王丹丹，張彥文，2

(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東118003； 2.東北師范大學(xué)草地研究所，吉林 長(zhǎng)春 130024)

軟棗獼猴桃栽培品種DNA 指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳多樣性分析

王丹丹1，張彥文1，2

(1.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東118003； 2.東北師范大學(xué)草地研究所，吉林 長(zhǎng)春 130024)

為了對(duì)軟棗獼猴桃栽培品種進(jìn)行分子鑒別及分析不同品種間的親緣關(guān)系，采用對(duì)葉片直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，利用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了常見(jiàn)的42個(gè)軟棗獼猴桃品種的數(shù)字指紋圖譜和模式指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)(cluster project)，并進(jìn)行了遺傳多樣性分析.結(jié)果表明：利用21對(duì)軟棗獼猴桃核心引物擴(kuò)增所有品種的基因組，共檢測(cè)到132個(gè)等位位點(diǎn)，包括122個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率為92.4%.每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位位點(diǎn)數(shù)為3～8個(gè)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增6.28個(gè)基因型，擴(kuò)增條帶大小100～300 bp，多態(tài)信息含量(polymorphism information content，CPIC)為0.721，基因流為1.454，平均雜合率為0.691.其中，7對(duì)引物，即ACAR2，ACAR13，ACAR53，ACAR75，ACAR92，ACAR112和ACAR120可作為指紋圖譜構(gòu)建的首選引物，利用其中的ACAR2，ACAR13，ACAR53和ACAR75以引物組合方式構(gòu)建指紋圖譜可區(qū)分42個(gè)品種.聚類分析表明在遺傳距離0.64處42個(gè)品種被分為一類，在遺傳距離0.81處分為4類.聚類結(jié)果與品種的特性及來(lái)源具有較高的一致性.

軟棗獼猴桃；EST-SSR標(biāo)記；指紋圖譜；遺傳多樣性；聚類分析

品種真實(shí)性和純度鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定法、生物化學(xué)法及分子標(biāo)記鑒定法.由于受材料本身以及環(huán)境條件的影響，前兩種方法已很少作為品種真實(shí)性和純度鑒定的單一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn).[12-15]而分子標(biāo)記鑒定法 (expressed sequence tag-simple sequence repeats，EST-SSR)以其分子標(biāo)記為共顯性、擴(kuò)增的譜帶少、易識(shí)別、統(tǒng)計(jì)方便[15-17]，以及EST來(lái)自DNA編碼區(qū)其序列保守性相對(duì)較高等優(yōu)點(diǎn)，已成為品種真實(shí)性和純度鑒定的有效方法[18-19].我國(guó)已建立了多種植物的指紋圖譜以鑒定種質(zhì)的真實(shí)性和純度，如《水稻品種鑒定DNA指紋法》NY/T1433-2007、《玉米品種鑒定DNA指紋法》NY/T1432-2007等[20-24]，而利用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建軟棗獼猴桃DNA指紋譜圖的研究尚未見(jiàn)報(bào)道[25-27].本研究采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立了軟棗獼猴桃DNA指紋譜圖，為其種質(zhì)資源的真實(shí)性和純度鑒定奠定了基礎(chǔ).同時(shí)，在研究過(guò)程中，采用對(duì)葉片直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序、優(yōu)化了PCR體系.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)采用的42個(gè)軟棗獼猴桃栽培品種分別來(lái)自5個(gè)國(guó)家，具有不同的遺傳背景.種子由國(guó)內(nèi)主要軟棗獼猴桃研究所或品種引進(jìn)機(jī)構(gòu)提供.春季或夏季采集生長(zhǎng)旺盛的健康、幼嫩葉片于硅膠中干燥保存，以備提取基因組DNA.[28]實(shí)驗(yàn)分析工作在遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院進(jìn)行.

1.2 葉片的堿處理

將葉片剪碎，大小不超過(guò)2 mm2，否則不宜進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增.將葉片放入含有40 μL 0.25 mol/L NaOH的Eppendorf管中，沸水煮30 s；加入40 μL 0.25 mol/L HCl和20 μL 0.5 mol/L Tris-HCl(pH=8.0，含有0.25% 的Nonidet-P-40)，再次置于沸水中2 min，隨后取出葉片，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

1.3 EST-SSR PCR擴(kuò)增

在50 μL PCR反應(yīng)體系中加入1片經(jīng)堿處理的葉片.反應(yīng)液組成為：dNTPs (2.5 mmol/L ) 4 μL，引物(10 μmol/L)各1.8 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，MgCl2(1.5 mmol/L) 3 μL，10×緩沖液5.0 μL，加滅菌的ddH2O至總體積50 μL.PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，58℃～62℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min.產(chǎn)物4℃保存[29].

擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色和圖譜分析[30].實(shí)驗(yàn)所用的21對(duì)引物是作者從先前196對(duì)EST-SSR引物中篩選出來(lái)的[31]，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)(見(jiàn)表1).引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.4 數(shù)據(jù)處理

(4) 第四層時(shí)間服務(wù)：連接信號(hào)子網(wǎng)的網(wǎng)關(guān)A和網(wǎng)關(guān)B作為NTP服務(wù)的服務(wù)器端來(lái)提供時(shí)間服務(wù)，信號(hào)子網(wǎng)內(nèi)的所有主機(jī)(包括ATC車載設(shè)備、ATC其它軌旁設(shè)備和DCS設(shè)備)作為NTP服務(wù)的客戶端來(lái)同步兩個(gè)網(wǎng)關(guān)的時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR引物擴(kuò)增

利用21對(duì)引物對(duì)42份軟棗獼猴桃進(jìn)行擴(kuò)增，部分引物擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1.實(shí)驗(yàn)共獲得132個(gè)等位位點(diǎn)，包括122個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率為92.4%.每對(duì)引物擴(kuò)增出的等位位點(diǎn)數(shù)為3～8個(gè)，每對(duì)引物平均擴(kuò)增6.28個(gè)基因型，擴(kuò)增的條帶大小介于100～300 bp.多態(tài)信息含量(CPIC)是表示微衛(wèi)星DNA變異程度高低的一個(gè)指標(biāo)，反映微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高低，其大小取決于檢測(cè)的等位基因的數(shù)目和該基因的基因頻率分布，一般來(lái)說(shuō)，CPIC>0.5，多態(tài)性較高；0.5≥CPIC≥0.25多態(tài)性適中；CPIC<0.25，多態(tài)性較低.而本研究21對(duì)EST-SSR引物的平均CPIC值為0.721(0.503～0.899，見(jiàn)表1)，表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性；基因流(Nm)平均值為1.454(0.809～3.100，見(jiàn)表1)，F(xiàn)ST平均值為0.158(0.077～0.236，P<0.05，見(jiàn)表1).

表1 EST-SSR引物在42份供試材料中的擴(kuò)增情況

圖1 引物ACAR92對(duì)軟棗獼猴桃擴(kuò)增的電泳圖譜

2.2 EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建

由于同一引物在不同品種中擴(kuò)增的條帶具有差異，同一電泳位置上有帶記為1，無(wú)帶記為0.將數(shù)據(jù)輸入Excel中，按照條帶從小到大的順序排列，同一豎排中進(jìn)行數(shù)據(jù)排序，將0和1 分開(kāi)以便于比對(duì)，再將此排中0或者1最少的一組單獨(dú)提出，隨即刪除第一排，而后再對(duì)第二排進(jìn)行同樣的排序、比對(duì)，以此類推，便能逐步比對(duì)出與所有品種完全不同的0，1指紋及其所代表的品種，亦能找到指紋完全相同的品種.21對(duì)引物中有7對(duì)引物具有區(qū)別不同品種的能力，即ACAR2，ACAR13，ACAR53，ACAR75，ACAR92，ACAR112和ACAR120(見(jiàn)表2).ACAR2區(qū)別品種最多，為3，8，9，14，16，20，23，26，30，33，34，37和40號(hào)品種，其中4，15，27，29，32和35號(hào)品種帶型一致；17，25，31，41和42號(hào)品種帶型一致；5，11，22，28和39號(hào)品種帶型一致；10，13，19，21和24號(hào)品種帶型一致；18和36號(hào)品種帶型一致.

表2 基于7對(duì)EST-SSR引物區(qū)分42份品種的能力

根據(jù)7對(duì)引物的多態(tài)性，采用特殊引物法可鑒定32份軟棗獼猴桃品種，其余10種不能鑒定，即2，5，10，15，24，28，32，35，38和41號(hào)品種.因此，本研究采用引物組合法只需4對(duì)EST-SSR引物便可完全區(qū)分42份軟棗獼猴桃品種，指紋圖譜見(jiàn)表3.采用ClusterProject軟件對(duì)構(gòu)建的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析形成指紋模式圖譜(見(jiàn)圖2)，由此，應(yīng)用兩種EST-SSR指紋分析方式共同建立了軟棗獼猴桃的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù).

表3 軟棗獼猴桃品種的DNA數(shù)字指紋圖譜

圖242份軟棗獼猴桃品種的EST-SSR指紋模式圖譜

2.3 聚類分析

采用UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建了42份軟棗獼猴桃品種的遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖(見(jiàn)圖3).42份軟棗獼猴桃品種被劃分為4個(gè)類群(見(jiàn)表4)，聚類結(jié)果與品種的特性、來(lái)源具有較高的一致性，即來(lái)源于同一地區(qū)(或國(guó)別)和形態(tài)特性相似的品種聚在一個(gè)類群.第一類群有28個(gè)品種，包括日本品種茂綠，該類群中大部分為綠果皮、綠果肉的品種；第二類群有10個(gè)品種，包括新西蘭的薩多瓦、烏克蘭的赤焰、庫(kù)庫(kù)瓦、維基、韋狄4個(gè)品種以及國(guó)內(nèi)的LD1442、紅佳麗、天源紅、紅寶石星、LD1443的5個(gè)品種，表明它們的遺傳關(guān)系極為相近，這些品種基本上為紅果皮或紅肉系列.國(guó)外品種和國(guó)內(nèi)品種聚在一起，表明很多國(guó)內(nèi)品種具有國(guó)外品種的血統(tǒng)，是授粉系和優(yōu)良不育系反復(fù)使用的結(jié)果.第3類群有3個(gè)品種，即花之井、峰香和里泉，均來(lái)自于日本.第4類群僅有1個(gè)品種Chiak，與其他41個(gè)品種之間的平均遺傳距離為0.451，最大遺傳距離為0.871，為所有品種間遺傳距離最大的，表明該品種的遺傳基礎(chǔ)與其他品種差別較大.

圖3 42份軟棗獼猴桃品種遺傳關(guān)系樹(shù)狀圖

類群品種個(gè)數(shù)品種名稱Ⅰ28金香玉、綠珍珠、LD133、LD237、LD241、LD126、恒優(yōu)1號(hào)、珍玉1號(hào)、珍玉2號(hào)、珍玉3號(hào)、魁綠、8131、63?8、T4?5?2、T5?5?3、長(zhǎng)江1號(hào)、茂綠、佳綠、9701、綠野12號(hào)、寶貝星、豐綠、8401、T9?4?2、T5?3?1、T6?4?1、14?6?2、S8?3?2Ⅱ10LD1442、紅佳麗、天源紅、紅寶石星、LD1443、韋狄、薩多瓦、庫(kù)庫(kù)瓦、赤焰、維基Ⅲ3花之井、峰香、里泉Ⅳ1Chiak

3 討論

本文研究的42個(gè)軟棗獼猴桃品種來(lái)自不同的國(guó)家，中國(guó)22個(gè)品種，新西蘭4個(gè)品種，烏克蘭1個(gè)品種，日本4個(gè)品種，韓國(guó)1個(gè)品種.聚類分析在遺傳距離0.64處將所有品種分為4類，這4類群基本上是以品種性狀和國(guó)別進(jìn)行的類別劃分.此外，同一產(chǎn)地的品種聚在一起的較為普遍，比如產(chǎn)于遼寧丹東的珍玉1號(hào)、珍玉2號(hào)和珍玉3號(hào)，說(shuō)明目前生產(chǎn)上同一地區(qū)反復(fù)使用同一授粉系或者不育系雜交配種的現(xiàn)象較普遍，導(dǎo)致群體內(nèi)部基因流較大(Nm為1.454，基因流是基因在群體間的流動(dòng)，是影響群體內(nèi)部和群體之間遺傳變異程度的重要因素).觀測(cè)雜合度Ho都略低于期望雜合度He(雜合度的高低反映了居群基因型的一致性，見(jiàn)表1)，性狀相似現(xiàn)象亦較為普遍，造成同一地區(qū)遺傳基礎(chǔ)較差.此外，有些國(guó)產(chǎn)品種和國(guó)外品種聚在一起，親緣關(guān)系較近，說(shuō)明了國(guó)際合作育種工作已有成效.為了避免我國(guó)軟棗獼猴桃遺傳基礎(chǔ)出現(xiàn)狹窄現(xiàn)象，未來(lái)通過(guò)加強(qiáng)國(guó)內(nèi)外合作育種，雜交配成更加優(yōu)良的軟棗獼猴桃品種是非常有必要的.

目前，很多國(guó)家審定新品種都需要進(jìn)行植物新品種測(cè)試(DUS測(cè)試)，證明新品種的特性以及與現(xiàn)有品種的不同，而部分品種僅僅是育種者提供品種，經(jīng)過(guò)區(qū)域試驗(yàn)后，對(duì)于達(dá)到要求的品種即可申請(qǐng)為新品種，而對(duì)于新品種的描述也只限于形態(tài)學(xué)的特征，造成品種同物異名和異物同名等現(xiàn)象.而利用EST-SSR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如不含內(nèi)含子，在各組織、各發(fā)育時(shí)期均可檢測(cè)到，且不受季節(jié)、環(huán)境等因素的限制；數(shù)量多可覆蓋整個(gè)基因組；多態(tài)性高，成共顯性，能夠鑒別出純合、雜合基因型等，即使品種間形態(tài)學(xué)差異較小，只要在遺傳基礎(chǔ)上仍有差異，EST-SSR就可發(fā)揮作用.

本研究采用對(duì)葉片直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，簡(jiǎn)化了PCR程序，篩選出適合鑒定真實(shí)性和純度的4對(duì)核心引物，構(gòu)建了現(xiàn)有軟棗獼猴桃種質(zhì)的DNA指紋數(shù)字圖譜和EST-SSR指紋模式圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)解決軟棗獼猴桃出現(xiàn)的品種糾紛問(wèn)題將有極大的幫助.隨著軟棗獼猴桃新品種的逐年出現(xiàn)，指紋圖譜構(gòu)建工作仍需不斷加密，仍需要大量篩選出新的軟棗獼猴桃EST-SSR核心引物，以為新品種做指紋圖譜，保證我國(guó)軟棗獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康有序的繁榮發(fā)展.

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(責(zé)任編輯：方林)

EstablishmentofDNAfingerprintingandanalysisofgeneticdiversityamongActinidiaargutacultivars

WANG Dan-dan1，ZHANG Yan-wen1，2

(1.College of Agriculture，Eastern Liaoning University，Dandong 118003，China； 2.Grassland Research Institute，Northeast Normal University，Changchun 130024，China)

In order to identify the cultivars ofActinidiaargutaand analyze the genetic relationship among different cultivars at a molecular level，we constructed the digital fingerprint and model fingerprint(ClusterProject)for 42 commonA.argutacultivars using EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeats) molecular markers.The 21 pairs of primers amplified a total of 132 alleles including 122 polymorphic alleles with a polymorphism rate of 92.4%.Each pairs of primers can amplify 3～8 alleles，with an average of 6.28 alleles per locus.The length of amplified products was 100～300 bp，with the mean value ofCPIC(polymorphism information content) being 0.721，Nm(gene flow) being 1.454，and the mean value ofHo(heterozygosity) being 0.691.Among the 21 primers，7 primers can be used as a preferred choice for fingerprinting，namely ACAR2，ACAR13，ACAR53，ACAR75，ACAR92，ACAR112 and ACAR120，in which 4 primers (ACAR2，ACAR13，ACAR53 and ACAR75) can be employed in combination to identify the 42 cultivars.Cluster analysis showed that the 42 cultivars can be divided into one group at a genetic distance of 0.64，and four groups at a distance of 0.81.The genetic relationship as indicated by the cluster completely reflected the characteristics and the source of the cultivars.

Actinidiaarguta；EST-SSR markers；fingerprinting；genetic diversity；cluster analysis

1000-1832(2017)03-0104-08

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.03.022

2016-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31370400)；丹東市2016科技攻關(guān)項(xiàng)目(2016KJ001)；遼東學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目(2015QN006).

王丹丹(1982—)，女，碩士研究生，講師，主要從事分子生物學(xué)研究.

Q 663.4 [學(xué)科代碼] 180·5155

A