廖 雁， 喬 圓， 南 方， 郭寶璐， 梁月琴， 范彥英

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室，山西 太原 030001)

氯沙坦通過激活AMPK抑制LPS誘導的小鼠海馬GFAP表達*

廖 雁， 喬 圓， 南 方， 郭寶璐， 梁月琴， 范彥英△

(山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理教研室，山西 太原 030001)

目的： 探討氯沙坦對脂多糖(LPS)誘導的星形膠質細胞活化標志物膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達的影響，以及其機制是否與激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有關。方法: 將成年雄性昆明小鼠分為正常對照組、LPS模型組、氯沙坦給藥組及氯沙坦與compound C合用組。側腦室注射相同劑量LPS (24 μg/d，每天1次，共2次)，以建立中樞神經(jīng)炎癥損傷模型；氯沙坦(0.5、1 或5 mg·kg-1·d-1)于LPS注射前14 d開始連續(xù)每日腹腔注射給藥；AMPK抑制劑Compound C (10 mg·kg-1·d-1)于LPS注射前2 d開始連續(xù)每日腹腔注射給藥。在LPS末次注射后的第3天取各組小鼠的海馬腦區(qū)組織，利用Western blot法檢測GFAP、AMPK、p-AMPK、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR的蛋白水平。結果: 2次LPS注射后可顯著誘導GFAP在海馬腦區(qū)的表達(P<0.01)，而氯沙坦可濃度依賴地抑制LPS誘導的GFAP表達，當氯沙坦劑量為5 mg·kg-1·d-1時可顯著抑制GFAP表達(P<0.05)，同時，在該劑量下，氯沙坦顯著提高了AMPK的磷酸化水平(P<0.01)，但對mTOR的磷酸化水平無明顯調節(jié)作用；而AMPK抑制劑Compound C可顯著逆轉氯沙坦對GFAP表達及AMPK磷酸化的調節(jié)作用(P<0.05)。結論: 氯沙坦可抑制LPS誘導的海馬GFAP表達，該作用可能與其激活AMPK有關，但并不依賴于mTOR信號通路。

氯沙坦； 脂多糖； 膠質纖維酸性蛋白； 腺苷酸活化蛋白激酶

星形膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，可誘導神經(jīng)元突觸的形成，并參與對突觸功能、神經(jīng)元能量供應及神經(jīng)遞質釋放的調控過程[1-3]，在保持血腦屏障完整和調節(jié)腦血流量中發(fā)揮重要作用[4]。在感染、創(chuàng)傷、神經(jīng)退行性疾病等病理條件下，星形膠質細胞被激活，表現(xiàn)為星形膠質細胞胞體肥大，突起增粗、延長，細胞數(shù)目增多，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達增加[5-7]。盡管活化的星形膠質細胞可通過提高谷氨酸攝取、增加糖原儲存、清除自由基、釋放營養(yǎng)因子等途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]，但是過度激活的星形膠質細胞往往會產(chǎn)生大量的炎癥因子而損傷神經(jīng)元及抑制軸突的再生和重建[9]。因此，抑制星形膠質細胞過度激活對防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病有重要意義。

血管緊張素II受體阻滯劑(angiotensin II receptor blockers，ARBs)，也稱為AT1受體拮抗劑，是一類常用的抗高血壓藥物。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ARBs對許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦中風、腦外傷、阿爾茲海默病和帕金森病等都具有一定的保護作用[10-12]。最近，Ongali等[13]發(fā)現(xiàn)在APP轉基因阿爾茨海默病老年小鼠模型上，連續(xù)3個月每日給予ARBs類藥物氯沙坦(10 mg·kg-1·d-1)可明顯抑制星形膠質細胞活化標志物GFAP的表達。但是，ARBs類藥物短期給藥對星形膠質細胞活化的調節(jié)作用及機制尚不清楚。

腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。它是生物能量代謝調節(jié)的關鍵分子，也被稱為“細胞能量調節(jié)器”，可表達于神經(jīng)元和星形膠質細胞中[14]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK信號通路在神經(jīng)元增殖、遷移和突觸傳遞等方面具有重要的作用[15-16]。Maixner等[17]發(fā)現(xiàn)，利用siRNA干擾AMPK表達或條件性敲除星形膠質細胞AMPK基因，可見脊髓損傷區(qū)域GFAP表達增加，提示AMPK對GFAP的表達具有調節(jié)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，ARBs類藥物能誘導下丘腦及大腦皮層AMPK的活化[18-19]。然而，ARBs是否通過激活AMPK及其下游哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)來抑制星形膠質細胞的活化尚不清楚。

本研究擬在腦室注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立的中樞神經(jīng)炎癥損傷模型上，觀察ARBs類藥物氯沙坦對星形膠質細胞活化標志物GFAP表達的影響，并探討其機制是否與激活AMPK及其下游通路有關。

材料和方法

1動物

健康昆明雄性小鼠，8～10周齡，體重(30±2)g，購自山西醫(yī)科大學動物實驗中心。所有的動物實驗均遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南，動物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境(22±1)oC下，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

2實驗方法

2.1小鼠LPS中樞神經(jīng)炎癥模型的制備 將小鼠放于玻璃盒內后通予2.5%異氟烷進行全身誘導麻醉，麻醉后將小鼠固定于手術臺上并持續(xù)通予1.5%異氟烷來維持小鼠的麻醉狀態(tài)，側腦室注射24 μg LPS (6 μL)1次或相同劑量注射2次(每天1次)以建立中樞神經(jīng)炎癥損傷模型，對照組則注射相同體積的生理鹽水。

2.2分組和給藥方法將動物分為正常對照(control)組、LPS模型組、氯沙坦給藥組及氯沙坦與Compound C合用給藥組。連續(xù)2 d側腦室注射LPS (24 μg/d)以建立中樞神經(jīng)炎癥損傷模型；氯沙坦(0.5、1 或5 mg·kg-1·d-1)于LPS注射前14 d開始連續(xù)每日腹腔注射給藥，在LPS刺激當日，氯沙坦于LPS注射前1 h給予；AMPK抑制劑Compound C (10 mg·kg-1·d-1)于LPS注射前2 d開始連續(xù)每日腹腔注射給藥，并于氯沙坦給藥前30 min給予。實驗中氯沙坦和Compound C均給藥至取材當日。在末次LPS注射后第3天，對各組小鼠取海馬腦區(qū)組織，液氮速凍，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3蛋白的提取和Westernblot檢測在海馬組織中加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，提取總蛋白，并采用BCA 法進行蛋白定量。用12% SDS-PAGE 分離蛋白并轉印至硝酸纖維素膜用5% BSA 室溫封閉90 min，加入抗GFAP (1∶250；博士德)、p-AMPK (1∶1 000；CST)、AMPK (1∶1 000；CST)、p-mTOR (1∶1 000；Abcam)、mTOR (1∶1 000；Abcam)和GAPDH (1∶10 000；Bioworld)抗體4 ℃孵育過夜。次日，反復洗膜后加入IgG-HRP 抗體(1∶3 000；博士德)室溫輕搖孵育1 h，并用ECL 化學發(fā)光法檢測，結果用AlphaView SA 軟件分析并以GAPDH為內參照統(tǒng)計GFAP蛋白表達水平，以p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR比值反映AMPK和mTOR的磷酸化水平。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。單因素方差分析結合Bonferroni post-hoc test進行3組以上數(shù)據(jù)間差異的分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1LPS誘導小鼠海馬GFAP表達

與對照組相比，LPS (24 μg/d)注射2 次能顯著誘導(LPS末次注射后第3天)海馬組織表達GFAP(P<0.01)，而LPS注射 1次誘導GFAP表達不明顯，見圖1。因此后續(xù)實驗均采用2次注射LPS的方法制備中樞神經(jīng)炎癥損傷模型。

2氯沙坦對小鼠海馬GFAP表達的調節(jié)作用

氯沙坦于LPS注射前14 d開始連續(xù)每日給藥可濃度依賴性地下調LPS誘導的GFAP表達，其中在0.5 mg·kg-1·d-1和1 mg·kg-1·d-1劑量下，氯沙坦有下調LPS誘導的GFAP表達的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，而5 mg·kg-1·d-1的氯沙坦處理可顯著抑制LPS誘導的GFAP表達(P<0.05)，見圖2A。

Figure 1. LPS induced GFAP protein expression in the mouse hippocampus. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖1LPS誘導小鼠海馬GFAP表達

3AMPK在氯沙坦調節(jié)LPS誘導的GFAP表達中的作用

LPS末次注射后第3天，海馬AMPK磷酸化水平與對照組相比并沒有明顯改變，然而，氯沙坦于LPS注射前14 d開始連續(xù)每日給藥可濃度依賴性地上調p-AMPK的蛋白水平，而氯沙坦給藥劑量為5 mg·kg-1·d-1時，p-AMPK的蛋白水平顯著增加(P<0.01)，見圖2B。

Figure 2. The effects of losartan on GFAP protein expression (A) and AMPK phosphorylation (B) in the mouse hippocampus. Mean±SEM.n=6.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖2氯沙坦對小鼠海馬GFAP表達及AMPK磷酸化水平的調節(jié)作用

給予AMPK的選擇性抑制劑Compound C可顯著逆轉5 mg·kg-1·d-1的氯沙坦對LPS誘導的 GFAP表達的下調作用(P<0.05)，見圖3A。與此同時，Compound C也明顯抑制了5 mg·kg-1·d-1氯沙坦誘導的AMPK磷酸化(P<0.01)，見圖3B。

4氯沙坦預處理對小鼠海馬mTOR磷酸化水平的調節(jié)作用

mTOR是AMPK的下游靶點之一，因此我們進一步檢測了氯沙坦于LPS注射前14 d開始連續(xù)每日給藥對mTOR磷酸化水平的影響。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS和氯沙坦處理(5 mg/kg)對mTOR磷酸化無明顯調節(jié)作用，見圖4。

Figure 3. The effects of losartan treatment and Compound C (CC) on GFAP expression (A) and AMPK phosphorylation (B) in the mouse hippocampus. Mean±SEM.n=6～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsLPS group;△P<0.05,△△P<0.01vslosartan group.

圖3氯沙坦處理和CompoundC對小鼠海馬GFAP蛋白表達及AMPK磷酸化的調節(jié)作用

Figure 4. The effects of losartan treatment on mTOR phosphory-lation in the mouse hippocampus. Mean±SEM.n=6.

圖4氯沙坦處理對小鼠海馬mTOR磷酸化水平的調節(jié)作用

討 論

LPS是一種經(jīng)典的神經(jīng)炎癥誘導劑，可以誘導腦內星形膠質細胞的活化[20]。在本實驗中，為了排除外周炎癥的影響，將炎癥反應局限在腦內，我們采用了腦室注射LPS的方法。結果發(fā)現(xiàn)LPS (24 μg/d)連續(xù)注射2 次能顯著增加海馬腦區(qū) GFAP的表達。在此基礎上，我們的研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)數(shù)日的氯沙坦處理能顯著抑制LPS誘導的GFAP表達。

已有研究發(fā)現(xiàn)，在APP轉基因阿爾茨海默病模型小鼠上，連續(xù)3個月給予氯沙坦(10 mg·kg-1·d-1)可顯著抑制星形膠質細胞的反應性增生，改善APP小鼠的空間參考記憶[13]。而本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導的神經(jīng)炎癥模型上，氯沙坦于LPS注射前短期預防性給藥14 d并在LPS刺激后再連續(xù)每日給藥5 d，可濃度依賴地抑制海馬組織GFAP的表達，提示連續(xù)多日的氯沙坦給藥可抑制LPS誘導的星形膠質細胞的激活。

進一步，本研究發(fā)現(xiàn)，氯沙坦于LPS注射前短期預防性給藥14 d并在LPS刺激后再連續(xù)每日給藥5 d可濃度依賴性地提高 LPS注射后第3天時海馬AMPK磷酸化水平，而AMPK的選擇性抑制劑Compound C可逆轉氯沙坦對GFAP表達的下調作用。相似地，最近的研究發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾AMPK表達或條件性敲除星形膠質細胞AMPK基因可顯著增加脊髓GFAP的表達[17]。因此，促進AMPK的激活可能是氯沙坦抑制星形膠質細胞活化的重要機制之一。但是，氯沙坦是否通過直接激活星形膠質細胞內的AMPK來抑制GFAP的表達仍有待研究。

mTOR是AMPK所調節(jié)的下游信號靶點之一，其活性可被活化的AMPK所抑制[21]。最近Li等[22]在離體培養(yǎng)的星形膠質細胞缺糖缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR通路可減少星形膠質細胞的活化。然而，令人意外的是，盡管氯沙坦可激活AMPK，但對AMPK下游的mTOR活化并沒有顯著的調節(jié)作用。因此，氯沙坦抑制GFAP表達的機制并不依賴于mTOR信號通路。

綜上所述，氯沙坦可抑制LPS誘導的小鼠海馬GFAP表達，而這一作用與激活AMPK有關，但并不依賴于AMPK下游的mTOR信號通路。另外，已有研究證實氯沙坦等ARBs類藥物可以增強星形膠質細胞對神經(jīng)元的保護功能，如促進谷氨酸攝取等[23]，加之該類藥物對神經(jīng)元尚有直接保護作用，因此氯沙坦作為臨床上常用的抗高血壓藥物，長期應用對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防和治療可能具有重要意義。然而，氯沙坦通過激活APMK抑制星形膠質細胞活化的下游分子機制有待進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Losartan inhibits LPS-induced GFAP expression via AMPK activation in mouse hippocampus

LIAO Yan, QIAO Yuan, NAN Fang, GUO Bao-lu, LIANG Yue-qin, FAN Yan-ying

(Department of Pharmacology, School of Basic Medical Sciences， Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China. E-mail: fyanying6@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of losartan on lipopolysaccharide (LPS)-induced glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression, and to determine whether adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase (AMPK) activation is involved in the mechanism.METHODS: Adult male KM mice were divided into control group, LPS model group, losartan treatment group， and losartan and Compound C co-treatment group. To establish a model of central nervous system inflammation, the mice

daily intracerebroventricular injection of LPS (24 μg/d) for 2 d. Daily losartan administration (0.5, 1 or 5 mg·kg-1·d-1, ip) initiated at 14 d prior to LPS injection. Compound C (10 mg/kg, ip), a selective AMPK inhibitor, started to be injected daily at 2 d prior to LPS injection. The hippocampal tissues in each group were isolated at 3 d after the last LPS injection, and then the protein levels of GFAP, AMPK, p-AMPK, mammalian target of rapamycin (mTOR) and p-mTOR were determined by Western blot.RESULTS: Twice LPS injections significantly increased the expression of GFAP in the hippocampus (P<0.01). Losartan inhibited LPS-induced GFAP expression in a concentration-dependent way, and losartan at 5 mg·kg-1·d-1significantly inhibited GFAP expression and AMPK activation (P<0.05), but it had no obvious effect on mTOR activation. Furthermore, Compound C significantly reversed the effect of losartan treatment on LPS-induced GFAP expression and AMPK phosphorylation (P<0.05).CONCLUSION: Losartan inhibits LPS-induced GFAP expression in the mouse hippocampus, and AMPK activation but not mTOR, is involved in the mechanism.

Losartan; Lipopolysaccharide; Glial fibrillary acidic protein; Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase

1000- 4718(2017)09- 1593- 05

2016- 12- 19 [

] 2017- 04- 13

國家自然科學基金資助項目(No. 81202520)；山西省青年科技研究基金資助項目(No.2014021038-1)；山西省重點學科建設經(jīng)費資助項目。

R363.2+1； R741

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.09.009

△通訊作者Tel: 0351-4135079; E-mail: fyanying6@hotmail.com