宋忠興,趙鵬,唐志書,白宏博,李鉑,嚴(yán)邑萍
(1.陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司,陜西 銅川 727031;2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 咸陽 712083;3.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046)
·中藥工業(yè)·
4種中藥微細(xì)粉體顯微特征及細(xì)胞破壁率的測定△
宋忠興1,2*,趙鵬1,唐志書2,3,白宏博2,3,李鉑2,3,嚴(yán)邑萍4
(1.陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司,陜西 銅川 727031;2.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 咸陽 712083;3.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;4.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712046)
目的:測定丹參、黃芩、苦參和秦艽4種常用中藥微細(xì)粉體的細(xì)胞破壁率,比較其與常規(guī)細(xì)粉的顯微特征差異。方法:采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法,以木栓細(xì)胞、薄壁細(xì)胞作為計(jì)數(shù)指標(biāo),考察微細(xì)粉體技術(shù)對4種中藥細(xì)胞破壁率的影響;同時(shí)采用顯微觀察法比較常規(guī)細(xì)粉與微粉體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及后含物形態(tài)變化。結(jié)果:4種中藥微細(xì)粉體的細(xì)胞破壁均在95%以上,且細(xì)胞多已破碎,偶見完整細(xì)胞和導(dǎo)管等碎片。結(jié)論:微細(xì)粉體技術(shù)對丹參、黃芩、苦參、秦艽4種中藥具有良好的細(xì)胞破壁效果。
中藥;破壁微粉;細(xì)胞破壁率
中藥材以植物藥為主,約占85%以上。對于具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的植物藥而言,有效成分布于細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞壁是其溶出的主要屏障[1]。而中藥破壁飲片是指在遵循中醫(yī)藥用藥理論的前提下,將傳統(tǒng)中藥飲片采用微細(xì)粉體破壁技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞級(jí)粉碎,制成具有較小粒徑的微細(xì)粉體(D90<45 μm,破壁率>95%),再經(jīng)現(xiàn)代制劑技術(shù)制成干燥顆粒狀的一種新型中藥飲片[2]。其核心就是采用以生物細(xì)胞破壁為目的的微細(xì)粉體技術(shù)破壞中藥飲片組織的細(xì)胞壁,可以解決傳統(tǒng)中藥飲片物質(zhì)基礎(chǔ)因其部位、組織、細(xì)胞的不同而帶來的不均勻性問題。其可大幅提高中藥飲片有效成分的利用率,降低資源消耗,改變中藥飲片煎煮的服用方式,保留傳統(tǒng)中藥飲片的基本特征[3-5]。在破壁飲片制備過程中,藥材微細(xì)粉體是其中間產(chǎn)品或終端產(chǎn)品的主要形式,對其進(jìn)行破壁率測定,從微觀、理化特性表征等方面建立綜合評(píng)價(jià)技術(shù)體系,方可形成科學(xué)、穩(wěn)定的破壁飲片制備工藝和質(zhì)量控制方法[6-7]。作者通過觀察比較丹參、黃芩、苦參和秦艽4種中藥的常規(guī)細(xì)粉和微細(xì)粉體的顯微特征,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法分別測定其超微粉的細(xì)胞破壁率,考察超微粉碎技術(shù)對中藥細(xì)胞破壁率的影響。
1.1 試藥
丹參、黃芩、苦參和秦艽購自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司,符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部相關(guān)規(guī)定;水合氯醛及甘油均為分析純(上海山浦化工有限公司)。
1.2 儀器
XDW-2.1型振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)(濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司);FW-1000D型高速萬能粉碎機(jī)(天津鑫博得儀器有限公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);BX53型正置熒光生物顯微鏡(Olympus,Japan,包含DP73型CCD圖像采集和計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng))。
1.3 樣品制備
細(xì)粉制備:取丹參、黃芩、苦參和秦艽4種飲片,均干燥至水分約為6%,分別粉碎成細(xì)粉(100目),即得常規(guī)細(xì)粉,備用。
微細(xì)粉制備:將上述4種常規(guī)細(xì)粉分別采用細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)粉碎約20 min,收集過300目的微細(xì)粉,備用。
2.1 藥材細(xì)粉顯微特征、細(xì)胞計(jì)數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
參照郭旭東等[5]的方法并略作修改,按表1精密稱取不同質(zhì)量的細(xì)粉(80目),分別置于10 mL容量瓶中,加水合氯醛5 mL,超聲處理5 min,使藥材粉末分散均勻,定容至刻度。用微量移液器吸取30 μL藥液,裝片,以混懸液布滿載玻片且無氣泡為宜,并分別置于BX53型生物顯微鏡下觀察(400×)。
從不同藥材常規(guī)細(xì)粉顯微特征圖中可見完整木栓細(xì)胞、薄壁細(xì)胞,各種類型導(dǎo)管、纖維及細(xì)胞后含物等。丹參細(xì)粉木栓細(xì)胞壁厚,含棕色物質(zhì);石細(xì)胞呈類長方形或不規(guī)則形,內(nèi)含棕黃色物;具緣紋孔導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管多見,見圖1。黃芩粉末中木栓細(xì)胞壁厚,含棕黃色物質(zhì);石細(xì)胞呈不規(guī)則多角形,韌皮纖維壁厚,多呈梭形且具孔溝,見圖2。苦參細(xì)粉木栓細(xì)胞壁厚,呈不規(guī)則多邊形;另有螺紋導(dǎo)管和環(huán)紋導(dǎo)管,偶見草酸鈣方晶,見圖3。秦艽細(xì)粉中薄壁細(xì)胞多見,呈類長方形至不規(guī)則形,多含草酸鈣針晶;另有環(huán)紋導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管等,偶見內(nèi)皮層細(xì)胞,見圖4。
根據(jù)顯微特征觀察結(jié)果,分別以丹參、黃芩、苦參細(xì)粉中完整木栓細(xì)胞和秦艽細(xì)粉中薄壁細(xì)胞為計(jì)數(shù)指標(biāo),以顯微鏡下一個(gè)視野為一個(gè)計(jì)數(shù)單位,每個(gè)濃度藥液取8個(gè)計(jì)數(shù)單位,計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。以完整細(xì)胞個(gè)數(shù)的平均值為縱坐標(biāo),以藥材細(xì)粉稱樣量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,不同藥材在所取濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系,可用作顯微特征計(jì)數(shù),故取曲線中部藥液濃度為最適濃度進(jìn)行計(jì)數(shù),見表2。
注:A.木栓細(xì)胞(細(xì)粉);B.導(dǎo)管(細(xì)粉);C.韌皮纖維(細(xì)粉);D.超微粉。圖2 黃芩粉末顯微特征圖
注:A.木栓細(xì)胞(細(xì)粉);B.導(dǎo)管(細(xì)粉);C.草酸鈣方晶(細(xì)粉);D.木栓細(xì)胞(超微粉)。圖3 苦參粉末顯微特征圖
注:A.薄壁細(xì)胞(細(xì)粉);B.薄壁細(xì)胞(細(xì)粉);C.導(dǎo)管(細(xì)粉);D.薄壁細(xì)胞(超微粉)。圖4 秦艽粉末顯微特征圖
藥材名稱稱樣量及細(xì)胞個(gè)數(shù)丹參W/g0.06410.12250.18320.24620.3012N6.3757.59.2511.2512.5黃芩W/g0.03760.06920.12560.1820.2496N12.7513.62516.12516.520苦參W/g0.12420.1840.2450.30770.365N7.12510.37511.87514.87516.625秦艽W/g0.12460.18530.2470.30540.3594N3.1256.6256.59.12510.125
注:W.藥材細(xì)粉稱樣量;N.完整細(xì)胞個(gè)數(shù)。
表2 不同細(xì)粉標(biāo)準(zhǔn)曲線和最適濃度
2.2 微細(xì)粉體顯微特征及細(xì)胞破壁率的測定
顯微觀察結(jié)果表明,丹參、黃芩微細(xì)粉體中未見完整木栓細(xì)胞,偶見導(dǎo)管及纖維等殘片??鄥?、秦艽微細(xì)粉體中偶見完整木栓細(xì)胞和薄壁細(xì)胞。根據(jù)2.1的結(jié)果,分別以最適濃度精密稱取不同藥材細(xì)粉和微細(xì)粉,置于10 mL容量瓶中,裝片方法同2.1;分別置于顯微鏡下觀察25個(gè)視野,根據(jù)不同藥材兩種粉末中完整細(xì)胞個(gè)數(shù)、樣品質(zhì)量、混懸液體積等指標(biāo)計(jì)算顯微特征個(gè)數(shù)[8]:
粉末顯微特征個(gè)數(shù)=(XV)/(V′W)
其中,X為蓋玻片下粉末中完整細(xì)胞的特征數(shù),V為粉末混懸液總體積(mL),V′為蓋玻片下粉末混懸液體積(mL),W為粉末重量(mg)。
依照以下公式計(jì)算微細(xì)粉體細(xì)胞破壁率[9]:Y=(A-B)/A×100%。上式中,Y為細(xì)胞破壁率,A為常規(guī)細(xì)粉顯微特征個(gè)數(shù),B為超微粉顯微特征個(gè)數(shù)。由表3各參數(shù)分別計(jì)算4種細(xì)粉和微細(xì)粉的顯微特征個(gè)數(shù),最終得到各微細(xì)粉的細(xì)胞破壁率。計(jì)算結(jié)果表明,丹參、黃芩微細(xì)粉的細(xì)胞破壁率可達(dá)100%;苦參、秦艽微細(xì)粉的細(xì)胞破壁率分別為97.51%和95.41%。
表3 不同粉體顯微特征個(gè)數(shù)計(jì)算相關(guān)參數(shù)(n=25)
注:FP.fine powder,常規(guī)細(xì)粉;UFP.ultra-fine powder,微細(xì)粉。
本文研究結(jié)果表明,微細(xì)粉體技術(shù)對丹參、黃芩、苦參、秦艽4種中藥具有良好的細(xì)胞破壁效果。丹參、黃芩微細(xì)粉體的細(xì)胞破壁率均達(dá)到100%,顯微特征僅見細(xì)胞和導(dǎo)管等碎片,說明這兩種藥材的超微粉可達(dá)細(xì)胞級(jí)粉碎水平,大部分細(xì)胞的細(xì)胞壁完全被打破,有利于有效成分的溶出和藥效的發(fā)揮,可為制劑工藝研究和臨床用藥提供理論依據(jù)??鄥?、秦艽微細(xì)粉體細(xì)胞破壁率亦可達(dá)95%以上,說明超微粉碎技術(shù)對不同中藥破壁率的影響有所差異,取決于中藥的種類、物理特性等。本文通過觀察比較丹參、黃芩、苦參和秦艽4種藥細(xì)粉及微細(xì)粉體的顯微特征,并以木栓細(xì)胞和薄壁細(xì)胞作為計(jì)數(shù)指標(biāo),考察超微粉碎對細(xì)胞破壁率的影響,不同中藥細(xì)胞破壁率在95.41%~100%,該方法穩(wěn)定、方便可行。
中藥的有效成分是動(dòng)植物生命過程中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物,大多分布在細(xì)胞內(nèi)。不同的藥用部位、組織、細(xì)胞其成分的種類、數(shù)量有所差異,部位不同甚至表現(xiàn)出不同的功能。中藥采用傳統(tǒng)的煎煮方法,因?yàn)橹旅艿慕M織結(jié)構(gòu),有效成分從細(xì)胞壁內(nèi)浸出利用率只有10~30%。研究表明,丹參超微粉中丹酚酸B的溶出速率明顯高于其細(xì)粉[10]。同時(shí)發(fā)現(xiàn),三七粉粒度大小對主要成分含量影響明顯,與普通粉碎相比,三七經(jīng)超微粉碎2 h后,其超微粉中三七總皂苷含量達(dá)8.3%,高于普通粉碎藥材[11]。吳小明等[12]研究發(fā)現(xiàn),三七經(jīng)超微粉碎后,3種皂苷的溶出速度快于常規(guī)細(xì)粉,8 min內(nèi)可達(dá)總?cè)艹隽康?0%。因此,本研究后續(xù)將對不同藥材常規(guī)細(xì)粉和微細(xì)粉體中有效成分含量、溶出速率、體內(nèi)吸收等差異作進(jìn)一步研究,為制劑過程中超微粉的應(yīng)用提供參考。
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StudyonMicroscopicFeatureandWall-brokenRateofFourKindsofTraditionalChineseMedicineMicro-finePowders
SONGZhongxing1,2*,ZHAOPeng1,TANGZhishu2,3,BAIHongbo2,3,LIBo2,3,YANYiping4
(1.ShaanxiXingshengdePharmaceuticalCo.Ltd.,Tongchuan727031,China; 2.ShaanxiCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,Xianyang712083,China; 3.ShaanxiUniversityofChineseMedicine,Xianyang712046,China; 4.TheAffiliatedHospitalofShaanxiTCMUniversity,Xianyang712046,China)
Objective:To determine the wall-broken rates of four kinds of traditional Chinese medicine (TCM) micro-fine powders,including Radix Salviae Miltiorrhizae,Radix Seutellariae,Radix Sophorae Flavescentis and Radix Gentianae Macrophyllae.Moreover,the microscopic feature differences between micro-fine powders and conventional powders were compared.Methods: The cell counting method was applied to evaluate the effect of micro-fine grinding technology on the wall-broken rate with the number of intact cork cell and parenchyma cell as the index.Meanwhile,the cell structure and ergastic substances were compared between micro-fine powders and conventional powders by microscopic observation method.Results: The wall-broken rates of four kinds of TCM micro-fine powders were over 95%.The cell wall was almost broken and the intact cell and vessel fragment were occasional.Conclusion: Micro-fine grinding technology has a good effect on the wall-broken rates of four kinds of TCM micro-fine powders,including Radix Salviae Miltiorrhizae,Radix Seutellariae,Radix Sophorae Flavescentis and Radix Gentianae Macrophyllae.
Traditional Chinese medicine;micro-fine powder;wall-broken rate
陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2015KTZDSF02-05-02);陜西省科技資源開放共亨項(xiàng)目(2015FWPT-01);陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2012KTC-20)
] 宋忠興,副主任藥師,總工程師,研究方向:新藥研究與產(chǎn)業(yè)化開發(fā);E-mail:szx74816@sina.com
10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.018
2016-03-25)
*[