張 靜，曲小姝，劉樹萍，楊艷艷

(1.海軍92538部隊(duì)醫(yī)院，大連 遼寧116000； 2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林132022； 3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游與烹飪學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150076)

過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽抑制 人卵巢癌細(xì)胞增殖的研究

張 靜1，曲小姝2，劉樹萍3，楊艷艷2

(1.海軍92538部隊(duì)醫(yī)院，大連 遼寧116000； 2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林132022； 3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)旅游與烹飪學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150076)

研究了過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽化合物 [Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (CuW12)的體外抗腫瘤活性.取人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3加入不同濃度CuW12處理，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法分析細(xì)胞增殖，計(jì)算了半數(shù)抑制濃度(IC50)；采用光學(xué)顯微鏡觀察SKOV-3細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化；分析了細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，計(jì)算了各期細(xì)胞比例及細(xì)胞凋亡率.結(jié)果表明：CuW12對(duì)SKOV-3細(xì)胞增殖抑制的IC50值為45.2 μmol/L，且呈劑量依賴性；與經(jīng)典的仲鎢酸鹽Na10(H2W12O42)·26H2O (NaW12)相比，過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽抗腫瘤活性更強(qiáng)；光學(xué)顯微鏡下觀察到CuW12處理組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)變圓、縮小、老化等形態(tài)變化；不同濃度CuW12處理12 h后早期凋亡細(xì)胞所占的百分比顯著增加且呈劑量依賴性.

仲鎢酸鹽；人卵巢癌細(xì)胞SKOV-3；抗腫瘤；銅

0 引言

多金屬氧酸鹽 (Polyoxometalates，POMs)又稱多酸，是由d0組態(tài)的過渡金屬離子與氧高度聚合形成的具有空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的金屬-氧簇合物.[1]1971年M.Raynaud等[2]首次報(bào)道了雜多陰離子[SiW12O40]4-的抗病毒活性，開創(chuàng)了多酸的藥物化學(xué).從20世紀(jì)80年代中后期開始，多酸藥物研究進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展時(shí)期，在抗病毒[3]、抗腫瘤[4]、抗菌[5]等領(lǐng)域都有著重要研究進(jìn)展.

仲鎢酸鹽-B是一種經(jīng)典的同多酸，陰離子結(jié)構(gòu)式為[H2W12O42]10-，是由4個(gè)共角相連的兩種不同類型的三金屬簇{W3O13}和{W3O14}單元構(gòu)成的一種中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)有利于構(gòu)建各種拓展結(jié)構(gòu)，以其為基本建筑單元，利用過渡金屬離子作為連接子，可以構(gòu)筑各種基于仲鎢酸鹽-B的新型多酸化合物.[6-8]文獻(xiàn)[9]報(bào)道仲鎢酸鹽具有優(yōu)異的抗艾滋病毒活性，但是目前關(guān)于其抗腫瘤作用的研究報(bào)道還不多.[10-12]仲鎢酸鹽-B型多酸在中性到弱堿性水溶液中是非常穩(wěn)定的，在生理?xiàng)l件下不分解成小碎片，表面電荷高，具備成為優(yōu)良抗腫瘤藥物的潛力.因此，研究仲鎢酸鹽化合物的抗腫瘤作用具有重要意義.

另一方面，銅的生物活性近年來一直受到關(guān)注.很多本身沒有藥理活性的物質(zhì)，與銅形成化合物后表現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎活性[13]，研究發(fā)現(xiàn)癌癥的發(fā)生與炎癥反應(yīng)有關(guān)聯(lián)，體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)表明很多銅配合物具有抗癌作用[14].用過渡金屬銅修飾仲鎢酸鹽-B以提高其生物活性是一種有意義的嘗試.

本文使用課題組合成的新型銅修飾的仲鎢酸鹽[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (CuW12)[8]，選擇人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞并對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究，與經(jīng)典的仲鎢酸鈉Na10(H2W12O42)·26H2O(NaW12)的藥理活性進(jìn)行了對(duì)比.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：蘇州蘇靜集團(tuán)FLB-lB型超凈工作室；美國SHELL/JB型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱；日本Olympus倒置相差顯微鏡；日本KA-1000型低速離心機(jī)；BIORAD公司680型酶標(biāo)儀；美國BD公司BD FAC ScantoTM流式細(xì)胞儀.

試劑：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 (MTT) 及DMSO購自美國Sigma公司；胎牛血清(Fetalbovineserum)、RPMI-1640 (pH7.0-7.2)、胰蛋白酶(tyrsin)購自Gibco公司；雙抗(青霉素鈉、硫酸鏈霉素)購自西安制藥公司；Hoechst33258試劑盒、碘化丙啶(Propidium Iodine，PI)購自南京凱基生物工程研究所； CuW12和NaW12為自制單晶(CuW12和NaW12水溶性較好，經(jīng)紫外光譜研究發(fā)現(xiàn)化合物在pH值2～9范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，且不隨時(shí)間變化；兩種化合物均經(jīng)過X射線單晶衍射、紅外光譜、元素分析進(jìn)行了表征[10])，分別將其溶于DMSO中，再用含10%滅活新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成終濃度為100 mmol/L的母液，4℃保存?zhèn)溆?；SKOV-3細(xì)胞株，吉林醫(yī)藥學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 MTT法測腫瘤細(xì)胞活力

把對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞調(diào)成密度為1×105個(gè)/mL，在96孔培養(yǎng)板中每孔加入200 μL密度為1×105個(gè)/mL的SKOV-3細(xì)胞懸液，在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，24 h后把SKOV-3細(xì)胞分為空白對(duì)照組和6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(分別加入濃度為0.1，1，10，20，50，100 μmol/L的藥物溶液200 μL)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋液分別培養(yǎng)24 h.培養(yǎng)結(jié)束每孔加入新鮮配制的MTT溶液20 μL，溫育4 h使MTT還原為甲瓚，當(dāng)在倒置顯微鏡下看到孔板內(nèi)的細(xì)胞周圍出現(xiàn)絲狀紫色結(jié)晶體時(shí)倒掉上清液，每孔加入DMSO 150 μL振蕩溶解細(xì)胞，用平板搖床搖勻后，使用酶標(biāo)儀測定光密度值(OD)(檢測波長為570 nm).計(jì)算增殖抑制率，增殖抑制率=(1-藥物試驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)×100%.重復(fù)實(shí)驗(yàn) 3次，取平均值.

1.3 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長期的SKOV-3細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，去上清液，將細(xì)胞分成空白對(duì)照組及6個(gè)實(shí)驗(yàn)組(分別加入濃度為0.1，1，10，20，50，100 μmol/L的藥物溶液200 μL)，用DMEM培養(yǎng)基稀釋液培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察不同濃度藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，從生長抑制、細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行評(píng)估.

1.4 Annex in V-FITC/ PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

分別取對(duì)數(shù)生長期SKOV-3細(xì)胞5×105個(gè)接種于7個(gè)25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，分別加入濃度為0，0.1，1，10，20，50，100 μmol/L的藥物溶液10 mL，其中0為陰性對(duì)照，12 h后收集空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，PBS洗滌2次，在4℃溫度下用70%乙醇固定30 min，用Annex in V-FITC/PI雙標(biāo)記染色后上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率.

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT比色實(shí)驗(yàn)

由于活細(xì)胞的線粒體具有還原MTT形成紫色化合物的能力，該化合物在 570 nm 波長下有強(qiáng)吸收.細(xì)胞死亡或增殖功能下降時(shí)，還原MTT 的能力下降，570 nm 波長下吸光度值會(huì)降低，不同濃度CuW12處理SKOV-3細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1.由表1可知，與空白對(duì)照組比較，不同濃度的CuW12處理SKOV-3細(xì)胞24 h后，SKOV-3細(xì)胞的OD值明顯減小，表明CuW12對(duì)SKOV-3細(xì)胞具有抑制作用，且隨著濃度的增加細(xì)胞的存活率下降，具有藥物劑量依賴性，IC50為45.2 μmol·L-1(見表2).對(duì)比經(jīng)典的仲鎢酸鹽NaW12和CuW12的藥理活性，NaW12體外抑制SKOV-3細(xì)胞的IC50為200.6 μmol·L-1[10]，經(jīng)過過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性顯著增強(qiáng)，這說明Cu2+的引入對(duì)仲鎢酸鹽藥理活性的增強(qiáng)發(fā)揮了重要作用，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究.

表1 不同濃度CuW12處理SKOV-3細(xì)胞24 h后的OD值

注：OD值為光密度值.

表2 NaW12和 CuW12體外抑制SKOV-3細(xì)胞的抑制率和IC50

2.2 不同濃度CuW12對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

不同濃度CuW12對(duì)SKOV-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響見圖1，空白對(duì)照組卵巢癌細(xì)胞SKOV-3緊貼瓶底、細(xì)胞密集，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞形態(tài)飽滿、邊界清晰、圓形細(xì)胞少；與空白對(duì)照組比較，10 μmol·L-1CuW12組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；50 μmol/L CuW12組細(xì)胞較為稀疏，附壁疏松，脫壁細(xì)胞由橢圓形變圓；100 μmol/L CuW12組細(xì)胞皺縮變小，細(xì)胞邊緣毛糙不規(guī)則，胞質(zhì)致密，細(xì)胞核變形，細(xì)胞質(zhì)中顆粒較多.經(jīng)CuW12處理的細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的特征性改變，且隨著藥物濃度的增加，視野內(nèi)凋亡的細(xì)胞也增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系.

a：對(duì)照組；b—d：分別為10，50，100 μmol/L CuW12處理的SKOV-3

2.3 不同濃度的CuW12對(duì)腫瘤細(xì)胞早期凋亡率的影響

正常生長的SKOV-3細(xì)胞早期凋亡率為4.61%.經(jīng)不同濃度的CuW12處理12 h后，SKOV-3細(xì)胞早期凋亡率顯著增加，經(jīng)0.1，1，10，20，50，100 μmol/L CuW12處理后的凋亡率分別為4%，4.63%，8.1%，20.96%，34.86%和48.4%(見圖2).早期凋亡細(xì)胞所占的百分比由4.61%增加到48.4%.表明CuW12誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞的死亡性質(zhì)為凋亡，且其作用具有明顯劑量依賴性.

a：正常生長的SKOV-3；b—g分別為0.1，1，10，20，50，100 μmol/L CuW12處理的SKOV-3

3 結(jié)論

本文探討了過渡金屬銅修飾的仲鎢酸鹽化合物CuW12對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞生長及凋亡的影響.MTT細(xì)胞活性檢測表明：CuW12對(duì)SKOV-3細(xì)胞有較明顯的抑制作用，IC50為45.2 μmol·L-1，與經(jīng)典的仲鎢酸鹽NaW12相比，Cu2+修飾的仲鎢酸鹽對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性明顯增強(qiáng)，說明過渡金屬銅的引入對(duì)改變仲鎢酸鹽的藥理活性有重要作用；光學(xué)顯微鏡下CuW12處理組的細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡的特征性改變，且呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系；不同濃度CuW12處理12 h后早期凋亡細(xì)胞所占的百分比顯著增加且呈劑量依賴性，說明CuW12具有誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡的作用.凋亡是出現(xiàn)在多細(xì)胞生物體內(nèi)的程序性死亡.近年來，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制，許多化學(xué)藥物的治療機(jī)制都是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用的.因此，研究仲鎢酸鹽-B型化合物的抗腫瘤作用具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可為發(fā)展多酸藥物的臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

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(責(zé)任編輯：石紹慶)

Inhibitoryeffectofaparadodecatungstate-BcompounddecoratedbytransitionmetalcopperonthegrowthofhumanovariancarcinomaSKOV-3cells

ZHANG jing1，QU Xiao-shu2，LIU Shu-ping3，YANG Yan-yan2

(1.Navy 92538 Force Hospital，Dalian 116000，China； 2.Chemical and Pharmaceutical Engineering Institute，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China； 3.College of Tourism and Cusine，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)

This paper has studied the in vitro anti-tumor activity of a novel paradodecatungstate-B compound decorated by transition metal copper：[Na2(H2O)10][Cu4(H2O)12(H2W12O42)]·15H2O (abbreviated form：CuW12).Human ovarian carcinoma SKOV-3 cell was treated with different concentration of CuW12，then its IC50was measured by MTT assay.The morphological change in SKOV-3 cell was observed by optical microscopes.Flow cytometry was applied to analyze cell cycle and apoptosis by computing the ratio of SKOV-3 cells in different phase and its apoptotic ratio.The results show that CuW12can inhibit SKOV-3 cell proliferation with IC50of 45.2 μmol/L，showing dose-dependent.Compared with CuW12and classic paradodecatungstate compound Na10(H2W12O42)·26H2O (abbreviated form：NaW12)，CuW12exhibits higher inhibitory effect owing to the introduction of copper atom.Under the optical microscopes，we observed the number of SKOV-3 cells treated with CuW12decreased significantly，cell rounding，shrinking and aging.Treated with different concentrations of CuW12after 12 h，the proportions of SKOV-3 cells on the early apoptosis increased markedly，showing dose-dependent.

paradodecatungstate-B；human ovarian carcinoma SKOV-3 cells；anti-tumor；copper

1000-1832(2017)03-0092-05

10.16163/j.cnki.22-1123/n.2017.03.020

2016-10-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21301041)；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015431).

張靜(1975—)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究；通訊作者：曲小姝(1974—)，女，博士，教授，主要從事多酸化學(xué)研究.

O 611 [學(xué)科代碼] 150·15

A