)的外源性凋亡途徑的影響

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Figure 4. The effects of poncirin on intrinsic apoptosis pathway in AGS cells determined by Western blot analysis. The cells were incubated with different concentrations (0, 50 and 150 μmol/L) of poncirin for 48 h. Mean±SD.n=3.

圖4Westernblot檢測不同濃度枸橘苷對AGS胃癌細(xì)胞中內(nèi)源性凋亡途徑的影響

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Inhibitory effect of poncirin on viability of gastric cancer cells and underlying mechanism

ZHANG Wei, LI Zhong

(Zhang Zhongjing College of Traditional Chinese Medicine, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China. E-mail: lizhong7011@sina.com)

AIM: To explore the effect of poncirin on the growth of AGS gastric cancer cells and the underlying mechanism.METHODS: The effect of poncirin on AGS cell viability was measure by MTT assay. The cell cycle distribution and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. Nuclear staining with DAPI was used to reflect the morphological change of the AGS cells treated with poncirin. The protein levels of extrinsic apoptosis pathway-related proteins such as FasL, caspase-8, caspase-3 and PARP， and mitochondria-mediated intrinsic apoptosis pathway-associated proteins such as Bak, Bcl-xL, Bax and caspase-9 were determined by Western blot.RESULTS: Poncirin inhibited the viability of AGS gastric cancer cells in a time- and concentration-dependent manner (P<0.05). Poncirin induced accumulation of G1DNA content and significantly increased total apoptosis in the AGS cells. Nuclear staining showed a dose-dependent increase in the number of apoptotic cells after treated with poncirin.The protein level of FasL was upregulated in a dose-dependent manner by treatment with poncirin. Poncirin significantly activated caspase-8 and caspase-3. Moreover, poncirin significantly induced the cleavage of PARP in a dose-dependent manner (P<0.05). In addition, the protein levels of Bcl-xL， Bax and Bak were unchanged after treated with different doses of poncirin. Furthermore, caspase-9 was not activated by poncirin treatment in the AGS cells.CONCLUSION: Poncirin has the anti-cancer effect via extrinsic apoptosis pathway to inhibit the growth of AGS gastric cancer cells, possibly making it a therapeutic agent for human gastric cancer treatment.

Poncirin; Gastric cancer cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1637- 06

2017- 05- 15 [

] 2017- 07- 20

R735.2； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.017

△通訊作者 Tel: 0377-62071303； E-mail： lizhong7011@sina.com