曹紅云，劉開(kāi)慶，游燕，秦波，劉慧，李東嫻

(云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心 云南省藥物研究所 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

·基礎(chǔ)研究·

HPLC柱后光衍生法測(cè)定珠子參中兩類真菌毒素殘留量

曹紅云，劉開(kāi)慶，游燕*，秦波，劉慧，李東嫻

(云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心 云南省藥物研究所 云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111)

目的：建立免疫親和柱凈化HPLC柱后光化學(xué)衍生法測(cè)定珠子參藥材中真菌毒素(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA)的方法。方法：參考2015年版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)珠子參藥材中真菌毒素(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)采用的柱后光衍生熒光檢測(cè)法測(cè)定的AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA的檢測(cè)下限分別為0.19、0.63、0.19、0.56、4.0 μg·kg-1，珠子參藥材真菌毒素回收率為78%～110%。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柱后光衍生熒光檢測(cè)法具有更高的靈敏度，且該分析方法適合于珠子參藥材及飲片中這些真菌毒素的檢測(cè)。

珠子參；真菌毒素；柱后光衍生熒光法；高效液相色譜法

珠子參又名紐子七、扣子七、珠兒參，系五加科(Araliaceae)人參屬(Panax)植物珠子參PanaxjaponicusC.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根莖[1]，其性微寒，味苦、甘，歸肝、肺、胃經(jīng)，具有補(bǔ)肺養(yǎng)陰、祛瘀止痛、止血等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有提高免疫功能、增強(qiáng)造血功能、抗腫瘤、抗心律不齊及抗炎等作用[2]。珠子參一般加工方法為洗凈后放入鍋中蒸煮，煮至透心后撈出曬干，而云南大多地方常年處于高溫高濕的天氣，即使藥材放在通風(fēng)效果良好的倉(cāng)庫(kù)，珠子參藥材還是容易發(fā)生霉變。霉變的藥材易被真菌毒素污染，黃曲霉毒素(aflatoxins)是已知真菌毒素中毒性最強(qiáng)的一類，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)劃定為I類致癌物，赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)的毒性僅次于黃曲霉毒素而列第二位。2015年版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》對(duì)大棗、水蛭、柏子仁等中藥材及飲片規(guī)定了“黃曲霉毒素”檢查項(xiàng)目和限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黃及甘草根的浸出物中OTA的限量檢查[3]，因此本實(shí)驗(yàn)用HPLC柱后光化學(xué)衍生熒光法測(cè)定珠子參中真菌毒素的方法學(xué)進(jìn)行了研究，建立了免疫親和柱凈化HPLC同時(shí)測(cè)定珠子參中真菌毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和OTA)含量的方法，從而提高了對(duì)珠子參藥材中有害物質(zhì)的控制水平。

1 儀器與材料

1.1儀器設(shè)備

Agilent1200高效液相色譜儀；Agilent1200熒光檢測(cè)器；PHRED光化學(xué)衍生器(美國(guó)AURA公司)；AG285型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；SK8200HP型超聲波清洗儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；THZ-82型恒溫震蕩器(金壇市富華儀器公司)；黃曲霉毒素/赭曲霉毒素復(fù)合免疫親和柱(批號(hào)：A0228，北京中檢維康生物技術(shù)有限公司)；玻璃纖維濾紙(青島普瑞邦公司)；Milli-Q超純水發(fā)生器(美國(guó)密理博公司，A10)。

1.2材料

黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：610001-201301，黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1(AFG2、AFG1、AFB2、AFB1)質(zhì)量濃度分別為0.59、1.18、0.35、1.04μg·mL-1)；赭曲霉毒素A(美國(guó)色譜科公司，批號(hào)：XA12003V，質(zhì)量濃度為50μg·mL-1)；色譜純甲醇(德國(guó)默克)；分析純甲醇(上海國(guó)藥，批號(hào)：20150930)；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

InertsilODS-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：以甲醇為流動(dòng)相A，以0.5%醋酸水溶液為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速為0.8mL·min-1，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL，采用柱后光化學(xué)衍生，以熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，0～25min：激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm，26～55min：激發(fā)波長(zhǎng)為333nm，發(fā)射波長(zhǎng)為477nm[4-9]。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

2.2混合對(duì)照品溶液的制備

取赭曲霉毒素A對(duì)照品用甲醇稀釋得1.0μg·mL-1的儲(chǔ)備液。

精密量取黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液2.5mL和赭曲霉毒素A(OTA)儲(chǔ)備液10.0mL，置25mL棕色容量瓶中，用70%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，作為真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

精密量取真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL，置于25mL量瓶中，用70%甲醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，即得真菌毒素混合對(duì)照品溶液[4]。混合對(duì)照品HPLC圖見(jiàn)圖1。

注：A.空白溶液；B.黃曲霉素混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液。圖1 珠子參供試品溶液及對(duì)照品HPLC圖

2.3供試品溶液的制備

取珠子參供試品粉末約15g(過(guò)二號(hào)篩)，精密稱定，加氯化鈉3g，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%甲醇水溶液75.0mL，震蕩30min，玻璃纖維濾紙過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液15.0mL，置50mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò)，量取續(xù)濾液20.0mL，通過(guò)復(fù)合免疫親和柱，流速為3mL·min-1，用20mL水洗脫，洗脫液棄去，使空氣進(jìn)入柱子，將水?dāng)D出柱子，再用1.5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得[4，6]。

2.4線性關(guān)系的考察

取上述真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用70%甲醇水溶液逐級(jí)稀釋配制成一系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA的線性方程分別為Y=112.87X-0.2848，r=0.9999；Y=71.092X-2.2982，r=0.9998；Y=193.78X-0.3856，r=0.9999；Y=83.99X-0.7754，r=0.9999；Y=13.649X-0.1036，r=1.0000。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA分別在0.0118～1.18、0.0236～2.36、0.007～0.7、0.0208～2.08、0.08～8.00ng呈良好的線性關(guān)系。

2.5檢測(cè)下限及定量下限

取上述真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液用70%甲醇水溶液稀釋配制成一系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，以信噪比3倍和10倍作為指標(biāo)，考察AFG2、AFG1、AFB2、AFB1和OTA的檢測(cè)下限(LLOD)和定量下限(LLOQ)，AFG2、AFG1、AFB2、AFB1、OTA的檢測(cè)下限分別為0.19、0.63、0.19、0.56、4.0μg·kg-1，定量下限為0.79、1.97、0.47、1.73、10.0μg·kg-1。

2.6儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD，分別為0.6%、0.4%、0.9%、0.6%、1.1%。結(jié)果表明本法具有良好的儀器精密度。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次供試品15g，精密稱定，共6份，分別加入1.50mL真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，RSD分別為3.6%、2.2%、2.7%、4.2%、4.7%。結(jié)果表明本法具有良好的重復(fù)性。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品15g，精密稱定，加入1.5mL真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于制備后0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定，RSD分別為2.2%、2.1%、4.2%、3.8%、4.2%。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次供試品6份，各15g，精密稱定，分別加入0.50mL真菌毒素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果表明，真菌毒素的平均加樣回收率為78.03%～110.26%，RSD分別為3.8%、2.6%、3.7%、3.2%、2.9%。該方法準(zhǔn)確度符合美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AOAC)(1～10 μg·kg-1加樣回收率為60%～120%)的檢測(cè)要求[10]。

3 樣品測(cè)定

將2個(gè)不同批次珠子參藥材，各取4份，每份100 g。每批次藥材選2份分別灑上少量水將其密封于自封袋中任其自然發(fā)霉，1份放置14 d后藥材輕度發(fā)霉，可見(jiàn)少量霉斑，40 ℃烘干后待測(cè)定；另1份放置21 d后藥材嚴(yán)重發(fā)霉，可見(jiàn)較多霉斑，40 ℃烘干后待測(cè)定。其余2份，將1份經(jīng)水洗凈，40 ℃烘干后待測(cè)定；另1份未經(jīng)處理。按以上測(cè)定方法對(duì)4份珠子參藥材中真菌毒素進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)批次的2份霉變珠子參藥材中有少量黃曲霉毒素檢出。

表2 珠子參樣品真菌毒素殘留量測(cè)定結(jié)果

4 討論

黃曲霉毒素為國(guó)際公認(rèn)的一類致癌物，即使在極低量時(shí)也具有很強(qiáng)的生物毒性，因此國(guó)際上對(duì)其限量控制越來(lái)越嚴(yán)格。建立靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法具有重要意義。此外中藥材在貯藏、加工、運(yùn)輸過(guò)程中，如條件不當(dāng)，極易產(chǎn)生或污染黃曲霉毒素和赭曲霉毒素，黃曲霉毒素不溶于水，耐熱溫度高達(dá)280 ℃，一旦污染很難去除。而珠子參的加工方法為“挖回后，剪盡須根，置籮筐中，浸于長(zhǎng)流水中足穿新草鞋踩去外層粗皮，放入鍋中煮，水與珠子參平，火力不大不小，不要翻動(dòng)，煮至透心后，撤火攪拌燜干，倒出曬干即可”。因?yàn)榧庸し椒ㄖ杏姓糁?，若水分沒(méi)曬干，珠子參容易發(fā)生霉變，所以測(cè)定珠子參中的真菌毒素殘留量非常有必要。

參照2015年版《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》，對(duì)照品溶液溶劑為甲醇，當(dāng)進(jìn)樣量大于10 μL時(shí)，AFG2、AFG1、AFB2、AFB1色譜峰均出現(xiàn)前沿現(xiàn)象，考慮可能是樣品溶劑極性與流動(dòng)相極性不匹配，當(dāng)進(jìn)樣量加大時(shí)，樣品溶劑突然影響流動(dòng)相極性，導(dǎo)致色譜峰出現(xiàn)前沿、分叉等現(xiàn)象，所以改用70%甲醇水溶液稀釋對(duì)照品，可以避免加大進(jìn)樣量出現(xiàn)峰前沿的現(xiàn)象。

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StudyofMethodforDeterminingtwoKindsofMycotoxinsinPanaxjaponicusvar.major

CAO Hongyun，LIU Kaiqing，YOU Yan*，QIN Bo，LIU Hui，LI Dongxian

(Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center，Yunnan Institute of Materia Medica，Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation，kunming 650111，China)

Objective：To study the method for determining mycotoxins inPanaxjaponicusvar.majorwith HPLC-FLD after immunoaffinity column cleanup and online post-column photochemical derivatization.Methods：According to the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia and the references，mycotoxins inPanaxjaponicusvar.majorwere determined by HPLC.Results：The detection limits of aflatoxins G2，G1，B2，B1，and ochratoxin A were 0.19，0.63，0.19，0.56，4.0 μg·kg-1.The recoveries analytes were from 78%-110%.Conclusion：The results showed that the HPLC-FLD online post-column photochemical derivatization is higher sensitivity，and it is suitable for determining mycotoxins inPanaxjaponicusvar.major.

Panaxjaponicusvar.major；mycotoxins；post-column photochemical derivatization；HPLC

] 游燕，碩士，副高級(jí)工程師，研究方向：中藥分析；Tel：(0871)66226009-8201，E-mail：youwanyan@sohu.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.017

2016-11-17)

*[