吳磊，戴國(guó)梁，王瓊，陸超

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

·基礎(chǔ)研究·

清熱養(yǎng)心顆粒對(duì)大鼠灌服環(huán)孢素藥動(dòng)學(xué)影響△

吳磊，戴國(guó)梁，王瓊，陸超*

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

目的：研究清熱養(yǎng)心顆粒(QG)對(duì)環(huán)孢素(cyclosporine A，CsA)的藥代動(dòng)力學(xué)的影響。方法：超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定大鼠全血中CsA濃度，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組單獨(dú)灌胃給予CsA，實(shí)驗(yàn)組灌胃給予清熱養(yǎng)心顆粒及CsA。DAS 3.0藥動(dòng)學(xué)軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：CsA單獨(dú)給藥、CsA-清熱養(yǎng)心顆粒聯(lián)合給藥，CsA在體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)模型均為一室開放模型，聯(lián)合給藥后，CsA的t1/2顯著延長(zhǎng)，AUC顯著增大。結(jié)論：清熱養(yǎng)心顆?？蓽p慢CsA在體內(nèi)的代謝過程。

清熱養(yǎng)心顆粒；環(huán)孢素；大鼠；藥代動(dòng)力學(xué)；超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜

環(huán)孢素(cyclosporine A，CsA)是一種臨床常用的免疫抑制劑，適用于預(yù)防同種異體腎、肝、心、骨髓等器官或組織移植所發(fā)生的排斥反應(yīng)。CsA的最小有效劑量到中毒劑量之間的劑量差值越窄，藥物安全性越差。藥物濃度過高會(huì)引起腎毒性、高血壓等不良反應(yīng)，但是不完全和不規(guī)則的口服吸收又會(huì)引起毒性的增加或免疫治療失敗[1-2]。大多數(shù)藥物和食物會(huì)通過調(diào)控P-gp或CYP3A等方面來影響CsA的治療全過程，一些鈣離子通道拮抗劑抑制P-gp和CYP3A從而使病人口服CsA后體內(nèi)血藥濃度的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積和峰濃度有了顯著的提高[3-5]。

清熱養(yǎng)心顆粒(QG)的處方是由金銀花、甘草、山豆根等多味藥組成，是江蘇省中醫(yī)院專家總結(jié)了傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)家治療病毒性心肌炎的經(jīng)驗(yàn)方藥后，臨床多年嘗試研制而成，具有清熱解毒、養(yǎng)心安神功能。金銀花自古被中醫(yī)譽(yù)為清熱解毒的良藥，其酚酸類成分具有顯著的抗炎、抗氧化、抗凝血等作用[6-7]。甘草性溫，其活性成分甘草次酸有著一定的抗炎、抗病毒的功效[8]。百合主治勞嗽、咳血、虛煩驚悸等癥，活性成分薯蕷皂苷元有效提高氧自由基清除能力，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能進(jìn)行改善[9]?？鄥⑽犊啵院?，具有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的作用，其活性成分氧化苦參堿臨床使用廣泛，對(duì)心肌缺血和梗死有保護(hù)作用[10-11]。臨床上，病毒性心肌炎患者在服用清熱養(yǎng)心顆粒時(shí)常會(huì)與環(huán)孢素同用，發(fā)現(xiàn)療效顯著。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行研究，臨床使用中等效治療量作為參照，對(duì)單劑量給予清熱養(yǎng)心顆粒后大鼠體內(nèi)CsA藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的變化情況進(jìn)行考察，以及清熱養(yǎng)心顆粒在口服CsA的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程是否產(chǎn)生影響進(jìn)行研究，進(jìn)一步判斷清熱養(yǎng)心顆粒是否為影響CsA的血藥濃度的主要因素，為臨床使用研究提供更多的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

清熱養(yǎng)心顆粒(江蘇省中醫(yī)院制劑，10 g/袋，批號(hào)：20160501)；環(huán)孢素軟膠囊(華北制藥股份有限公司，25 mg/粒，批號(hào)：160110)；對(duì)照品CsA(浙江瑞邦藥業(yè)有限公司，批號(hào)：10-140317，含量：99.3%)；環(huán)孢素D(上海同田生物技術(shù)股份有限公司，含量為95%，批號(hào)：13060821)。水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent G6430UHPLC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司，所配超高效液相儀為Agilent 1290)；MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(version B.05.00)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict-Q5純水機(jī)(法國(guó)Millipore公司)；Labconco離心濃縮儀(美國(guó)Labconco公司)；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)(德國(guó)Heraeus公司)。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠16只，雌雄各半，體重約250～270 g，由南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2014-0001。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件

Phenomenex Gemini C18色譜柱(100 mm×2.0 mm，3 μm)；流動(dòng)相：甲醇-2 mmol·L-1甲酸銨水溶液(75∶25)；流速：400 μL·min-1；柱溫：60 ℃。離子源：ESI；離子化模式：正離子；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；毛細(xì)管電壓：4000 V；干燥氣溫度：400 ℃；CsA的Fragmentor及CE值分別為100、15 V；內(nèi)標(biāo)環(huán)孢素D的Fragmentor及CE值分別為110、10 V；檢測(cè)對(duì)象：CsAm/z220.2→m/z202.9；環(huán)孢素Dm/z234.3→m/z216.9。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

取對(duì)照品CsA適量，精密稱定，甲醇作為溶劑，將其稀釋成0.05、0.25、0.5、2.5、5、10、50 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液。放冰箱保存(4 ℃)，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制

取對(duì)照品環(huán)孢素D適量，精密稱定，甲醇作為溶劑，將其稀釋成1.1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)物溶液，放冰箱保存(4 ℃)，備用。

2.4 全血樣品處理

取全血100 μL，精密吸取，加入氟化鈉10 mg，內(nèi)標(biāo)溶液10 μL(1.1 μg·mL-1)，渦旋30 s，加入乙醚1 mL，渦旋3 min，混合，4 000 r·min-1離心10 min后吸取上清液乙醚層，40 ℃氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL 75%的甲醇水溶液進(jìn)行復(fù)溶，渦旋振蕩2 min后，冷凍高速離心機(jī)(12 000 r·min-1)離心10 min，吸取上清液，5 μL分析進(jìn)樣。

2.5 藥代動(dòng)力學(xué)研究

大鼠16只(雌雄各半)，每組隨機(jī)分得8只，并標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，在大鼠給藥之前12 h禁食不禁水。實(shí)驗(yàn)組同時(shí)灌胃給予QG(100 mg·kg-1)、與CsA(10 mg·kg-1)；對(duì)照組只灌胃給予CsA(10 mg·kg-1)。2組大鼠分別于給藥前及給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、32、48 h從眼底靜脈叢采血約0.2 mL。將全血樣品于4 ℃保存。

2.6 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)測(cè)得的血藥濃度-時(shí)間，采用DAS 3.0處理與擬合，獲得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。采用SPSS 15.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

在色譜檢測(cè)下，CsA和環(huán)孢素D的保留時(shí)間約為1.85 min和1.71 min(見圖1、2)。CsA和內(nèi)標(biāo)物環(huán)孢素D互不干擾，峰形較好，無雜峰干擾，基線平穩(wěn)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取空白全血100 μL，加入CsA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，配制成相當(dāng)于CsA全血質(zhì)量濃度分別為0.005、0.025、0.05、0.25、0.5、1、5 μg·mL-1的全血樣品。取5 μL分析，以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對(duì)全血質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得CsA的回歸方程：Y=0.456 2X-0.346 1(r=0.994 9)，定量下限是5 ng·mL-1。

注：A.空白全血樣品；B.空白全血加入CsA (0.5 μg·mL-1)及環(huán)孢素D(1.1 μg·mL-1)；C.大鼠同時(shí)口服QG及CsA 6 h后全血樣品；下同。圖1 CsA的UHPLC-MS/MS離子流圖

注：A.空白全血樣品；B.空白全血加入CsA (0.5 μg·mL-1)及環(huán)孢素D(1.1 μg·mL-1)；C.大鼠同時(shí)口服QG及CsA 6 h后全血樣品。圖2 環(huán)孢素D(內(nèi)標(biāo))的UHPLC-MS/MS離子流圖

3.3 準(zhǔn)確度和精密度

精密吸取空白全血100 μL，制備CsA 3個(gè)不同濃度(CsA全血質(zhì)量濃度為0.01、0.5、4 μg·mL-1)的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行5份，連續(xù)3 d。根據(jù)隨性標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度。通過實(shí)測(cè)濃度計(jì)算出精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示：CsA日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為96.2%～105.6%(RSD≤7.1%，n=5)和94.2%～107.3%(RSD≤7.9%，n=15)，結(jié)果經(jīng)鑒定符合分析要求。

3.4 提取回收率

取空白全血100 μL，配制3.3項(xiàng)下低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度含藥全血質(zhì)控樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理后分析，以全血中CsA的峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液中CsA峰面積的比值計(jì)算出上述3種質(zhì)量濃度的提取回收率，每個(gè)濃度平行做5份。經(jīng)UHPLC-MS/MS測(cè)定后，由低到高3個(gè)質(zhì)量濃度下CsA的提取回收率分別為：(71.4%±2.4%)、(72.3%±3.1%)和(71.7%±2.7%)。同時(shí)得到內(nèi)標(biāo)的提取回收率為(69.6%±2.8%)。

3.5 穩(wěn)定性考察

取空白全血100 μL，配制3.3項(xiàng)下3個(gè)質(zhì)量濃度含藥全血質(zhì)控樣品，按上述樣品的處理方法處理。分析物置溶液中24 h(室溫)、將含藥的全血樣品置冰箱(-20 ℃)凍融3次、置冰箱(-40 ℃)長(zhǎng)期冷凍28 d，對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行穩(wěn)定性考察，樣品平行3份。結(jié)果顯示，24 h后(室溫)環(huán)孢素質(zhì)量濃度的RSD均小于8.3%，冰箱(-40 ℃)保存28 d質(zhì)量濃度的RSD 均小于9.6%，環(huán)孢素經(jīng)3個(gè)凍融期的質(zhì)量濃度RSD均小于7.8%。

3.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

取1.5 mL EP管若干，分別精密吸取質(zhì)量濃度為0.1、5、40 μg·mL-1的CsA對(duì)照品溶液各10 μL，同時(shí)加入10 μL環(huán)孢素D溶液(內(nèi)標(biāo))，再加入純水補(bǔ)足至100 μL，渦旋震蕩30 s，取5 μL溶液進(jìn)UHPLC-MS/MS，測(cè)定分析物及內(nèi)標(biāo)峰面積并定義為A1。除不加環(huán)孢素D溶液(內(nèi)標(biāo))外，另按2.4項(xiàng)下方法制備空白全血樣品若干，氮?dú)獯蹈珊笸咸幚恚瑴y(cè)定分析物及內(nèi)標(biāo)峰面積并定義為A2?；|(zhì)效應(yīng)ME(%)等于兩者之間的比值(A2/A1×100%)。3個(gè)不同濃度的CsA在全血樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為88.6%、92.3%、91.7%(n=3)，環(huán)孢素D(內(nèi)標(biāo))基質(zhì)效應(yīng)為93.2%(n=9)。

3.7 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)

表 1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中大鼠體內(nèi)環(huán)孢素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注：* P < 0.05。圖3 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中大鼠體內(nèi)環(huán)孢素 的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

4 討論

目前，一般采用熒光偏振免疫分析法檢測(cè)全血中CsA的濃度，但成本較高。本實(shí)驗(yàn)改用UHPLC-MS/MS法測(cè)定全血樣品濃度，經(jīng)過方法學(xué)確證后，符合生物樣品分析方法的要求，并且該方法靈敏度高、分析時(shí)間短，可用于臨床上大批樣品的連續(xù)測(cè)定。

相關(guān)中藥與CsA藥物相互作用的研究已有報(bào)道，研究表明，人體同時(shí)服用鹽酸小檗堿與CsA時(shí)，可促進(jìn)CsA的吸收，從而提高CsA的生物利用度[12-13]。清熱養(yǎng)心顆粒中黃連是全方的君藥，而鹽酸小檗堿是黃連主要活性成分，由此推測(cè)清熱養(yǎng)心顆粒中的鹽酸小檗堿促進(jìn)了CsA的體內(nèi)吸收，但確切的作用機(jī)制則有待進(jìn)一步研究。

由于CsA治療窗窄，毒性較大，體內(nèi)CsA濃度的升高可能會(huì)引起嚴(yán)重不良反應(yīng)。因此，臨床上同時(shí)使用清熱養(yǎng)心顆粒與CsA時(shí)，應(yīng)密切監(jiān)測(cè)CsA在血液中的濃度及人體相關(guān)生化指標(biāo)，避免不良反應(yīng)的發(fā)生。

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EffectofQingreyangxinGranuleonPharmacokineticsofIntragastricallyAdministeredCyclosporineAinRats

WULei，DAIGuoliang，WANGQiong，LUChao*

(AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210029，China)

Objective：To investigate the pharmacokinetic effect of Qingreyangxin granule (QG) on cyclosporine A (CsA) in rats.Methods：Concentration of cyclosporine A in rat whole blood was detected by UHPLC-MS/MS after rats were oral administration of QG or QG combined with CsA.Pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 3.0 pharmacokinetic software.Results：Invivopharmacokinetic models of CsA.were one-compartment open models in both of the QG group and the QG combined with CsA group.After compatibility，CsA showed a significant longer int1/2，with significant increase in AUC.Conclusion：QG can reduce metabolic process of CsAinvivo.

Qingreyangxin granule；cyclosporine A；rat；pharmacokinetics；UHPLC-MS/MS

江蘇省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(JD201512)；江蘇省藥學(xué)會(huì)-奧賽康醫(yī)院藥學(xué)基金(A201607)

] 陸超，碩士，主管中藥師，研究方向：中藥臨床藥代動(dòng)力學(xué)；E-mail：sinkly228@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.012

2016-10-18)

*[