范蕊芳， 鄒麗媛， 郝秀蘭， 盧佩梅， 曾軍榮， 蔡東蘭， 劉相富

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1預(yù)防保健科， 2產(chǎn)科， 3輸血科， 廣東 廣州 510630)

Pim-1激酶抑制劑SMI-4a抑制U937細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡*

范蕊芳1， 鄒麗媛1， 郝秀蘭2， 盧佩梅1， 曾軍榮1， 蔡東蘭1， 劉相富3△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1預(yù)防保健科，2產(chǎn)科，3輸血科， 廣東 廣州 510630)

目的： 研究絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1抑制劑SMI- 4a對人類急性髓系白血病細(xì)胞株U937的生長抑制、促凋亡作用及其可能機(jī)制。方法: CCK-8法檢測不同濃度SMI- 4a作用不同時間對U937細(xì)胞的生長抑制率；Annexin V-PI及Hoechst 33342染色法檢測SMI- 4a作用前后細(xì)胞凋亡情況，集落形成實驗檢測SMI- 4a對U937細(xì)胞集落形成能力的影響；Western blot法檢測SMI- 4a對U937細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin表達(dá)變化及細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化；免疫熒光法檢測β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化。結(jié)果: CCK-8結(jié)果顯示SMI- 4a可以抑制U937細(xì)胞的活力，并呈時間和劑量依賴性；Annexin V-PI及Hoechst 33342染色結(jié)果顯示SMI- 4a可以促進(jìn)U937細(xì)胞凋亡；集落形成實驗證實SMI- 4a可以抑制U937細(xì)胞的集落形成能力；Western blot實驗結(jié)果顯示SMI- 4a 作用于U937細(xì)胞48 h后細(xì)胞漿內(nèi)的β-catenin表達(dá)增加，細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin表達(dá)減少，細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax和PARP表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減弱；免疫熒光進(jìn)一步驗證了SMI- 4a 作用后的U937細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin表達(dá)量明顯減少。結(jié)論: SMI- 4a誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡是通過上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)、下調(diào)凋亡抑制基因的表達(dá)來實現(xiàn)的。

Pim-1激酶； SMI- 4a； 急性髓細(xì)胞白血??； 細(xì)胞凋亡

Pim-1激酶是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其編碼基因pim-1最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點而被發(fā)現(xiàn)的[1]。Pim-1的異常表達(dá)可以阻斷多種凋亡誘導(dǎo)通路，使得異常細(xì)胞得以存活，同時還可以干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)控，誘發(fā)染色體分離失敗及多倍性出現(xiàn)，最終形成各種惡性腫瘤[2]。Pim-1對正常造血細(xì)胞和造血系統(tǒng)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和分化均有重要調(diào)節(jié)作用[3- 4]，靶向Pim-1為我們提供了一個治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的新策略。SMI- 4a為選擇性Pim-1小分子抑制劑，研究表明SMI- 4a在體內(nèi)和體外均能顯著抑制Pim-1活性，SMI- 4a既可以通過抑制H3磷酸化進(jìn)而抑制RNA合成，又可以通過降低4EBP1的磷酸化水平而抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程[5]。此外，SMI- 4a可以調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[6]。本課題主要研究SMI- 4a對人類急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)細(xì)胞株U937的生長抑制、誘導(dǎo)凋亡作用，檢測SMI- 4a對β-catenin在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位的影響及其下游相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討SMI- 4a可能的抗白血病作用機(jī)制。

材料和方法

1主要試劑

SMI- 4a和Hoechst 33342購自Sigma；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone；CCK-8試劑盒購自Dojindo；Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；細(xì)胞漿與細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購自碧云天；各種 I 抗購自Cell Signaling Technology；HRP標(biāo)記的 II 抗購自 Protein Group；Alexa Fluor 594熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；甲基纖維素購自R&D；其它生化試劑為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞株為中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院血液科實驗室保存，使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗并根據(jù)實驗需要分組。

2.2CCK-8法檢測藥物對U937細(xì)胞活力的影響 U937細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，分別給予不同濃度 (0、5、10、20、40、60和80 μmol/L) 的SMI- 4a作用24和48 h，從急性髓系白血病患者骨髓提取單個核細(xì)胞，健康志愿者外周血提取單個核細(xì)胞稀釋后按照每孔1×104細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，加入上述濃度SMI- 4a作用24 h，檢測前每孔加入10 μL CCK-8溶液， 繼續(xù)孵育4 h，于 450 nm 波長的酶標(biāo)儀測定吸光度值。

2.3Annexin V-PI法檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞后予PBS洗滌2次，1 000 r/min 離心 5 min，將細(xì)胞重懸于500 μL的binding buffer，先后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，避光放置15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，實驗重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察 收集細(xì)胞后予PBS洗滌1次，加入Hoechst 33342(10 mg/L)染液500 μL，混勻后置于37 ℃ 水浴鍋中孵育15 min，PBS洗滌3次，在有紫外光的熒光顯微鏡下觀察，并隨機(jī)拍照，計數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，實驗重復(fù)3次。

2.5甲基纖維素集落形成實驗 將空白對照(control)組及藥物處理后的U937細(xì)胞培養(yǎng)于甲基纖維素中，5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后觀察集落形成情況。

2.6Western blot檢測細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞后加入細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，離心取上清即為細(xì)胞內(nèi)總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，細(xì)胞漿與細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞漿與細(xì)胞核蛋白，BCA法測定蛋白濃度，等量蛋白上樣，8%～12% SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，TBST洗滌1次，麗春紅染色后置于5% 牛血清白蛋白封閉液中封閉1 h，加入相應(yīng) I 抗孵育4 ℃ 過夜，TBST洗滌3次后加入 II 抗孵育1 h，于暗室中曝光。β-actin作為胞漿蛋白的內(nèi)參照，組蛋白H3作為核蛋白的內(nèi)參照。

2.7免疫熒光法檢測細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的表達(dá)變化 收集細(xì)胞后用PBS洗滌1次，離心，PBS重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×109/L，甩片，4% 多聚甲醛固定，4 ℃ 放置固定40 min，然后加入0.1% Triton X-100破膜，室溫下用3% BSA封閉1 h；PBS洗滌后用3% BSA稀釋 I 抗(1∶40)，4 ℃ 孵育過夜，PBS洗3次后滴加熒光標(biāo)記的 II 抗，室溫避光孵育1 h。把Hoechst (1 000×)用PBS稀釋，每片50 μL，避光染色10 min，用PBS洗3次后封片(mounting medium)，拍照。

3統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時，組間多重比較采用LSD-t檢驗，方差不齊，組間多重比較采用秩和檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1SMI-4a對U937細(xì)胞活力的抑制作用

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)5、10、20、40、60和80 μmol/L的SMI- 4a作用24和48 h后U937細(xì)胞的活力與對照組相比均顯著降低(P<0.01)，并可見SMI- 4a對U937細(xì)胞的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，見圖1A。不同濃度的SMI- 4a作用于AML患者原代細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力均顯著低于同濃度的SMI- 4作用于正常人外周血單個核細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活力(P<0.05或P<0.01)，表明SMI- 4a對AML患者原代細(xì)胞活力的抑制作用明顯大于對正常人外周血單個核細(xì)胞活力的抑制作用，見圖1B。

Figure 1. SMI- 4a inhibited the viability of AML cells. A: U937 cells were treated with various concentration of SMI- 4a for 24 h and 48 h; B: mononuclear cells in bone marrow from the patients with AML and peripheral blood mononuclear cells from normal individuals were exposed to different concentrations of SMI- 4a for 24 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsnormal group.

圖1SMI-4a抑制AML細(xì)胞活力

2SMI-4a誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡

Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，20、40和80 μmol/L的SMI- 4a作用于U937細(xì)胞24和48 h的凋亡率均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，可見SMI- 4a可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，見圖2A。Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，20、40和80 μmol/L的SMI- 4a處理了48 h的U937細(xì)胞，可以在顯微鏡下觀察到部分細(xì)胞核碎裂，計數(shù)100個細(xì)胞，凋亡率均顯著高于對照組(P<0.01)，進(jìn)一步證實SMI- 4a可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，見圖2B。

3SMI-4a抑制U937細(xì)胞集落形成

甲基纖維素集落形成實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過7 d培養(yǎng)，20和40 μmol/L SMI- 4a處理過的細(xì)胞集落形成率均顯著低于對照組(P<0.01)，而80 μmol/L SMI- 4a組未見集落形成，提示SMI- 4a可以抑制U937細(xì)胞的集落形成能力，見圖3。

4SMI-4a對U937細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示20、40和80 μmol/L的SMI- 4a作用于U937細(xì)胞48 h后，與對照組相比， PARP和Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)下降，細(xì)胞漿內(nèi)的β-catenin逐漸增加，細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin逐漸減少，說明SMI- 4a可以抑制U937細(xì)胞內(nèi)β-catenin的轉(zhuǎn)位，見圖4。免疫熒光實驗進(jìn)一步驗證了SMI- 4a處理過的U937細(xì)胞核內(nèi)β-catenin熒光表達(dá)量逐漸減少，見圖5。

討 論

急性髓系白血病是一種多基因異常所致的造血干細(xì)胞克隆性疾病，其生物學(xué)行為主要包括癌基因及抑癌基因的突變、各種生長因子及其受體的異常，這些異常引起其下游信號傳導(dǎo)通路的改變從而影響細(xì)胞的生長與分化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7]。隨著新藥的不斷研發(fā)、治療方案和策略的逐漸優(yōu)化、支持治療條件的改善，急性髓系白血病的治療效果明顯提高，但仍有70%左右獲得緩解的患者最終復(fù)發(fā)并演變?yōu)殡y治性白血病，導(dǎo)致治療失敗而死亡[8]。白血病化療失敗最重要的原因是白血病細(xì)胞耐藥，因此，尋找新的分子靶點,對于提高急性髓系白血病的療效,改善其預(yù)后具有重要的臨床意義。

Pim激酶是一種絲/蘇氨酸激酶[9]。慢性髓細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病患者中Pim激酶的表達(dá)接近正常的3倍，在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者細(xì)胞內(nèi)Pim mRNA的水平接近正常的2倍[10-11]；在套細(xì)胞淋巴瘤患者中Pim激酶高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[12]。在持續(xù)表達(dá)酪氨酸激酶活性的白血病(TEL/JAK2、BCR/ABL、H4/PDGFβR)中Pim-1和Pim-2激酶的表達(dá)水平明顯升高，敲除pim-1可以明顯抑制這些白血病細(xì)胞的生長[4]。

Figure 2. SMI- 4a induced apoptosis in the U937 cells. A: U937 cells treated with SMI- 4a were stained with Annexin Ⅴ-PI and subjected to flow cytometry analysis; B: U937 cells treated SMI- 4a for 48 h were stained with Hoechst 333342 and examined under a fluorescence microscope (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2SMI-4a誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡

Figure 3. SMI- 4a reduced colony formation capacity of AML cells. U937 cells treated with various concentrations of SMI- 4a were incubated in methylcellulose culture for 1 week and observed under microscope (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3SMI-4a抑制U937細(xì)胞集落形成能力

SMI- 4a是Pim-1激酶的小分子抑制劑，在體內(nèi)外均可顯著抑制Pim-1激酶活性。我們研究表明隨著SMI- 4a藥物濃度的增加，U937細(xì)胞的活力受到不同程度地抑制，這種抑制作用呈時間和劑量依賴性，而對正常人外周血單個核細(xì)胞的活力無明顯抑制作用。Annexin V-PI和Hoechst檢測結(jié)果均證實SMI- 4a可以誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，隨著藥物濃度增加及作用時間延長，SMI- 4a誘導(dǎo)凋亡作用越來越明顯，Wes-tern blot實驗結(jié)果顯示隨著SMI- 4a藥物濃度的增加，PARP和Bax的蛋白表達(dá)量是逐漸增加的，而Bcl-2的表達(dá)逐漸減少，考慮SMI- 4a可能是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)報道一致[11]。β-catenin的轉(zhuǎn)位對于Wnt/β-catenin這條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活至關(guān)重要，我們檢測不同濃度SMI- 4a作用于U937細(xì)胞后細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)隨著SMI- 4a濃度的增加，U937細(xì)胞漿內(nèi)β-catenin表達(dá)水平逐漸增加，而細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)水平逐漸降低，免疫熒光檢測結(jié)果證實SMI- 4a作用后細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)量明顯減少，說明SMI- 4a對β-catenin的轉(zhuǎn)位有影響，SMI- 4a是否通過抑制β-catenin轉(zhuǎn)位進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)尚需進(jìn)一步實驗驗證。

Figure 4. The effects of SMI- 4a on the protein expression in the U937 cells. A: the effects of SMI- 4a on the expression of apoptosis-related proteins； B: the effects of SMI- 4a on the expression of β-catenin in the cytosol and nucleus of U937 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4SMI-4a對U937細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. The expression of β-catenin in U937 cells. U937 cells were treated with 80 μmol/L SMI- 4a for 48 h and the expression level of β-catenin was examined by immunofluorescence (×400). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5SMI-4a對U937細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)的影響

本研究初步證實，SMI- 4a可以抑制U937細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡。這將為單用或者聯(lián)合化療藥物治療急性髓系白血病提供理論基礎(chǔ)，為臨床提供新的治療選擇。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Pim-1 kinase inhibitor SMI- 4a inhibits proliferation and induces apoptosis in U937 cells

FAN Rui-fang1, ZOU Li-yuan1, HAO Xiu-lan2, LU Pei-mei1, ZENG Jun-rong1, CAI Dong-lan1, LIU Xiang-fu3

(1Prevention Department of Health,2Department of Obstetrics,3Department of Blood Transfusion, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, China. E-mail: etoly@163.com)

AIM: To study the growth-inhibiting and proapoptotic effects of Pim-1 kinase inhibitor SMI- 4a on human acute myeloid leukemia cell line U937.METHODS: The effect of SMI- 4a on U937 cell viability was measured by CCK-8 assay. The apoptotic rate was assessed by flow cytometry with Annexin V-PI staining and by fluorescence microscopy with Hoechst 33342 staining. Methylcellulose was used to assess colony formation ability of the cells. The expression of β-catenin in the cell cytosol and nucleus was detected by Western blot, and the expression of apoptosis-related proteins in the U937 cells was also examined. Intracellular distribution of β-catenin was detected by the method of immunofluorescence.RESULTS: SMI- 4a inhibited the viability of U937 cells. Annexin V-PI staining showed that SMI- 4a induced apoptosis in dose- and time-dependent manners. Hoechst 33342 staining also verified the apoptosis. SMI- 4a significantly inhibited the colony formation capacity of the U937 cells. The results of Western blot demonstrated that SMI- 4a upregulated the expression of PARP and Bax, downregulated the expression of Bcl-2 and change the distribution of β-catenin in intracellular compartment. Immunofluorescence observation found that SMI- 4a decreased the expression level of β-catenin in the U937 cells.CONCLUSION: SMI- 4a induces U937 cell apoptosis through regulating the expression of apoptosis-related genes.

Pim-1 kinase； SMI- 4a; Acute myeloid leukemia; Apoptosis

1000- 4718(2017)09- 1625- 06

2017- 03- 07 [

] 2017- 06- 07

廣東省科技計劃(No. 2011B2080701008)

R733.7； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.015

△通訊作者 Tel: 020-85252234; E-mail: etoly@163.com