裴高升，王萌，張慧杰，孫立麗，任曉亮，鄧雁如，戚愛棣

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，天津 300193)

·中藥基礎(chǔ)·

葛根素在水溶液中的降解動力學(xué)研究△

裴高升1，王萌2，張慧杰1，孫立麗1，任曉亮1，鄧雁如1，戚愛棣1

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥研究院，天津 300193)

目的：研究葛根素水溶液在不同的pH、溫度、離子強度、初始濃度條件下降解反應(yīng)的動力學(xué)特征。方法：采用高效液相色譜法考察不同條件下葛根素含量隨時間的變化，利用化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)的方法計算葛根素在不同環(huán)境下的降解反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)，預(yù)測其半衰期(t1/2)和活化能。結(jié)果：葛根素在不同環(huán)境條件下的降解反應(yīng)均遵循一級動力學(xué)規(guī)律，在中性pH環(huán)境中最為穩(wěn)定，堿性條件下較容易降解，離子強度和初始濃度對其降解影響不大。結(jié)論：葛根素在水溶液中較為穩(wěn)定，僅在強酸和強堿環(huán)境下發(fā)生降解，呈現(xiàn)pH和溫度依賴性，提示葛根素的保存適宜在低溫中性條件下，避免極端的pH和高溫條件。

葛根素；水溶液；降解動力學(xué)

葛根素(Puerarin)是從豆科植物野葛Perarialobata、甘葛藤PuerariathomsoniiBenth根中提取的一種黃酮苷，屬于異黃酮類，其化學(xué)式名8-β-D-吡喃葡萄糖基-4′，7-二羥基異黃酮。作為中藥葛根中的指標(biāo)性成分，研究表明，葛根素具有廣泛的藥理活性：如治療心腦血管系統(tǒng)疾病[1-3]、鎮(zhèn)痛[4]、治療糖尿病及相關(guān)眼底疾病[5-6]、突發(fā)性耳聾[7]、骨質(zhì)疏松[8]及抗腫瘤[9]等，含有葛根的制劑包括注射劑、滴眼劑、片劑等多種劑型[10]，在臨床上已被廣泛應(yīng)用。由于葛根素為黃酮苷類化合物，其在水溶液中可能發(fā)生氧化、水解等多種降解反應(yīng)[11-12]，本實驗依照《人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會》(ICH)指導(dǎo)原則，采用化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)方法研究了葛根素水溶液在不同pH、溫度、離子強度及初始濃度等條件下的降解規(guī)律，以期為含有葛根素的藥物的制劑研究、貯藏條件及合理應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試劑和藥品

葛根素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-200912)；甲醇(色譜純，SPECTRO，美國TEDIA)；純水(由Milli-Q純水器制備)；氫氧化鈉(NaOH，分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)；鹽酸(HCl，分析純，天津化學(xué)試劑一廠)。

1.2 儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)(600E HPLC pump，2487 Dualλ Absorbance Detecter，Empower色譜工作站)；AX205分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；恒溫水浴(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC檢測條件

色譜柱：Agilent C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：水-甲醇(72∶28，V/V)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：250 nm；溫度：25 ℃。

在該色譜條件下，葛根素可在10 min內(nèi)完成檢測(保留時間7.8 min)，降解產(chǎn)物不會干擾測定(見圖1)。

配制系列濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg·mL-1的葛根素對照品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.1274×104X-1 288.3，r=0.999 8，結(jié)果表明分析方法在葛根素濃度0.1～5.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。取質(zhì)量濃度為1.0 μg·mL-1的對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得葛根素峰面積的RSD=0.8%，結(jié)果表明此法精密度良好。

注：1.葛根素。圖1 葛根素HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取葛根素對照品2.70 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制得到質(zhì)量濃度為0.270 mg·mL-1的葛根素儲備液。

吸取上述葛根素儲備液100 μL，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，配制得到質(zhì)量濃度為2.70 μg·mL-1的葛根素對照品溶液。

2.3 葛根素穩(wěn)定性研究

2.3.1 pH值對穩(wěn)定性的影響 為了考察pH值對葛根素穩(wěn)定性的影響，采用HPLC測定了一段時間內(nèi)葛根素在不同pH值水溶液中的含量變化，得到不同pH值下葛根素的降解動力學(xué)曲線并計算降解速率常數(shù)k。

2.3.1.1 樣品溶液的制備 pH 2～6水溶液：分別向100 mL純水中加入適量HCl，由精密pH計測定pH值，配制成pH 2～6水溶液。

pH 7水溶液：為純水，由精密pH計測定pH值為7。

pH 8～12水溶液：分別向100 mL純水中加入適量NaOH，由精密pH計測定pH值，配制成pH 8～12水溶液。

精密吸取葛根素儲備液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，用已配制好的不同pH值的水溶液定容至刻度，搖勻即得，該樣品溶液中葛根素的起始質(zhì)量濃度為2.70 μg·mL-1。

2.3.1.2 樣品的測定與結(jié)果 為了排除光照的影響，所有樣品均置于棕色容量瓶中，由于葛根素在常溫下降解較為緩慢，故所有樣品均放入80 ℃水浴中。每隔一定時間，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定葛根素峰面積，計算樣品中葛根素的含量。

以葛根素即時質(zhì)量濃度與初始質(zhì)量濃度比的對數(shù)ln(Ct/C0)為縱坐標(biāo)，水解時間為橫坐標(biāo)作圖，得到在不同pH值條件下葛根素的降解動力學(xué)曲線(見圖2)。線性回歸得到在不同pH值條件下葛根素的降解速率常數(shù)及其他動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果表明葛根素在不同pH值水溶液中的降解過程符合一級動力學(xué)規(guī)律。見表1。

圖2 不同pH值80 ℃下葛根素的降解動力學(xué)曲線

表1 80 ℃不同pH值下葛根素的降解動力學(xué)參數(shù)

以ln(k)為縱坐標(biāo)，pH值為橫坐標(biāo)作圖，得到pH值與葛根素降解速率的關(guān)系圖(見圖3)?？芍?，葛根素在中性偏堿條件下(pH=8)比較穩(wěn)定，在強酸堿條件下均可降解，尤其在強堿條件下，降解反應(yīng)速率最高。推測出水解反應(yīng)可能是氫離子及氫氧根離子催化下的反應(yīng)。

圖3 80 ℃下葛根素在不同pH值降解速率常數(shù)比較

2.3.2 溫度對穩(wěn)定性的影響

2.3.2.1 樣品溶液的制備 pH 12水溶液的配制：同2.3.1.1項下方法。精密吸取葛根素儲備液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，用pH 12水溶液定容至刻度，搖勻即得，該樣品溶液中葛根素的起始質(zhì)量濃度為2.70 μg·mL-1。

2.3.2.2 樣品的測定與結(jié)果 將配制好的樣品溶液分別放置于70、80、90 ℃的恒溫水浴中，每隔一定時間，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定葛根素峰面積，計算樣品中葛根素的含量。

以ln(k)為縱坐標(biāo)，1/T為橫坐標(biāo)作圖，得到溫度對葛根素降解速率的影響，如圖4所示。由該線性方程可以計算出不同溫度下的降解速率常數(shù)，通過阿侖尼烏斯方程可計算降解反應(yīng)的活化能為48.0 kJ·mol-1。

圖4 不同溫度下葛根素的降解速率常數(shù)

2.3.3 離子強度對穩(wěn)定性的影響

2.3.3.1樣品溶液的制備 pH 12水溶液的配制：同2.3.1.1項下的方法。精密吸取葛根素儲備液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，用pH 12水溶液定容至刻度，搖勻得樣品1。精密吸取葛根素儲備液(0.270 mg·mL-1)100 μL于10 mL棕色量瓶中，加入含有0.5 mol·L-1NaCl的pH 12水溶液定容至刻度，搖勻得樣品2。

2.3.3.2 樣品的測定與結(jié)果 將葛根素樣品保存在棕色容量瓶中，80 ℃水浴中放置。每隔一定時間，分別精密吸取上述各樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定葛根素峰面積，計算樣品中葛根素的含量。結(jié)果表明，含有0.5 mol·L-1NaCl的pH 12的水溶液與不含NaCl的水溶液葛根素的降解速率常數(shù)分別為0.023 5與0.026 7，降解反應(yīng)略微變快，表明Na+、Cl-一定程度上可加快葛根素的水解反應(yīng)，但并不明顯。

2.3.4 初始濃度對穩(wěn)定性的影響

2.3.4.1 樣品溶液的制備 pH 12水溶液的配制：同2.3.1.1項下的方法制備。精密吸取葛根素儲備液(0.270 mg·mL-1)50、100、200 μL分別置于10 mL棕色量瓶中，用pH 12水溶液定容至刻度，搖勻即得，各樣品溶液中葛根素的起始質(zhì)量濃度為1.35、2.70、5.40 μg·mL-1。

2.3.4.2 樣品的測定與結(jié)果 將葛根素樣品保存在棕色容量瓶中，80 ℃水浴中放置。每隔一定時間，精密吸取樣品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，測定葛根素峰面積，計算樣品中葛根素的含量。

對降解結(jié)果加以分析，以降解速率常數(shù)對3個樣品質(zhì)量濃度進(jìn)行作圖，結(jié)果見圖5。由圖可知，葛根素的起始濃度不同，反應(yīng)速率變化不大，因此對于葛根素，反應(yīng)物初始質(zhì)量濃度對反應(yīng)速率的影響不大。

圖5 初始質(zhì)量濃度對葛根素降解速率的影響

3 結(jié)論

研究表明葛根素在不同pH及溫度條件下的降解過程均遵循一級動力學(xué)規(guī)律。葛根素的初始質(zhì)量濃度對其強堿性環(huán)境下降解反應(yīng)速率沒有明顯影響，Na+、Cl-的引入會略微增大葛根素在強堿性環(huán)境下的降解反應(yīng)速率。pH值、溫度對葛根素的降解過程有顯著的影響，其降解過程呈現(xiàn)pH與溫度依賴性。

葛根素在pH=8的近中性水溶液環(huán)境中最為穩(wěn)定，隨著酸性及堿性的增加，葛根素的降解速率逐漸增快，但較一般的苷鍵水解反應(yīng)難以發(fā)生，這是因為苷類成分水解難易與苷鍵原子接受質(zhì)子能力強弱有關(guān)，苷鍵原子越易質(zhì)子化則越易水解，在碳苷中，因碳原子無游離電子對，難以質(zhì)子化，故碳苷較難水解而較為穩(wěn)定。

通過該研究結(jié)果表明，葛根素適宜在低溫中性條件下保存，極端的pH和高溫均會造成其快速分解，在開發(fā)和應(yīng)用含有葛根素的藥物時應(yīng)避免上述條件的出現(xiàn)。

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StudiesonDegradationKineticsofPuerarininAqueousSolution

PEIGaosheng1，WANGMeng2，ZHANGHuijie1，SUNLili1，RENXiaoliang，DENGYanru1，QIAidi1

(1.CollegeofTraditionalChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China；2.InstituteofTraditionalChineseMedicine，TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine，Tianjin300193，China)

Objective：To investigate the degradation kinetic characteristics of puerarin in aqueous solution under different pH and temperatures.Methods：The concentration change of puerarin in aqueous solution was determined by HPLC under different pH and temperatures.Based on the chemical reaction kinetic，the parameters of degradation kinetics were calculated.The activation energy and half-life were evaluated.Results：The results indicated that thermal degradation kinetic model of puerarin in aqueous solution follows first-order degradation kinetic process.Conclusion：Puerarin was more stable in neutral aqueous solution and low temperature condition.The degradation of puerarin can be observed in both strong acid and strong alkali conditions.

Puerarin；aqueous solution；degradation kinetics

2016-06-22)

國家自然科學(xué)基金面上基金項目(81473543)

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任曉亮，博士，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量評價研究；Tel：(022)59596221，E-mail：xiaoliang_ren@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.3.014