王立波，包曉群，劉曉陽＊，于 爽

（1．吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長春130033；2．錦州市中心醫(yī)院）

慢性腦缺血即長期慢性腦低灌注是臨床上常見的腦損傷之一，是血管性癡呆（Vascular dementia，VD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）、和皮層下動脈硬化性腦?。˙inswanger）病等多種認知障礙性疾病的共同病理過程，其損傷機制尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)Smac、NAIP在細胞凋亡中起重要作用，可參與急性腦缺血神經(jīng)元凋亡的調(diào)控過程，但其是否參與慢性腦缺血致認知功能障礙的損傷尚不清楚。本研究在成功制備慢性腦缺血致認知功能障礙模型基礎上，從蛋白和基因水平，探討慢性缺血大鼠腦內(nèi)細胞凋亡調(diào)控因子Smac、NAIP表達的變化以及丁苯酞對兩者的影響。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組

健康雄性 Wistar大鼠150只，體重280－320克，由吉林大學實驗動物中心提供。將選取的大鼠通過Morris水迷宮定位航行試驗進行篩選。隨機分為：假手術(shù)組、2VO＋鹽水對照組，和2VO＋丁苯酞干預組，每組再根據(jù)缺血時間隨機分為1、2、3個月組，每組分配大鼠10只。

1．2 模型制備及給藥方法

慢性腦缺血大鼠模型采用2VO方法制備。丁苯酞干預組于2VO術(shù)后48h內(nèi)，9mg／kg體重，每日1次腹腔注射給藥，共20天；鹽水對照組于相同時間分別給與等劑量0．9%氯化鈉注射液腹腔注射。

1．3 普通病理及TUNEL方法

模型建立后，從各組大鼠中隨機選取6只，以10%（300mg／kg）腹腔注射麻醉，暴露心臟，以12號穿刺針刺入左心室，剪開右心房，首先灌注冷0．9%生理鹽水約200ml，待從右心房流出液體清亮時，換用4%多聚甲醛的0．1MPBS（pH7．4）緩沖液200ml灌注固定，斷頭取腦。取以視交叉為中心相當于前聯(lián)合連續(xù)腦片繼續(xù)固定4－6h，制片，行HE染色及免疫組化染色。

1．4 RT－PCR 檢測腦組織 Smac、NAIP 的 mRNA表達

1．4．1 引物設計 PCR反應引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。擴增產(chǎn)物和DL2000Marker一起用10g·L－1瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像采用上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統(tǒng)照相，特異性條帶的豐度值用GIS圖像分析系統(tǒng)處理。各引物序列、片段長度和擴增條件如下：

1．4．2 腦組織 mRNA的提取及濃度的測定 取液氮中凍存的腦組織稱重，按比例加入Trizol試劑，組織勻漿后室溫孵育5min，使其充分裂解，離心，吸取上層水相，至另一離心管中，加入異丙醇，室溫孵育10min；4℃，12 000g，離心10min，棄上清，RNA沉于管底；加入75%乙醇，漩渦混勻，懸浮沉淀；4℃，7500g離心5min，盡量棄盡上清；室溫晾干或真空干燥5min；DEPC水溶解RNA，紫外分光光度計下測OD260及OD280。留取比值在1．8～2．0的樣本進行逆轉(zhuǎn)錄。

1．5 統(tǒng)計學處理

本實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，目的蛋白和PCR產(chǎn)物電泳條帶密度值以灰度×面積／參照物的比值表示。采用SPSS11．0統(tǒng)計軟件包處理，多組間比較用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0．05作為統(tǒng)計學顯著性差異的判斷標準。

2 結(jié)果

2．1 慢性腦供血大鼠腦內(nèi)凋亡檢測（TUNEL）

實驗結(jié)果顯示假手術(shù)組神經(jīng)細胞數(shù)量、形態(tài)分布正常，大鼠額葉皮層神經(jīng)細胞排列緊密有序，細胞核染色淺，細胞核圓而大，核仁清晰，可見到少數(shù)TUNEL陽性細胞。慢性腦缺血1個月、2個月、3個月大鼠腦內(nèi)TUNEL陽性細胞數(shù)明顯高于相應假手術(shù)組（P＜0．05），隨著缺血時間的延長，TUNEL陽性細胞數(shù)逐漸增多，缺血3個月時陽性細胞數(shù)最多。見圖1。

圖1 不同缺血時間額葉皮層TUNEL染色

2．2 大鼠不同缺血時間額葉皮層Smac、NAIP表達變化及丁苯酞的影響

RT－PCR結(jié)果顯示缺血組額葉3個時間點Smac mRNA表達量明顯高于假手術(shù)組，缺血3個時間點比較Smac mRNA表達量無明顯變化。缺血組額葉3個時間點NAIP mRNA表達較假手術(shù)組明顯降低（P＜0．05），隨著缺血時間的延長，NAIP mRNA表達量呈下降趨勢，缺血3個月時NAIP mRNA表達量最低。丁苯酞干預組各時間點NAIP mRNA表達量較缺血組明顯提高，組間比較差異顯著（P＜0．05）。見圖2，3。

圖2 不同缺血時間Smac GAPDH表達量

圖3 不同缺血時間NAIP GAPDH表達量

3 討論

慢性腦缺血是臨床上常見的腦損傷之一，目前非常重視對慢性腦缺血致認知功能障礙防治的研究。目前在慢性腦缺血致認知功能障礙的損傷機制研究中，主要有氧化應激、炎癥、神經(jīng)遞質(zhì)功能障礙及細胞凋亡等因素參與其中。最近關(guān)于細胞凋亡調(diào)節(jié)機制的研究表明Smac和NAIP起重要作用。Smac是存在于線粒體并調(diào)節(jié)細胞凋亡的蛋白質(zhì)，其促凋亡作用是通過逆轉(zhuǎn)凋亡抑制蛋白（IAPs）尤其是X連鎖凋亡抑制蛋白（xIAP）的作用實現(xiàn)的［1］。凋亡抑制蛋白IAPs家族是近年來發(fā)現(xiàn)了一組高度保守的凋亡蛋白抑制因子家族，主要通過抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase），參與腫瘤壞死因子受體（TNFR）介導的信號轉(zhuǎn)導等途徑發(fā)揮抗凋亡作用，與惡性腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)病變等密切相關(guān)［2］。神經(jīng)元凋亡抑制蛋白（NAIP）在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。本研究的前期實驗結(jié)果顯示，慢性腦缺血后大鼠額葉皮層出現(xiàn)典型的凋亡改變。有大量證據(jù)表明缺血后神經(jīng)細胞的死亡受到caspases的調(diào)節(jié)［3］。本研究在此基礎上，對凋亡調(diào)控因子Smac、NAIP基因進行檢測［4］。本研究結(jié)果提示Smac、NAIP參與慢性缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細胞的凋亡過程［5］，而丁苯酞則可能通過抑制Smac并增強NAIP的作用對神經(jīng)細胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6］，這與Siegelin等的報道［7］相似。

［1］Fan LW，Lin SY，Pang Y，et al．Hypoxia－ischemia induced neurological dysfunction and brain injury in the neonatal rat［J］．Behav Brain Res，2005，165（1）：80．

［2］Shang Y，Cheng JOi，J Miao H．Scutellaria flavonoid reduced memory dysfunction and neuronal injury caused by permanent global ischemia in rats．Phamracol［J］．Biochem Behav，2005，82：67．

［3］Eisel UL，Biber K，Luiten PGM．Life and death of nerve cells：therapeutic cytokine signaling pathways［J］．Curr Signal Transduct Ther，2006，1：133．

［4］Du C，F(xiàn)ang M，Li Y，et al．Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome－dependent caspase activation by elimination IAP inhibition［J］．Cell，2000，102（1）：33．

［5］Deckwerth TL，Adams LM，Wiessner C，et al．Long－term protection ofbrain tissue from cerebral ischemia by peripherally administered peptidomimeticcaspase inhibitors［J］．Drug Dev Res，2001，52：579．

［6］Antonsson B．Bax and other pro－apoptotic Bcl－2family “killerproteins”and their victim the mitochondrion［J］．Cell Tissue Res，2001，306：347．

［7］Yoo NJ，Kim HS，Kim SY，et al．Immunohistochemical analysis of Smac／IABLO expression in human carcinomas and sarcomas［J］．APMIS，2003，111（3）：382．