王 君， 常利紅， 李 霞， 陳賢珍， 吳喜福， 王志遠(yuǎn)， 黃子真， 黃健聰， 張革化

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510630)

漢防己甲素對(duì)人鼻咽癌CNE1和CNE2細(xì)胞株的放療增敏作用*

王 君， 常利紅， 李 霞， 陳賢珍， 吳喜福， 王志遠(yuǎn)， 黃子真， 黃健聰， 張革化△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510630)

目的： 探討最大非毒性劑量漢防己甲素(tetrandrine，Tet)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2的放療增敏機(jī)制。方法: 分別采用最大非毒性劑量Tet (對(duì)CNE1細(xì)胞為1.5 μmol/L；對(duì)CNE2細(xì)胞為1.8 μmol/L)、4 Gy放療和最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療處理 CNE1和CNE2細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布，Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞γ-H2AX、cleaved caspase-3、p-CDC25C、CDK1、p-CDK1、cyclin B1、ERK和p-ERK的蛋白水平。結(jié)果: 最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療后可上調(diào)CNE1和CNE2細(xì)胞中γ-H2AX的表達(dá)。放療組CNE1和CNE2細(xì)胞G2/M期的比例分別為(18.09±0.42)%和(18.48±1.32)%，聯(lián)合處理組CNE1和CNE2細(xì)胞G2/M期的比例降為(15.88±1.04)%和(13.80±0.82)%，與放療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合處理可增加放療所致的cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)。不同濃度Tet處理CNE1和CNE2細(xì)胞后，p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平隨Tet濃度增加而升高(P<0.05)，CDK1的表達(dá)無明顯改變；最大非毒性劑量Tet不影響p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平。在CNE1和CNE2細(xì)胞中，聯(lián)合處理可明顯降低放療引起的p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平(P<0.05)，上調(diào)放療后cyclin B1的表達(dá)，而對(duì)總CDK1的表達(dá)無明顯調(diào)節(jié)作用；聯(lián)合處理可顯著抑制放療所致的p-ERK 蛋白水平(P<0.05)。結(jié)論: 最大非毒性劑量Tet可以增加放療引起的CNE1和CNE2細(xì)胞的DNA斷裂及細(xì)胞凋亡，其放療增敏的機(jī)制可能與Tet調(diào)控ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路、去除放療導(dǎo)致的G2/M期阻滯有關(guān)。

漢防己甲素； 鼻咽癌； G2/M期阻滯； ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路 [

鼻咽癌是我國(guó)華南地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，在中國(guó)南方地區(qū)頭頸部惡性腫瘤中占首位，其在中國(guó)南方發(fā)病率已達(dá)(15～40)/10萬(wàn)人次[1]，其中，廣東省男性發(fā)病率達(dá)30/10萬(wàn)人次，女性達(dá)13/10萬(wàn)人次[2]。由于鼻咽的解剖位置隱蔽、解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且病理特征以未分化型非角化性為主，因此放射治療一直是鼻咽癌的重要治療手段。對(duì)于I期和 IIA期的鼻咽癌患者，單純放療后5年總體生存率可達(dá)80%以上[3]。然而由于鼻咽癌早期癥狀不顯著，臨床上初診患者中約有60%已達(dá)局部晚期，約5%～8%的患者已伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。同時(shí)約20%的患者在單純放療后仍出現(xiàn)局部惡化[5]。目前，同步放化療是針對(duì)晚期鼻咽癌患者的主要治療手段，但其在提高5年生存率的同時(shí)，也增加了治療的毒副作用，降低患者的生存質(zhì)量[6]。因此，尋找有效且安全的放療增敏劑對(duì)于鼻咽癌的治療具有非常重要的意義。

漢防己甲素(tetrandrine，Tet)又稱粉防己堿，是從中草藥粉防己的根塊中提取的雙芐基異喹啉類生物堿，分子式為C33H42N2O6。Tet為天然的非選擇性鈣離子通道阻滯劑，具有抗高血壓、抗炎和抗纖維化等作用，目前已在風(fēng)濕痛、關(guān)節(jié)痛、單純硅肺等疾病中應(yīng)用于臨床[7]。在針對(duì)惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和食管癌等疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Tet可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡[8-10]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Tet針對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2的最大非毒性劑量分別為1.5 μmol/L和1.8 μmol/L，并針對(duì)最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞增殖的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)最大非毒性劑量Tet可以增強(qiáng)放療對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞增殖的抑制作用，增加CNE1和CNE2細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[11]。本研究擬探討最大非毒性劑量Tet對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株放療增敏作用的機(jī)制。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)。

1.2主要試劑 Tet購(gòu)自中國(guó)浙江海正藥業(yè)；胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen；胎牛血清購(gòu)自Gibco；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒、細(xì)胞和總蛋白提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京凱基生物科技發(fā)展公司；兔抗人γ-H2AX、caspase-3、cleaved caspase-3、ERK和p-ERK抗體購(gòu)自CST；兔抗人cyclin B1、p-CDK1、p-CDC25C和小鼠抗人CDK1抗體購(gòu)自Abcam；兔抗人GAPDH抗體、山羊抗兔、山羊抗鼠IgG II抗購(gòu)自Proteintec Group；Western blot發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，5% CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2Tet的配制 取0.1775 g Tet溶解于1 mL 1 mol/L的HCl中，加入去離子水至5 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.5，配制成濃度為2 500 μmol/L的溶液，0.22 μm過濾后4 ℃避光保存。使用時(shí)加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至相應(yīng)濃度。

2.3放射線照射 細(xì)胞培養(yǎng)皿常溫下覆蓋1.5 cm硅膠補(bǔ)償膜，采用西門子PRIMUS H型直線加速器的6 MV X線照射細(xì)胞，吸收劑量率為250 cGy/min，照射野為25 cm×25 cm，總照射劑量為4 Gy。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE1和CNE2細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、最大非毒性劑量Tet組、4 Gy放療組和4 Gy放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet(對(duì)CNE1細(xì)胞為1.5 μmol/L，對(duì)CNE2細(xì)胞為1.8 μmol/L)組。以每孔3×105細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后收集細(xì)胞并使用PBS漂洗2次，70%乙醇4 ℃固定過夜。碘化丙啶避光染色30 min，使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)各組細(xì)胞周期分布情況。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE1和CNE2細(xì)胞，以每孔3×105細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞貼壁后分別給予相應(yīng)濃度Tet或4 Gy處理，放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組在放療1 h后加入最大非毒性劑量Tet。處理24 h后收集細(xì)胞，按照總蛋白提取試劑盒說明提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組蛋白30 μg，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%小牛血清白蛋白(BSA)封閉1.5 h， I 抗4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔或山羊抗鼠 II 抗，室溫孵育1.5 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行放射自顯影。使用ImageJ分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

設(shè)3組平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)標(biāo)±準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞中γ-H2AX的影響

Western blot檢測(cè)4 Gy放療后及最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療處理后γ-H2AX表達(dá)情況，在CNE1細(xì)胞中，放療后γ-H2AX表達(dá)增加，放療聯(lián)合1.5 μmol/L Tet處理組中γ-H2AX表達(dá)增加更明顯，2組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A。同樣在CNE2細(xì)胞中，放療組和放療聯(lián)合1.8 μmol/L Tet組γ-H2AX表達(dá)均增加，且放療聯(lián)合Tet組增加幅度更明顯(P<0.05)，見圖1B。這提示最大非毒性劑量Tet可以增強(qiáng)放療引起的γ-H2AX表達(dá)的上調(diào)。

Figure 1. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the protein level of γ-H2AX. A: the expression of γ-H2AX in the CNE1 cells; B: the expression of γ-H2AX in the CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs4Gy group.

圖1不同處理后CNE1和CNE2細(xì)胞γ-H2AX的表達(dá)情況

2最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析CNE1和CNE2細(xì)胞給予放療或最大非毒性劑量Tet后細(xì)胞周期分布的變化情況。CNE1細(xì)胞對(duì)照組和最大非毒性劑量Tet處理組G2/M期所占比例分別為(7.81±0.16)%和(7.32±0.53)%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，放療組G2/M期細(xì)胞所占比例為(18.09±0.42)%，比對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，放療聯(lián)合Tet組G2/M期細(xì)胞比例為(15.88±1.04)%，低于單純放療組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A。

CNE2細(xì)胞對(duì)照組、最大非毒性劑量Tet處理組、放療組和放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組G2/M期所占比例分別為(8.69±0.97)%、(8.57±2.13)%、(18.48±1.97)%和(13.80±2.82)%。對(duì)照組和最大非毒性Tet處理組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，放療組在G2/M期出現(xiàn)明顯的阻滯，比例顯著高于對(duì)照組和Tet組(P<0.05)，而放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組G2/M期細(xì)胞比例比放療組降低(P<0.05)，見圖2B。這提示最大非毒性劑量Tet可以去除放療引起的G2/M期阻滯。

3最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞cleavedcaspase-3表達(dá)的影響

CNE1和CNE2細(xì)胞中caspase-3的激活狀態(tài)(cleaved caspase-3)具有相同的變化趨勢(shì)。對(duì)CNE1細(xì)胞及CNE2細(xì)胞分別給予1.5 μmol/L和1.8 μmol/LTet處理后，cleaved caspase-3的蛋白水平與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；給予放療處理后，CNE1和CNE2細(xì)胞中的cleaved caspase-3蛋白水平增加；而在放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet處理后，cleaved caspase-3的蛋白水平增加更明顯(P<0.05)，見圖3。這提示放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet可以增強(qiáng)放療對(duì)caspase-3的激活作用。

Figure 2. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the cell cycle distribution. A: the distribution of cell cycle in CNE1 cells after different treatments; B: the distribution of cell cycle in CNE1 cells after different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group and Tet group；#P<0.05vs4 Gy group.

圖2不同處理對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

4最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對(duì)CDC25C/CDK1/cyclinB1通路蛋白表達(dá)的影響

對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞給予不同濃度的Tet處理24 h后，Western blot檢測(cè)p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平。在CNE1細(xì)胞中，予0.75 μmol/L和1.5 μmol/L Tet處理組的p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，3.0 μmol/L和6.0 μmol/L Tet處理組的p-CDC25C和p-CDK1蛋白水平與對(duì)照組相比有增加(P<0.05)，CDK1表達(dá)無明顯改變，見圖4A。在CNE2細(xì)胞中，0.9 μmol/L和1.8 μmol/L Tet處理后p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，3.6 μmol/L和7.2 μmol/L Tet處理后p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平與對(duì)照組相比明顯增加(P<0.05)，而各濃度Tet處理后CDK1的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4B。

Figure 3. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the protein levels of cleaved caspase-3 and caspase-3 in CNE1 (A) and CNE2 (B) cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs4Gy group.

圖3不同處理后CNE1和CNE2細(xì)胞中cleavedcaspase-3和caspase-3的表達(dá)

對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞分別給予放療和放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet處理，處理后24 h提取各組蛋白，Western blot檢測(cè)各組p-CDC25C、p-CDK1、CDK1和cyclin B1的蛋白水平。CNE1和CNE2細(xì)胞中各蛋白水平改變的趨勢(shì)相同。放療處理后，p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的蛋白水平明顯增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而cyclin B1的表達(dá)無明顯改變。放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet組中p-CDC25C和p-CDK1的蛋白水平較放療組降低(P<0.05)，cyclin B1的表達(dá)較放療組明顯增加(P<0.05)，而CDK1的表達(dá)與放療組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4C、D。

5最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療對(duì)ERK磷酸化的影響

在CNE1細(xì)胞中，p-ERK的蛋白水平在對(duì)照組和最大非毒性劑量Tet處理組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，放療組的p-ERK蛋白水平顯著增加(P<0.05)，而放療聯(lián)合最大非毒性Tet組的p-ERK蛋白水平較放療組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5A。在CNE2細(xì)胞中，p-ERK蛋白水平的改變具有同樣的趨勢(shì)，見圖5B。

討 論

放療是鼻咽癌治療的重要手段，然而腫瘤組織對(duì)放療的抵抗性會(huì)顯著影響放療的治療效果。目前Tet已被證實(shí)對(duì)食管癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等疾病具有放療增敏的作用，但這些研究使用的Tet劑量仍具有細(xì)胞毒性殺傷作用，聯(lián)合放療會(huì)增加治療的毒副作用。我們前期研究確定了Tet針對(duì)CNE1和CNE2細(xì)胞的最大非毒性劑量，并發(fā)現(xiàn)該劑量可以增加CNE1和CNE2細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，增加放療對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，但增敏機(jī)制尚未明確。

放療殺傷腫瘤細(xì)胞最主要的生物學(xué)效應(yīng)是DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)[12]。H2AX是組蛋白H2A家族成員之一，其C端存在一段由22個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的高度保守同源序列，其中包括139位的絲氨酸殘基，在細(xì)胞發(fā)生DSBs時(shí)被磷酸化，稱為γ-H2AX。由于γ-H2AX與DSBs關(guān)系密切，且沒有細(xì)胞特異性，因此γ-H2AX被認(rèn)為是檢測(cè)DSBs的特異性指標(biāo)[13]。本研究檢測(cè)了單純放療和放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet對(duì)γ-H2AX表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)最大非毒性劑量Tet可以上調(diào)放療引起的γ-H2AX表達(dá)的增加，提示最大非毒性劑量Tet可以促進(jìn)放療引起的DSBs。

DNA損傷后，細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)位點(diǎn)被激活，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，促使細(xì)胞進(jìn)行DNA修復(fù)。若修復(fù)失敗，細(xì)胞攜帶損傷的DNA進(jìn)入DNA復(fù)制過程，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[14]。細(xì)胞周期檢測(cè)位點(diǎn)包括G1/S位點(diǎn)和G2/M位點(diǎn)，若攜帶DNA損傷的細(xì)胞通過了G1/S位點(diǎn)，則G2/M位點(diǎn)成為DNA修復(fù)的最后時(shí)期，因此G2/M期是放療后細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵位點(diǎn)。關(guān)于乳腺癌和結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，去除G2/M期阻滯可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CNE1和CNE2細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞所占比例在放療后明顯增加，而放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet后，CNE1和CNE2細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞比例下降，提示放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet可以降低放療導(dǎo)致的G2/M期阻滯，可能為最大非毒性Tet放療增敏的機(jī)制之一。

Figure 4. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the related protein levels of CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways. A: the related protein levels of CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways in the CNE1 cells after treatment with different doses of Tet; B: the related protein levels of CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways in the CNE2 cells after treatment with different doses of Tet; C: the related protein levels in CNE1 cells after Tet treatment combined with irradiation; D: the related protein levels in CNE2 cells after Tet treatment combined with irradiation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group (0 μmol/L Tet);#P<0.05vs4Gy group.

圖4不同處理后CNE1和CNE2細(xì)胞中CDC25C/CDK1/cyclinB1通路蛋白的表達(dá)情況

細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中具有重要的意義。Caspase家族為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡重要的介導(dǎo)因子與執(zhí)行因子，其中caspase-3處于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是凋亡最重要的執(zhí)行因子之一[17]。正常情況下，caspase-3以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡啟動(dòng)信號(hào)后，caspase-3被上游因子剪切為cleaved caspase-3從而激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡[18]。Caspase-3的活化提示細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[19]。多項(xiàng)研究表明，活化caspase-3可以促進(jìn)多種瘤細(xì)胞的凋亡[20-22]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，放療后CNE1和CNE2細(xì)胞中cleaved caspase-3的水平增加，最大非毒性劑量Tet聯(lián)合放療后，cleaved caspase-3的水平增加更顯著，提示最大非毒性劑量Tet可以增強(qiáng)放療對(duì)caspase-3的活化作用，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到放療增敏的作用。

Figure 5. The effect of the maximum non-cytotoxic doses of Tet combined with irradiation on the protein level of p-ERK. A: the protein levels of p-ERK and ERK in the CNE1 cells; B: the protein levels of p-ERK and ERK in the CNE2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs4Gy group.

圖5不同處理后CNE1和CNE2細(xì)胞中p-ERK和ERK的表達(dá)情況

G2/M期進(jìn)程由CDK1/cyclin B1復(fù)合體進(jìn)行調(diào)節(jié)。CDK1/cyclin B1復(fù)合體的激活需要去磷酸化的CDK1與cyclin B1進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)CDK1的Tyr15位點(diǎn)處于磷酸化狀態(tài)時(shí)，CDK1/cyclin B1復(fù)合體處于非激活狀態(tài)，從而產(chǎn)生G2/M期阻滯[23]。CDC25C可以去除CDK1 Tyr15位點(diǎn)的磷酸化，從而激活CDK1/cyclin B1復(fù)合體，促使G2/M期阻滯的去除。細(xì)胞周期未啟動(dòng)時(shí)，CDC25C處于非活性狀態(tài)，其Ser216位點(diǎn)被磷酸化，在細(xì)胞周期通過G2/M期前，CDC25C Ser216位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化，去磷酸化的CDC25C進(jìn)一步激活CDK1/cyclin B1復(fù)合體，從而使細(xì)胞DNA復(fù)制進(jìn)程通過G2/M期[24]。我們給予CNE1和CNE2不同濃度的Tet處理，發(fā)現(xiàn)濃度小于等于最大非毒性劑量的Tet并不影響p-CDC25C、p-CDK1和CDK1的水平，而濃度大于最大非毒性劑量的Tet會(huì)上調(diào)p-CDC25和p-CDK1的水平，并且上調(diào)幅度隨濃度增加而增加，但不影響CDK1細(xì)胞的表達(dá)。提示我們?cè)谘芯恐惺褂玫淖畲蠓嵌拘詣┝縏et不影響CNE1和CNE2細(xì)胞的G2/M期進(jìn)程，而大劑量的Tet可以抑制CDC25C/CDK1/cyclin B1通路的激活。與單純放療相比較，放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet處理后， CNE1和CNE2細(xì)胞中p-CDK1的蛋白水平降低，而CDK1無明顯改變，cyclin B1表達(dá)增加，提示最大非毒性劑量Tet通過增加去磷酸化狀態(tài)CDK1的比例以及上調(diào)cyclin B1的表達(dá)促使放療后CDK1/cyclin B1復(fù)合體的激活，而放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet后p-CDC25C的蛋白水平降低，提示Tet對(duì)CDK1/cyclin B1復(fù)合體的激活作用可能與Tet促進(jìn)CDC25C去磷酸化有關(guān)。

ERK為MAPK家族的一員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。ERK可以調(diào)節(jié)多種信號(hào)因子的磷酸化作用，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[25]。ERK對(duì)G2/M期進(jìn)程所起的作用仍有爭(zhēng)議。Lee等[26]的研究發(fā)現(xiàn)棕矢車菊素可以促進(jìn)ERK的磷酸化，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞G2/M期阻滯。而在人白血病細(xì)胞中，ERK的抑制劑可以增強(qiáng)PTX-2引起的G2/M期阻滯[27]。在本研究中，與單純放療相比，放療聯(lián)合最大非毒性劑量Tet后，p-ERK的蛋白水平顯著降低，而ERK的表達(dá)無明顯變化，提示最大非毒性劑量Tet抑制了ERK的磷酸化，其去除G2/M期阻滯的機(jī)制可能與其抑制上游負(fù)調(diào)控因子ERK的激活有關(guān)。

綜上所述，最大非毒性劑量Tet可以增加放療引起的CNE1和CNE2細(xì)胞的DNA斷裂，并通過調(diào)控ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1通路，去除放療引起的G2/M期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到其對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞放療增敏的目的。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of tetrandrine on radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cells

WANG Jun, CHANG Li-hong, LI Xia, CHEN Xian-zhen, WU Xi-fu, WANG Zhi-yuan, HUANG Zi-zhen, HUANG Jian-cong, ZHANG Ge-hua

(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630, China. E-mail: gehuazh@hotmail.com)

AIM: To investigate the mechanism of the radiosensitizing effect of maximum non-cytotoxic doses of tetrandrine (Tet) on nasopharyngeal carcinoma cell lines CNE1 and CNE2.METHODS: The cells were treated with ma-ximum non-cytotoxic doses of Tet (for CNE1 cells at 1.5 μmol/L and for CNE2 cells at 1.8 μmol/L), irradiation at 4 Gy, or combination of irradiation and maximum non-cytotoxic doses of Tet. The cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry. The protein levels of γ-H2AX, cleaved caspase-3, p-CDC25C, CDK1, p-CDK1， cyclin B1, ERK and p-ERK were determined by Western blot.RESULTS: The expression of γ-H2AX was increased in CNE1 cells and CNE2 cells after combined treatment with irradiation and maximum non-cytotoxic doses of Tet. The percentages of CNE1 cells and CNE2 cells at G2/M phase in irradiation group were (18.09±0.42)% and (18.48±1.32)%, respectively, which were decreased to (15.88±1.04)% and (13.80±0.82)% in combined treatment group, respectively (P<0.05). Combined treatment enhanced the increase in the protein level of cleaved caspase-3 caused by irradiation. The protein levels of p-CDC25C and p-CDK1 were increased in a dose-dependent manner by Tet treatment (P<0.05), while the expression of CDK1 showed no difference among different doses of Tet treatments. The protein levels of p-CDC25C, p-CDK1 and CDK1 showed no difference after the treatment with maximum non-cytotoxic doses of Tet. The combined treatment with irradiation and the maximum non-cytotoxic doses of Tet decreased the protein levels of p-CDC25C and p-CDK1 (P<0.05), increased the expression of cyclin B1, and had no influence on the expression of CDK1 (P<0.05). The combined treatment resulted in an increase in the protein level of p-ERK1 (P<0.05).CONCLUSION: The maximum non-cytotoxic doses of Tet enhance the DNA damage and apoptosis in CNE1 cells and CNE2 cells caused by irradiation, and the mechanism might be associated with ending of G2/M arrest via activation of ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways.

Tetrandrine; Nasopharyngeal carcinoma; G2/M phase arrest; ERK/CDC25C/CDK1/cyclin B1 pathways

1000- 4718(2017)09- 1611- 08

2017- 01- 26 [

] 2017- 06- 18

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313142)； 廣州市科技計(jì)劃對(duì)外科技合作專項(xiàng)(No. 2013J4500013)；廣州市天河區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目醫(yī)療衛(wèi)生專項(xiàng)(No. 2013KW027)

] R762； R965； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.013

△通訊作者 Tel： 020-85253045； E-mail： gehuazh@hotmail.com