蔣超，李軍德，袁媛，金艷，趙玉洋

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700)

·專(zhuān)題·

虻蟲(chóng)的PCR-RFLP鑒別研究△

蔣超，李軍德，袁媛*，金艷，趙玉洋

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京100700)

目的：建立簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的虻蟲(chóng)DNA分子標(biāo)記鑒別方法。方法：擴(kuò)增并分析虻蟲(chóng)及7種常見(jiàn)偽品的細(xì)胞色素C氧化酶I亞基基因(COI)序列，根據(jù)差異片段設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶酶切長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)引物，使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒別。結(jié)果：引物對(duì)MengChong-Dig.F/MengChong-Dig.R可擴(kuò)增虻蟲(chóng)及其偽品COI序列，產(chǎn)生約490bp條帶，限制性?xún)?nèi)切酶DraI可以識(shí)別虻蟲(chóng)及其偽品的差異序列，僅虻蟲(chóng)的CO I片段可被酶切形成兩個(gè)片段，從而特異性鑒別是否為虻蟲(chóng)。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的PCR-RFLP可以作為虻蟲(chóng)的DNA鑒定方法。

虻蟲(chóng)；聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶酶切長(zhǎng)度多態(tài)性；分子鑒定；CO I序列

虻蟲(chóng)為虻科動(dòng)物復(fù)帶虻TabanusbivittatusMatsumura等的雌蟲(chóng)體(2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有調(diào)經(jīng)破血、消癥軟堅(jiān)的功能。中醫(yī)臨床用于經(jīng)閉、瘀血作痛、跌仆損傷等病癥[1]。虻蟲(chóng)雌蟲(chóng)吸食牛、馬等動(dòng)物血液，亦吸食人類(lèi)血液。虻蟲(chóng)為少常用中藥，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，個(gè)體化動(dòng)物養(yǎng)殖減少，虻蟲(chóng)資源蘊(yùn)藏量處于下降趨勢(shì)。市場(chǎng)上虻蟲(chóng)類(lèi)基源動(dòng)物來(lái)源也日趨復(fù)雜，除復(fù)帶虻外，同科虻屬、黃虻屬、麻虻屬、瘤虻屬多種虻蟲(chóng)也廣泛應(yīng)用。同時(shí)，作者對(duì)玉林、安國(guó)、亳州等大型藥材市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蜜蜂科昆蟲(chóng)中華蜜蜂ApisceranaFabricius、意大利蜜蜂A.melliferaligusticaSpin.，熊蜂屬(Bombus)昆蟲(chóng)，胡蜂科(Vespidae)昆蟲(chóng)的各類(lèi)成蟲(chóng)炮制后與虻蟲(chóng)形態(tài)相似，常充偽虻蟲(chóng)出售，甚至蠅科(Muscidae)家蠅MuscadomesticaLinnaeus、麻蠅科(Sarcophagidae)麻蠅、麗蠅科(Calliphoridae)麗蠅等多種蠅類(lèi)也常摻雜其中，嚴(yán)重影響了藥材質(zhì)量。目前虻蟲(chóng)一般通過(guò)形態(tài)學(xué)和顯微鑒定[2-3]，對(duì)于缺頭少尾的虻蟲(chóng)市售藥材鑒定困難，亟待客觀化和標(biāo)準(zhǔn)化。

近20年來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已應(yīng)用于中藥的真?zhèn)舞b定與質(zhì)量評(píng)價(jià)等相關(guān)研究[4-6]。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性?xún)?nèi)切酶酶切長(zhǎng)度多態(tài)性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)將PCR與DNA序列分析相結(jié)合，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的片段，以合適的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)目的片段進(jìn)行RFLP分析，從而產(chǎn)生特定酶切圖譜。PCR-RFLP及其變種已廣泛用于動(dòng)植物中藥的真?zhèn)舞b別[7-10]，2015版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的川貝母PCR分子鑒別方法也為本法。本研究將我國(guó)常見(jiàn)的11種虻蟲(chóng)與7種市場(chǎng)常見(jiàn)偽品進(jìn)行PCR-RFLP鑒定，以期為中藥虻蟲(chóng)藥材的分子鑒定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器

PCR儀：VeritiTM型(AppliedBiosystem公司)、GeneAmp9700型(AppliedBiosystem公司)、PTC-100型(Gene公司)；5810R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；VORTEX-2GENIE漩渦震蕩儀(Scientificindustries公司)；PowerPacTM型電泳儀(Bio-Rad公司)；HE99X-15-1.5型電泳槽(Hoefer公司)；SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)(GENE公司)。

1.2材料

選取來(lái)自于不同產(chǎn)地的12種虻蟲(chóng)及7類(lèi)偽品共143份材料進(jìn)行PCR-RFLP鑒別研究。虻蟲(chóng)類(lèi)樣品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院許榮滿研究員提供并鑒定，其余樣品采自安徽亳州、廣西玉林、成都荷花池等藥材市場(chǎng)，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料詳表

1.3試劑

Wizard?SVGenomicDNAPurificationSystem試劑盒(Promega公司)；TaqDNA聚合酶：ExTaq(Takara公司)、SpeedStarHSTaq(Takara公司)、Q5TaqDNA聚合酶(NEB公司)；瓊脂糖(Promega公司)；10000×Genegreen核酸染料(TianGen公司)；DL2000DNAMarker(Takara公司)；DraI限制性?xún)?nèi)切酶(NEB公司、Takara公司、Thermo公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1引物設(shè)計(jì)

2.1.1虻蟲(chóng)序列獲得 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中下載虻蟲(chóng)(DQ983533.1、DQ631993.1)及人(JN034122.1)、豬(JN850781.1)、牛(JX218067.1)、羊(KT750038.1)等動(dòng)物的COI序列，使用ClustalW程序進(jìn)行多重序列比對(duì)，選擇虻蟲(chóng)特異性序列區(qū)域，使用PremierPrimer5.0(http：//www.premierbiosoft.com/primerdesign/)設(shè)計(jì)特異性PCR引物。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為500～700bp，Tm值為55～65℃。引物命名為MengChong-1.F和MengChong-1.R，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見(jiàn)表2。使用虻蟲(chóng)特異性PCR引物擴(kuò)增收集的虻蟲(chóng)及其偽品材料，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物使用Sanger測(cè)序法進(jìn)行雙向測(cè)序，序列經(jīng)CodonCodeAligner5.1.2拼接后用于酶切位點(diǎn)分析。

2.1.2酶切位點(diǎn)分析 使用ClustalW程序?qū)y(cè)序獲得的虻蟲(chóng)序列和虻蟲(chóng)偽品序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，尋找其差異區(qū)域，使用在線軟件WatCut(http：//watcut.uwaterloo.ca/template.php?act=snp_new)分析正偽品間差異酶切位點(diǎn)，尋找正偽品間具有差異的單一酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR-RFLP分析。PCR-RFLP分析的擴(kuò)增引物通過(guò)PremierPrimer5.0設(shè)計(jì)，調(diào)整上下游引物位置，使擴(kuò)增產(chǎn)物位于300～500bp，引物命名為MengChong-Dig.F和MengChong-Dig.R，見(jiàn)表2。

2.2基因組總DNA的提取

取虻蟲(chóng)類(lèi)樣品，使用Retsch MM400球磨粉碎至能過(guò)80目篩，取10mg粉末，使用Wizard?SV Genomic DNA Purification System試劑盒按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取。

2.3PCR-RFLP分析

2.3.1PCR擴(kuò)增 使用引物MengChong-Dig.F和MengChong-Dig.R對(duì)虻蟲(chóng)及其混偽品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在200μL離心管中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)總體積為25μL，包括10×PCR buffer2.5μL、dNTP(2.5mmol·L-1)1.5μL、Taq DNA聚合酶(5U·L-1)0.4μL和DNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)在VeritiTM型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序見(jiàn)表2。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL，加入2μL6×Loading buffer(Takara公司)，混勻后于Genegreen染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

表2 引物及PCR反應(yīng)條件

2.3.2 RFLP分析 另取虻蟲(chóng)及其混偽品PCR產(chǎn)物進(jìn)行RFLP分析，酶切反應(yīng)體系為20 μL，包含10×Buffer 2 μL、PCR產(chǎn)物15 μL、DraI限制性?xún)?nèi)切酶(10 U·μL-1)0.5 μL、dd H2O 2.5 μL，酶切反應(yīng)在37 ℃水浴反應(yīng)1 h。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，加入2 μL 6× Loading buffer(Takara 公司)，混勻后于Genegreen染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、成像。

2.3.3條件考察 引物MengChong-Dig.F和MengChong-Dig.R對(duì)虻蟲(chóng)及其混偽品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用DraI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行RFLP分析，并分別考察退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)、模板DNA濃度、變性和退火時(shí)間、Taq種類(lèi)、不同PCR儀、不同品牌DraI限制性?xún)?nèi)切酶、酶切時(shí)間對(duì)PCR反應(yīng)穩(wěn)定性的影響。

3 結(jié)果與分析

3.1虻蟲(chóng)PCR-RFLP引物的設(shè)計(jì)

使用引物MengChong-1.F和MengChong-1.R擴(kuò)增虻蟲(chóng)及其偽品東方蜜蜂、西方蜜蜂、熊蜂、胡蜂、家蠅、麻蠅、麗蠅CO I序列，序列比對(duì)后進(jìn)行SNP-RFLP分析，結(jié)果表明，在序列263-267位存在T/C、T/A、A/T等SNP位點(diǎn)，其中虻蟲(chóng)分別為T(mén)、T、A，此位點(diǎn)位于DraI限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列(5′-TTTAAA-3′)上，使得虻蟲(chóng)可被切開(kāi)，混偽品無(wú)法切開(kāi)，并且此位點(diǎn)在CO I序列唯一，見(jiàn)圖1。

圖1 虻蟲(chóng)PCR-RFLP引物設(shè)計(jì)結(jié)果

3.2虻蟲(chóng)PCR-RFLP分析

對(duì)12種虻蟲(chóng)及7類(lèi)偽品使用虻蟲(chóng)鑒別引物進(jìn)行擴(kuò)增，正偽品均獲得496bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。利用限制性?xún)?nèi)切酶DraI進(jìn)行酶切，虻蟲(chóng)序列具TTTAAA酶切位點(diǎn)，而產(chǎn)生265bp和231bp的兩條條帶，偽品因存在SNP位點(diǎn)導(dǎo)致酶切位點(diǎn)丟失，酶切前后條帶不變，見(jiàn)圖2。

注：M.DL2000 Marker(條帶大小自下而上依次為100、250、500、750、1000、2000 bp)；1～4.復(fù)帶虻；5.廣西虻；6.類(lèi)柯虻；7.范式斑虻；8.中華斑虻；9.浪滄江麻虻；10.浙江虻；11.佛光虻；12.原野虻；13.杭州虻；14.短小瘤虻；15～16.中華蜜蜂；17～18.意大利蜜蜂；19.胡蜂；20.熊峰；21～22.家蠅；23.麻蠅；24.麗蠅。圖2 使用PCR鑒別不同批次虻蟲(chóng)

3.3條件考察

PCR擴(kuò)增和限制性?xún)?nèi)切酶酶切均可能影響虻蟲(chóng)鑒別效果，本文對(duì)影響PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵因素退火溫度、循環(huán)數(shù)、DNA濃度以及影響酶切結(jié)果的限制性?xún)?nèi)切酶時(shí)間等進(jìn)行系統(tǒng)考察，同時(shí)考察篩選的條件對(duì)不同TaqDNA聚合酶、不同內(nèi)切酶及不同PCR擴(kuò)增儀的耐受性，結(jié)果表明，退火溫度位于52～58℃，循環(huán)數(shù)30～40、DNA模板濃度8～200ng·μL-1、Taq酶用量在0.5～2U時(shí)、酶切時(shí)間在15min～4h時(shí)均可準(zhǔn)確鑒別虻蟲(chóng)及其常見(jiàn)偽品，見(jiàn)表3。在此條件下對(duì)不同保真度的Taq酶、不同型號(hào)PCR儀以及不同品牌DraI限制性?xún)?nèi)切酶均具有穩(wěn)健性；退火溫度過(guò)高(>58℃)、循環(huán)數(shù)過(guò)少(<30)、模板濃度過(guò)低(<8ng·μL-1)易產(chǎn)生假陰性結(jié)果；而酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)產(chǎn)生星活性，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，見(jiàn)表3。

表3 虻蟲(chóng)PCR-RFLP條件考察結(jié)果

3.4方法的適用性考察

采用上述確定的優(yōu)化體系，對(duì)102批虻蟲(chóng)樣品及41批偽品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同種類(lèi)、來(lái)源虻蟲(chóng)均可產(chǎn)生約490bp條帶，經(jīng)DraI酶切后，正品均產(chǎn)生大小約為230bp和260bp的兩條條帶，而虻蟲(chóng)偽品均無(wú)法酶切，表明該體系能穩(wěn)定、準(zhǔn)確地鑒別虻蟲(chóng)。

4 分析與討論

虻蟲(chóng)為少常用藥材，歷來(lái)有多種來(lái)源，《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的虻蟲(chóng)來(lái)源為復(fù)帶虻等；《全國(guó)中草藥匯編》規(guī)定為復(fù)帶虻或鹿虻T.chrysurusLoew；《中藥大辭典》規(guī)定為虻科昆蟲(chóng)復(fù)帶虻或其他同屬昆蟲(chóng)；而《中華本草》則規(guī)定為華虻T.mandarinusSchiner及其同屬昆蟲(chóng)以及黃虻屬雙斑黃虻(復(fù)帶虻)。說(shuō)明虻蟲(chóng)為多來(lái)源性藥材，多種虻蟲(chóng)均可入藥。隨著資源的稀缺，市場(chǎng)上虻蟲(chóng)主流藥材基源不斷流變，早期以華虻為主流，后發(fā)展為華虻、姚虻、復(fù)帶虻[3，11]。近期李軍德等對(duì)全國(guó)多個(gè)省份商品藥材樣品鑒定表明，除云南、北京、遼寧、內(nèi)蒙古約有2%～5%的復(fù)帶虻T.bivlttatus外，其余主要為漢斯虻、廣西虻、杭州虻等[12]。作者近期對(duì)全國(guó)幾個(gè)大型中藥市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)及臨床使用不區(qū)分虻蟲(chóng)種類(lèi)，偽品主要為中華蜜蜂、意大利蜜蜂、熊峰、麻蠅等形態(tài)類(lèi)似的昆蟲(chóng)，這些昆蟲(chóng)不具有破血消癥的功能，需要與虻蟲(chóng)進(jìn)行鑒別。為達(dá)到準(zhǔn)確鑒定虻蟲(chóng)的目的，本研究收集了杭州虻、廣西虻等12種市場(chǎng)常見(jiàn)虻蟲(chóng)品種及主要偽品進(jìn)行DNA分子鑒定研究。

為建立DNA分子鑒別方法，首先需要進(jìn)行分子標(biāo)記的獲得與篩選。由于虻蟲(chóng)為吸血性昆蟲(chóng)，常吸食牛、馬等動(dòng)物血液，直接使用CO I片段通用引物無(wú)法獲得虻蟲(chóng)序列。本研究首先設(shè)計(jì)一對(duì)虻蟲(chóng)類(lèi)特異性引物對(duì)虻蟲(chóng)及膜翅目、雙翅目部分昆蟲(chóng)進(jìn)行了CO I基因的擴(kuò)增和測(cè)序，發(fā)現(xiàn)僅虻類(lèi)昆蟲(chóng)含DraI限制酶識(shí)別序列，從而建立PCR-RFLP鑒別方法用于虻蟲(chóng)與混偽品的鑒別。為保證PCR-RFLP方法的穩(wěn)定性，筆者對(duì)退火溫度、PCR循環(huán)次數(shù)、DNA濃度、引物用量、DNA聚合酶用量、PCR儀和DNA聚合酶等進(jìn)行考察，并同時(shí)考察了酶切結(jié)果的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在長(zhǎng)時(shí)間酶切的情況(4h以上)下可能產(chǎn)生星活性，導(dǎo)致偽品出現(xiàn)部分的酶切，但不會(huì)影響判別結(jié)果，見(jiàn)圖3。使用該方法對(duì)市售的73批虻蟲(chóng)進(jìn)行鑒別均能獲得正確的酶切鑒別結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)將PCR-RFLP方法引入虻蟲(chóng)的真?zhèn)舞b別中，表明該技術(shù)具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，能有效鑒別虻蟲(chóng)及其偽品。同時(shí)該方法對(duì)樣品要求低，對(duì)炮制、倉(cāng)儲(chǔ)樣品均具有良好的鑒別效果，有望成為商品虻蟲(chóng)的特異性鑒別方法。

注：M.DL2000 Marker(條帶大小自下而上依次為100、250、500、300、400、500 bp)；1.復(fù)帶虻；2.廣西虻；3.中華斑虻；4.中華蜜蜂；5.胡蜂；6.家蠅；7.麻蠅；N.陰性對(duì)照(以dd H2O為模板)。圖3 酶切時(shí)間對(duì)虻蟲(chóng)鑒別結(jié)果的影響

[1] 劉大有，徐莉，李莉，等.虻蟲(chóng)的研究進(jìn)展[J].中草藥，1997，28(7)：440-441.

[2] 李軍德，黃璐琦，馮學(xué)鋒，等.虻蟲(chóng)藥材性狀顯微特征鑒

別研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35(16)：2057-2060.

[3] 姜波，趙榮國(guó)，高士賢.五種虻蟲(chóng)藥材的性狀鑒別[J].中藥材，1992，15(3)：21-24.

[4] 黃璐琦，袁媛，袁慶軍，等.中藥分子鑒定發(fā)展中的若干問(wèn)題探討[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(19)：3663-3667.

[5] 黃璐琦，唐仕歡，李軍德，等.動(dòng)物藥材分子鑒定研究策略[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(3)：234-236.

[6] 王川易，郭寶林，肖培根.中藥分子鑒定方法評(píng)述[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(3)：237-242.

[7] 張婷，徐珞珊，王崢濤，等.藥用植物束花石斛、流蘇石斛及其形態(tài)相似種的PCR-RFLP鑒別研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(8)：728-733.

[8] 蔣超，黃璐琦，袁媛，等.酶切-熔解曲線分析：一種新的SNP分型方法及其在中藥材鑒定中的應(yīng)用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49(4)：558-565.

[9] 張學(xué)維，馬長(zhǎng)華，白根本.塔里木馬鹿特異性PCR及PCR-RFLP鑒定[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(3)：570-573.

[10]Jiang C，Yuan Y，Chen M，et al.Molecular authentication of multi-species honeysuckle tablets[J].Genetic Mol Res，2013，12(4)：4827-4835.

[11]來(lái)復(fù)根.中藥虻蟲(chóng)的鑒別[J].浙江藥學(xué)，1986，3(4)：13-15.

[12]李軍德，黃璐琦，陳敏，等.中藥虻蟲(chóng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(8)：228-230.

Molecular Identification of Medicinal Gadfly and Its Adulterants by PCR-RFLP Analysis

JIANG Chao，LI Junde，YUAN Yuan*，JIN Yan，ZHAO Yuyang

(National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100700，China)

Objective：To establish a convenient and effective DNA molecular identification method for medicinal gadfly.Methods：CO I sequences of gadfly and 7 adulterants were amplified and analyzed，PCR-RFLP primers were designed based on differential fragment，and restriction enzyme digest was further conducted to identify gadfly and the 7 adulterants.Results：Approximately 490 bp specific fragment bands from medicinal gadfly and its adulterants were amplified by MengChong-Dig.F/MengChong-Dig.R.DraI restriction endonuclease could only digest the amplified fragment of medicinal gadfly into two smaller pieces，therefore identifying medicinal gadfly specifically.Conclusion：The methods of PCR-RFLP developed in this research is an accurate identification method for medicinal gadfly.

Medicinal gadfly；PCR-RFLP；molecular authentication；CO I sequence

中醫(yī)藥行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201407003)

] 袁媛，研究員，研究方向：中藥功能基因組研究及中藥分子鑒定研究；Tel：(010)64014411-2956，E-mail：y_yuan0732@gmail.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.003

2016-08-14)

*[