邊麗華，鄒琳，周冰謙，劉偉，周潔，3*，王曉

(1.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；3.濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012)

·中藥農(nóng)業(yè)·

稀土元素鑭與丹參毛狀根中活性成分及其生物合成中關(guān)鍵酶的量效關(guān)系△

邊麗華1，2，鄒琳1，周冰謙1，劉偉1，周潔1，3*，王曉1

(1.山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；3.濟(jì)南大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012)

目的：研究稀土元素鑭與丹參毛狀根中活性物質(zhì)及其生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的量效關(guān)系，結(jié)合Hormesis效應(yīng)理論探討鑭調(diào)控丹參次生代謝產(chǎn)物的閾值，以期為丹參中次生代謝產(chǎn)物調(diào)控及鑭肥的開發(fā)提供依據(jù)。方法：采用HPLC法測定丹參毛狀根活性成分含量，采用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用PCR熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果：鑭處理對丹參活性成分積累及關(guān)鍵酶基因表達(dá)量影響顯著，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制的“拋物線”趨勢；AACT、C4H、4CL、TAT和HPPR五個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量同樣表現(xiàn)出低促高抑的“拋物線”趨勢，該趨勢符合Hormesis理論曲線。結(jié)論：根據(jù)Hormesis理論分析，鑭對丹參的促進(jìn)濃度閾值上限在0.1～1.0 mmol·L-1之間。

丹參；鑭；量效關(guān)系；Hormesis效應(yīng)

土壤因子是影響中藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素[1]，稀土是重要的土壤因子之一，由原子序數(shù)為57-71的鑭系元素以及與之性質(zhì)極為相似的鈧、釔共17種元素組成，適宜濃度的稀土處理會(huì)對植物產(chǎn)生積極的生理學(xué)效應(yīng)[2]。中國是世界上稀土最豐富的國家，將稀土農(nóng)用居于世界先進(jìn)水平[3]，而稀土在中藥農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用尚未得到深入探討。丹參源于唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根和根莖[4]，為我國常用大宗藥材，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛等功效，是臨床上治療心腦血管疾病的要藥之一[5]。山東是丹參的道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)，山東丹參道地產(chǎn)區(qū)土壤中稀土元素鑭含量較高，達(dá)到27 mg·kg-1[6]，丹參中鑭含量超過2 mg·kg-1[7]，推測鑭是影響丹參中活性成分積累的重要因子，有望將稀土引入丹參藥材生產(chǎn)中活性成分的調(diào)控。本文以丹參毛狀根作為材料，研究不同濃度鑭處理后丹參中活性成分積累及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的變化，探討鑭與丹參活性成分及其生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)之間的量效關(guān)系，以期為丹參活性成分的調(diào)控及鑭肥的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參毛狀根由發(fā)根農(nóng)桿菌菌株Agrobacteriumrhizogenes15834處理丹參葉片獲得，將經(jīng)PCR鑒定的陽性株系置于6～7V液體培養(yǎng)基[8]中培養(yǎng)。精確稱取0.5 g毛狀根接種于50 mL培養(yǎng)基，25 ℃，110～120 r·min-1搖床上避光培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理 毛狀根繼代培養(yǎng)18 d后，在無菌條件下添加LaCl3，使其終濃度達(dá)到0、0.01、0.1、1.0 mmol·L-1，等量滅菌水作為對照，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，于處理后15 d取樣，取樣時(shí)將毛狀根取出后迅速吸干水分，每個(gè)取樣點(diǎn)所取樣品分為兩份，一份樣品用液氮迅速冷凍，置-70℃超低溫冰箱保存，用于基因表達(dá)分析；另一份樣品迅速超低溫冷凍干燥，用于丹參活性物質(zhì)含量測定。

1.2.2 毛狀根中活性成分含量測定 將丹參毛狀根干燥后研磨過篩，用70%乙醇提取，采用HPLC法同時(shí)測定丹參毛狀根中的迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量[9-12]。以乙腈(A)-0.2%乙酸水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫：0～25 min，5%～35% A；25～26 min，35%～100% A。酚酸類成分檢測波長為270 nm，丹參酮類成分檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃。

1.2.3 毛狀根中活性成分生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析

1.2.3.1 毛狀根總RNA提取 采用TIANGEN RNA prep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度和完整性，采用核酸蛋白分析儀(TY10 Biospec-nano ZX21)檢測RNA濃度。

1.2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TaKaRa試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用瓊脂糖凝膠法檢測cDNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR檢測，引物序列如表1所示。利用Pfaffi法計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。計(jì)算公式為基因表達(dá)量=C(A-E)/D(F-B)，C為目的基因擴(kuò)增效率；D為內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率；A是對照樣品中目的基因的Ct 值；E是待測樣品中目的基因的Ct值；F是對照樣品重內(nèi)參基因的Ct值；B是待測樣品中內(nèi)參基因的Ct值。

表1 基因引物及其序列

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與檢測結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳點(diǎn)樣孔無亮斑說明RNA無蛋白質(zhì)污染，電泳呈現(xiàn)3條清晰條帶，其中28S和18S條帶亮度比值接近2，說明RNA完整無降解，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA的要求。核酸蛋白分析檢測結(jié)果顯示O260/230、O260/280讀數(shù)均在1.8～2.1之間，RNA濃度均在200 ng·μL-1以上，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。cDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且為單一條帶說明PCR產(chǎn)物特異性好，無明顯引物二聚體，符合Real Time實(shí)驗(yàn)要求。引物的特異性良好，各引物擴(kuò)增效率均在適宜范圍之內(nèi)，符合Real Time PCR實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中活性成分積累的影響

2.2.1 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響 如圖1所示，不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響大致表現(xiàn)為“拋物線”型和“凹線”型。二氫丹參酮和隱丹參酮含量表現(xiàn)出“凹線”型變化趨勢，0.01 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1的LaCl3處理后二氫丹參酮含量較對照分別升高26.18%(P<0.05)、31.52%(P<0.05)和111.07%(P<0.05)，隱丹參酮含量相對于對照分別升高25.03%(P<0.05)、26.40%(P<0.05)和372.30%(P<0.05)。隨著LaCl3濃度的增加，二氫丹參酮和隱丹參酮積累量不斷增加。不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量表現(xiàn)為“拋物線”型影響，0.01、0.1和1.0 mmol·L-1的LaCl3處理后，丹參酮Ⅰ含量分別為對照的124.84%(P<0.05)、93.69%(P<0.05)和79.16%(P<0.05)，丹參酮ⅡA含量分別為對照的200.63%、167.67%和124.37%(P>0.05)。

圖1 LaCl3處理對丹參酮類成分的影響

2.2.2 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中酚酸類成分積累的影響 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中酚酸類成分積累的影響如圖2所示。低濃度LaCl3對迷迭香酸和丹酚酸B的積累起促進(jìn)作用，而高濃度處理抑制其含量的增加。LaCl3處理后迷迭香酸含量分別為對照的128.95%(0.01 mmol·L-1，P<0.05)、98.15%(0.1 mmol·L-1，P<0.05)和66.01%(1.0 mmol·L-1，P<0.05)；LaCl3處理后丹酚酸B含量分別為對照的148.04%(0.01 mmol·L-1，P<0.05)、123.75%(0.1 mmol·L-1，P<0.05)和82.75%(1.0 mmol·L-1，P<0.05)。

2.3 不同濃度LaCl3處理對丹參毛狀根中活性成分生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

2.3.1 不同濃度LaCl3處理對丹參酮類生物合成中關(guān)鍵酶基因的影響 由圖3可見，0.01 mmol·L-1LaCl3處理后AACT基因表達(dá)量顯著升高，約為對照的3倍；0.1 mmol·L-1LaCl3處理亦使AACT表達(dá)量高于對照，但相對于0.01 mmol·L-1LaCl3處理組有所下降；1.0 mmol·L-1LaCl3處理同樣提高AACT表達(dá)量，但相對于低、中濃度處理組表達(dá)量降低?？梢?，不同濃度LaCl3處理對AACT基因的表達(dá)表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)，而隨著處理濃度的升高，促進(jìn)作用逐漸減弱的“拋物線”趨勢。不同濃度LaCl3處理對FPPS表達(dá)量均起到促進(jìn)作用，但處理濃度和促進(jìn)作用之間未表現(xiàn)明顯規(guī)律。0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1的LaCl3處理對GPPS基因的表達(dá)表現(xiàn)出抑制作用，1 mmol·L-1LaCl3處理對GPPS表達(dá)量表現(xiàn)出促進(jìn)作用。

圖2 LaCl3處理對酚酸類成分的影響

圖3 LaCl3處理對丹參酮類成分代謝途徑中關(guān)鍵酶的影響

2.3.2 不同濃度LaCl3處理對酚酸類生物合成中關(guān)鍵酶基因的影響 由圖4可見，LaCl3處理后PAL表達(dá)量受到抑制，不同濃度處理之間未見顯著性差異。C4H、4CL、TAT和HPPR四個(gè)關(guān)鍵酶基因在不同濃度LaCl3誘導(dǎo)下，基因表達(dá)量均出現(xiàn)先升高，到達(dá)峰值后降低的趨勢。其中C4H和4CL基因表達(dá)量最高點(diǎn)均出現(xiàn)在0.1 mmol·L-1，而TAT和HPPR基因表達(dá)量最高點(diǎn)均出現(xiàn)在0.01 mmol·L-1。除PAL外，C4H、4CL、TAT和HPPR四個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量均呈現(xiàn)“拋物線”樣趨勢，拋物線頂點(diǎn)出現(xiàn)的濃度在0.01 mmol·L-1或0.1 mmol·L-1。

圖4 LaCl3處理對酚酸類成分代謝途徑中關(guān)鍵酶的影響

3 討論

丹參酮類和酚酸類成分被認(rèn)為是丹參主要的活性成分，本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度鑭處理后丹參酮類和酚酸類的積累及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化。鑭處理對丹參次生代謝產(chǎn)物積累影響顯著，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B均表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制的“拋物線”趨勢，“拋物線”型次生代謝產(chǎn)物積累峰值均出現(xiàn)在0.01 mmol·L-1和1.0 mmol·L-1處理濃度。鑭處理對關(guān)鍵酶基因表達(dá)量表現(xiàn)出類似的“低促高抑”的效應(yīng)，AACT、C4H、4CL、TAT和HPPR五個(gè)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量與處理濃度之間的量效關(guān)系也表現(xiàn)出“拋物線”趨勢。這種趨勢與目前國際研究的熱點(diǎn)問題“Hormesis效應(yīng)”相似，“Hormesis”效應(yīng)即“毒物興奮效應(yīng)”，是指當(dāng)生物體受到刺激，在最初的抑制反應(yīng)過后會(huì)出現(xiàn)一個(gè)補(bǔ)償反應(yīng)，補(bǔ)償反應(yīng)最終會(huì)超過控制行為而出現(xiàn)凈刺激效應(yīng)。目前比較公認(rèn)的Hormesis量效曲線有兩種形式—β型曲線和U型曲線，β型曲線表現(xiàn)為小劑量刺激大劑量抑制，U型曲線即存在一個(gè)最小效應(yīng)濃度，高于或低于該效應(yīng)濃度時(shí)均表現(xiàn)出效應(yīng)增強(qiáng)。本研究中鑭處理對丹參活性成分及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)處理效應(yīng)整體符合β型曲線特征(見圖5)。根據(jù)Hormesis理論，在一定的濃度閾值內(nèi)，外源刺激對植物體的生命力表現(xiàn)出促進(jìn)作用，超出這個(gè)濃度閾值后外源刺激對植物體生命力產(chǎn)生抑制甚至造成死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對次生代謝產(chǎn)物和關(guān)鍵酶基因的抑制作用多出現(xiàn)在鑭濃度為0.1～1.0 mmol·L-1時(shí)，可見鑭對丹參活性成分和關(guān)鍵酶基因表達(dá)的促進(jìn)濃度閾值上限在0.1～1.0 mmol·L-1之間，具體閾值范圍仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

圖5 Hormesis量效曲線

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Dose-effectRelationshipBetweenLaandActiveConstituentandKeyEnzymesExpressionofSalviamiltiorrhizaHairyRoot

BianLihua1，2，ZouLin1，ZhouBingqian1，LiuWei1，ZhouJie1，3，WangXiao1

(1.KeyLaboratoryofTCMQualityControlTechnology，ShandongAnalysisandTestCenter，Jinan250014，China；2.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355,China;3.UniversityofJinan,Jinan250000,China)

Objective：The effect of La on the accumulation of active constituent and key enzymes expression ofSalviamiltiorrhizahairy root were studied and furthermore signaling molecules mediating the synthesis of secondary metabolism was also definited in order to provide references for the reveal of synthesis mechanism of active constituent ofSalviamiltiorrhizahairy root inducing by La.Methods:The content of active constituents were detected by HPLC. RNA was extracted with RNA prep Pure RNA purification kit(TIANGEN).Results: The dose-effect relationship between La and active constituent and key enzymes expression ofSalviamiltiorrhizahairy root showed a parabolic trend. The trend was in line with Hormesis effect curve.Conclusion: According to the Hormesis theory, the concentration upper threshold of La to promoteSalviagrowth is between 0.1～1.0 mmol·L-1.

Salviamiltiorrhiza；La；dose-effect relationship；hormesis effect

2016-07-21)

國家自然科學(xué)基金(81303161，81673527)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2013HQ037)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2015GSF119021，2015GSF119026)；名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)項(xiàng)目(2060302-1601-19)

*

周潔，副教授，研究方向：中藥資源與藥用植物次生代謝調(diào)控研究；E-mail：zhoujie8761@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.016