周本宏，汪靜，吳玥，易慧蘭，譚珺，張紅盼

(1.武漢大學 人民醫(yī)院 藥學部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學 藥學院，湖北 武漢 430072)

·基礎研究·

地榆鞣質在大鼠尿液中代謝產物分析

周本宏1，2*，汪靜1，吳玥1，易慧蘭1，譚珺2，張紅盼1

(1.武漢大學 人民醫(yī)院 藥學部，湖北 武漢 430060；2.武漢大學 藥學院，湖北 武漢 430072)

目的：采用HPLC-Q-TOF/MS研究地榆鞣質在尿液中的代謝產物。方法：收集給藥后大鼠尿樣，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫，在飛行時間質譜負離子模式下掃描，利用TOF/MS得到的準確相對分子質量及一級、二級質譜信息，對照化學成分數據庫，鑒定地榆鞣質在大鼠尿液中可能的代謝產物，結合相關文獻，推測地榆鞣質在大鼠體內可能的代謝途徑。結果：從大鼠尿液中共檢測到9個代謝產物，分別為：M1(Pyrogallol)、M2(Urolithin B)、M3(Methyl-Urolithin C)、M4(Urolithin A)、M5(Methyl-Urolithin A)、M6(Urolithin C-Glucuronidation)、M7(Dimethy-EA)、M8(Urolithin M5)、M9(沒食子酸)，其中M9為原型藥物。結論：地榆鞣質經灌胃給予大鼠后，先經過I相代謝反應生成尿石素等極性偏小的代謝產物吸收進入體內，再發(fā)生II相結合反應，與葡萄糖醛酸等結合，變成極性較大的物質，從尿液排除體外，進一步闡明了地榆鞣質在體內發(fā)揮藥理作用的機理。

地榆；鞣質；代謝產物；尿石素；液質聯用

地榆是我國傳統的中藥，是薔薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.或長葉地榆SanguisorbaofficinalisL.var.longifolia的干燥根莖，性微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡的功效，臨床上用于便血、痣血、水火燙傷等的治療[1]。隨著人們對地榆深入研究，發(fā)現地榆中主要含有鞣質(約17%)、三萜皂苷(約2.0%～4.1%)和黃酮(約15%)三大類化學成分，其中鞣質類成分主要為沒食子酸、鞣花鞣質等可水解鞣質和原花青素類縮合鞣質[2]，是一類生物活性較強的物質，對其藥理作用的發(fā)揮起著重要作用。研究證實地榆鞣質具有抗肝癌細胞增殖[3]、抑制腎小管上皮細胞增殖[4]、改善環(huán)磷酸酰胺誘導的小鼠骨髓抑制[5]等作用。藥物的活性與其在體內的代謝轉運密切相關，目前尚未見地榆鞣質代謝成分的報道，本研究采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS對地榆鞣質在尿液中代謝產物進行初步鑒別，進而探討可能的代謝過程，有助于闡明其發(fā)揮藥理活性的物質基礎，為地榆鞣質的進一步研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

HPLC1200-Q-TOF 6520MS(Agilent，USA)，配有電噴霧離子源(ESI)；UV-1800紫外分光光度計(SHIMADZU CORPORATION)；HPD-400大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)；Generik C18固相萃取小柱(Sepax，200 mg/3mL)；SK5200H型超聲波清洗儀(上?？茖С晝x器有限公司)；W2-100S型旋轉蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；ALPHAI-4/RZ-2冷凍干燥機(德國Martin Christ)。

1.2 藥材

生地榆飲片(湖北盛德堂中藥飲片股份有限公司)，經武漢大學張洪教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部標準；沒食子酸(成都行標生物科技有限公司，純度≥98%)；甲醇、乙腈(Agilent，HPLC級)，水(娃哈哈純凈水)，磷鉬鎢酸(自制)，乙醇、丙酮等試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

雌性SD大鼠10只，體重為220～260 g，由湖北省實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2008-0005。動物飼養(yǎng)于武漢大學動物中心SPF級動物房中，適應性喂養(yǎng)一周后開始實驗。

2 方法

2.1 地榆鞣質樣品的制備

干燥生地榆飲片，粉碎機粉碎，稱取適量，加入10倍量的70%丙酮，室溫浸泡過夜，50 ℃下回流提取2次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮除去丙酮，濃縮液冷凍干燥，制備得到地榆粗提取物。經HPD-400大孔吸附樹脂純化，70%乙醇洗脫，洗脫液冷凍干燥，得地榆鞣質提取物(STE)，凍干粉4 ℃冰箱保存，備用[6]。

2.2 動物分組與給藥

雌性SD大鼠10只，隨機分為給藥組和空白組，每組5只，飼養(yǎng)于SPF級動物房中，實驗開始前適應性飼養(yǎng)一周，自由進食飲水。大鼠給藥前禁食12 h，給藥后置于代謝籠中，自由飲水，收集各組尿液。給藥組按400 mg·kg-1劑量灌胃地榆鞣質，空白組給予等量0.9%氯化鈉溶液，收集大鼠給藥后0～8、8～24、24～48 h的尿液，-20 ℃冷凍保存，備用待測[7-9]。

2.3 尿液樣品預處理

低溫解凍尿液，取尿液2 mL，加10 μL 6 mol·L-1HCl酸化，離心，取上清液，過反相C18固相萃小柱(經5 mL甲醇，5 mL水活化)，純水(5 mL)淋洗后，用甲醇(2 mL)洗脫，收集洗脫液，過0.45 μm微孔濾膜，濾液直接進HPLC-ESI-Q TOF MS分析[10]。

2.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mm×2.1 mm，5 μm)；流動相A(水)和B(乙腈)，按程序梯度洗脫(0～15 min，5%～15% B；15～25 min，15%～40% B；25～40 min，40%～45%B；40～55 min，45%～50% B；55～60 min，50%～55% B；60～65 min，55%～60% B；65～75 min，60%～90% B；75～85 min，90%～30% B；85～90 min，30%～5% B)；流速：0.2 mL·min-1；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。

2.5 質譜條件

采用電噴霧(ESI)離子源，負離子模式檢測；毛細管電壓：3500 V；霧化氣壓力：30 Psi(1 Psi=6.895 kPa)；干燥氣流速：10 L·min-1；干燥氣溫度：300 ℃；碎片電壓：125 V。采用全掃描一級質譜、選擇離子二級全掃描質譜方式同時進行，掃描范圍m/z：100～800。

2.6 尿液中代謝產物的鑒別

根據藥物在體內代謝的一般規(guī)律，即Ⅰ相反應和Ⅱ相結合反應，查閱相關文獻，預測地榆鞣質在大鼠體內的代謝產物。運用質譜軟件上自帶的相對分子量計算功能，即輸入分子式計算出相應相對分子質量，算出預測代謝產物的[M-H]-、[M+Cl]-、[M+Br]-的精確分子質量(精確到小數點后5位)。大鼠尿樣過0.45 μm微孔濾膜后，進行HPLC-ESI-Q-TOF-MS分析，得到大鼠空白尿樣和灌胃給藥后尿樣總離子流色譜圖，通過系統自帶的提取離子流色譜(EIC)功能提取出預測代謝產物的[M-H]-、[M+Cl]-、[M+Br]-峰，比較空白和給藥后尿液EIC圖譜，確定給藥后多出來的峰或給藥后峰強度變強的峰為差異峰，由差異峰與預測代謝產物間對比(質量偏差在±5×10-6范圍內)，初步鑒定尿液中代謝產物?？赡艿脑?，進一步對差異峰中離子打碎，做二級質譜，結合二級譜圖分析驗證代謝產物的結構[11-12]。

3 結果

3.1 LC-MS條件的選擇與優(yōu)化

考察了甲醇-水、乙腈-水系統對譜圖的影響，發(fā)現以乙腈為有機相洗脫時，各色譜峰分離效果較好，基線較平穩(wěn)，故選用乙腈-水作為梯度洗脫的流動相。比較了正負離子模式下的總離子流色譜圖，發(fā)現負離子模式下峰容量大，質譜響應更好，故實驗

選擇負離子模式下進行檢測。

3.2 地榆鞣質尿液中代謝產物初步鑒定

大鼠空白尿樣和灌胃給藥后尿樣總離子流色譜圖見圖1。通過提供的精確分子質量和二級碎片信息，在大鼠尿樣中共檢測到9個代謝產物，結果見表1。

注：A.空白尿樣；B.給藥組尿樣。圖1 大鼠空白尿樣和灌胃給藥后尿樣總離子流色譜圖

編號tR/min鑒定結果分子式m/z([M?H]-)m/z([M+Cl]-)實測值理論值偏差實測值理論值偏差M11604PyrogallolC6H6O31250242712502442-121610011M25890Uro?BC13H8O3211040972110400742624701675M331942Methyl?Uro?CC14H10O5257045922570455514429302222M432423Uro?AC13H8O4227035832270349837426301166M539534Methyl?Uro?AC14H10O4241051482410506335327702731M631926Uro?C?GluC19H16O11419061984550381545503866-112M738876Dimethy?EAC16H10O83290290832903029-36836500697M862793Uro?M5C13H8O72750190927501973-2333109964M984302GallicacidC7H6O51690140616901425-11220499092

注：Uro—Urolithin；Glu—Glucuronidation；EA—Ellagic acid。

代謝產物M1：保留時間tR=1.604 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為125.024 27，與預測代謝產物相應的精確分子質量125.024 42對比，初步推測其為Pyrogallol，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z81.034 3，其分子量與M1相比減少了44 Da，可推測M1分子離子失去了一個CO2，產生碎片離子[M-COO-H]-，與文獻報道的Pyrogallol二級質譜碎片一致[13]，進一步證實該代謝產物為焦性沒食子酸(Pyrogallol)(見圖2、3)?？赡艿牧呀馔緩揭妶D4。

圖2 代謝產物M1結構式

注：A.空白尿樣在m/z 125.024 42的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 125.024 42的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=1.604 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖；D.碎片離子m/z 125的二級(MS/MS)質譜圖。圖3 代謝產物M1的質譜圖

圖4 代謝產物M1的裂解途徑

代謝產物M2：保留時間tR=5.890 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為211.040 97，與預測代謝產物相應的精確分子質量211.040 07對比，初步推測其為Uro B，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z166.980 58，其分子量與M2相比減少44 Da，推測M2分子離子失去了一個CO2，產生碎片離子[M-COO-H]-，與文獻[14]報道的代謝產物Uro B二級質譜碎片一致，進一步證實該代謝產物為尿石素B(Urolithin B)(見圖5、6)?？赡艿牧呀馔緩揭妶D7。

圖5 代謝產物M2結構式

注：A.空白尿樣在m/z 211.040 07的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 211.040 07的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=5.890 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖；D.碎片離子m/z 211的二級(MS/MS)質譜圖。圖6 代謝產物M2質譜圖

圖7 代謝產物M2裂解途徑

代謝產物M3：保留時間tR=31.942 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為257.045 92，與預測代謝產物相應的精確分子質量257.045 55對比，初步推測其為Methyl-Uro C，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z242.016 81，與M3相比其分子量減少15 Da，推測分子離子失去一個甲基生成碎片離子[M-CH3-H]-，與文獻[15]報道的代謝產物Methyl-Uro C二級質譜碎片一致，進一步證實該代謝產物為甲基化尿石素C(Methyl-Urolithin C)(見圖8、9)?？赡艿牧呀馔緩揭妶D10。

圖8 代謝產物M3結構式

注：A.空白尿樣在m/z 257.045 55的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 257.045 55的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=31.942 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖；D.碎片離子m/z 257的二級(MS/MS)質譜圖。圖9 代謝產物M3質譜圖

圖10 代謝產物M3裂解途徑

代謝產物M4：保留時間tR=32.423min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為227.035 83，與預測代謝產物相應的精確分子質量227.034 98對比，初步推測其為Uro-A或Iso-Uro-A，同時MS2譜圖中顯示存在碎片離子m/z199.039 47[M-CO-H]-，與文獻報道的代謝產物Uro-A二級質譜碎片一致[14]，進一步證實該代謝產物為尿石素A(Urolithin A)(見圖11、12)?？赡艿牧呀馔緩揭妶D13。

圖11 代謝產物M4結構式

注：A.空白尿樣在m/z 277.034 98的提取離子流色譜圖(EIC)；C.給藥組尿樣在m/z 227.034 98的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=32.455 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖；D.碎片離子m/z 227的二級(MS/MS)質譜圖。圖12 代謝產物M4質譜圖

圖13 代謝產物M4裂解途徑

代謝產物M5：保留時間tR=39.534 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為241.051 48，與預測代謝產物相應的精確分子質量241.050 63對比，初步推測其為Methyl-Uro-A，同時MS2譜圖中顯示碎片離子m/z210.903 96[M-OCH2-H]-，m/z196.986 02[M-COO-H]-與文獻報道的代謝產物Methyl-Uro-A二級質譜一致[14]，進一步證實該代謝產物為甲基化尿石素A(Methyl-Uro-A)(見圖14、15)。可能的裂解途徑見圖16。

圖14 代謝產物M5結構式

注：A.空白尿樣在m/z 241.050 63的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 241.050 63的提取離子流色譜圖(EIC)； C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖；D.碎片離子m/z241的二級(MS/MS)質譜圖。圖15 代謝產物M5的質譜圖

代謝產物M6、M7、M8、M9：因其二級質譜不穩(wěn)定，故只通過分子離子峰與預測代謝產物精確相對分子質量對比，進行初步的判斷。其中M6保留時間tR=31.926 min，ESI/MS分子離子峰[M+Cl]-m/z為455.038 15，與預測代謝產物相應的計算值455.038 66對比，初步推測其為Uro-C-Glur；代謝產物M7 保留時間tR=38.876 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為329.029 08，與預測代謝產物相應的計算值329.030 29對比，初步推測其為Dimethy-EA；代謝產物M8 保留時間tR=62.793 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為275.019 09，與預測代謝產物相應的計算值275.019 73對比，初步推測其為Uro-M5；代謝產物M9 保留時間tR=84.302 min，ESI/MS分子離子峰[M-H]-m/z為169.014 06，與預測代謝產物相應的計算值169.014 25對比，初步推測其為Gallic acid(見圖17～21)。

圖16 代謝產物M5裂解途徑

注：A.空白尿樣在m/z 455.038 66的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 455.038 66的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖。圖18 代謝產物M6的質譜圖

圖17 代謝產物M6、M7、M8、M9結構式

注：A.空白尿樣在m/z 329.030 29的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 329.030 29的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖。圖19 代謝產物M7的質譜圖

注：A.空白尿樣在m/z 275.019 73的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 275.01973的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖。圖20 代謝產物M8的質譜圖

注：A.空白尿樣在m/z 169.014 25的提取離子流色譜圖(EIC)；B.給藥組尿樣在m/z 169.014 25的提取離子流色譜圖(EIC)；C.保留時間tR=39.534 min時，給藥組尿樣EIC圖的一級(MS)質譜圖。圖21 代謝產物M9的質譜圖

4 討論

液相色譜-質譜聯用技術(HPLC-MS)是近些年發(fā)展起來的一種現代分析技術，它以高效液相色譜為分離手段，以質譜為檢測器，既具有液相色譜高分離能力的特性，又具有質譜高靈敏度、高專屬性的優(yōu)點[16]。在藥物代謝轉化研究中，生物樣品中的藥物和代謝產物分離純化、分析和鑒定工作非常重要，傳統的分離純化工作常需借用大孔樹脂、凝膠柱、制備型色譜柱等柱色譜技術來進行，工作量大、耗時、且需要的樣品量大。而生物樣品中藥物及代謝產物往往濃度較低，加上內源性雜質的干擾，使得目標物的分離、分析難度加大，從而對分析方法的靈敏度和特異性提出更高的要求。液質聯用技術為藥物代謝研究提供了強有力的手段，目前HPLC-Q-TOF-MS越來越多地被用于中藥成分及代謝產物的快速檢測[17-18]。

生物樣品具有成分復雜、干擾物多且待測物含量低的特點，故而在對生物樣品進行分析前，需要進行一系列預處理。固相萃取(SPE)[19]是固液萃取和柱液色譜技術結合的一種預處理技術，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統萃取相比可提高待測物的回收率，更有效分離雜質，且操作簡單、省時省力。為了快速除去尿液樣品中的蛋白質及雜質等干擾物，本實驗采用C18固相萃取小柱對尿液樣品中進行了簡單的預處理。

實驗過程中，通過比較不同有機相及調整有機相-水相比例后譜圖中出峰情況，確定液相色譜的流動相和洗脫條件，同時通過對比正負離子條件下譜圖中響應值大小和出峰的數目，最終選擇負離子掃描模式，這可能與代謝產物中大多含有羥基等官能團有關。

大鼠灌胃給予地榆鞣質提取物后，經HPLC-Q-TOF/MS分析，從其尿液中共檢測到9個代謝產物，分別為焦性沒食子酸(Pyrogallol)(M1)、尿石素B(Urolithin B)(M2)、甲基化尿石素C(Methyl-Urolithin C)(M3)、尿石素A(Urolithin A)(M4)、甲基化尿石素A(Methyl-Urolithin A)(M5)、葡萄糖醛酸化尿石素C(Urolithin C-Glucuronidation)(M6)、二甲基化鞣花酸(Dimethy-EA)(M7)、尿石素M5(Urolithin M5)(M8)、沒食子酸(Gallic acid)(M9)，其中M9為原型藥物。地榆鞣質進入大鼠體內，一方面沒食子酸類鞣質水解產生沒食子酸(Gallic acid)，沒食子酸在腸道菌群的作用下進一步代謝成焦性沒食子酸(Pyrogallol)，另一方面鞣花鞣質經水解形成鞣花酸(EA)，鞣花酸在腸道菌群的作用下進一步代謝成尿石素類化合物(urolithins)。推測地榆鞣質首先經I相代謝形成尿石素等極性偏小的代謝產物吸收進入體內，再發(fā)生II相結合反應，與葡糖糖醛酸等結合增大極性，進而從尿液排除體外[20]。地榆鞣質在體內可能的代謝途徑見圖22。

圖22 地榆鞣質在體內的代謝途徑

鞣質是一類結構比較復雜的多元酚類化合物，按結構式可分為水解鞣質、縮合鞣質和復合鞣質[21]。鞣花鞣質(Ellagitannins)是水解鞣質中的一種，水解后可產生鞣花酸(逆沒食子酸，Ellagic acid)，廣泛存在于石榴、草莓、藍莓等食物中。隨著人們對其研究的不斷深入，發(fā)現其具有抗氧化、抗病毒、抗炎、雌激素受體拮抗等諸多生物活性[22-25]，人們進一步對其在體內的生物轉化進行研究，發(fā)現其主要代謝產物尿石素(urolithins)同樣具有較強的生物活性[26-28]，推測尿石素可能是鞣花鞣質在體內發(fā)揮作用的物質基礎。地榆中含有大量的鞣質類成分，主要是水解鞣質和縮合鞣質，其水解鞣質中就包含沒食子鞣質和鞣花鞣質[2]。通過對其代謝產物進行分析，可推測地榆鞣質在體內的代謝轉運途徑，進一步闡明了其發(fā)揮作用的機理。接下來將對其代謝產物進行進一步活性研究，為新藥的開發(fā)利用提供依據。

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MetabolitesofTanninsfromSanguisorbaofficinalisL.inRatUrine

ZHOUBenhong1，2*，WANGJing1，WUYue1，YIHuilan1，TANJun2，ZHANGHongpan1

(1.Departmentofpharmaceutical，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060,China； 2.PharmaceuticalCollegeofWuhanUniversity，Wuhan430072,China)

Objective：To investigate the metabolites in urine of rats administrated with tannins extracted fromSanguisorbaofficinalisL.(STE) by gavage，liquid chromatography time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF-MS) was employed.Methods：Rat’s urine samples were collected and analyze by liquid chromatography time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF-MS).The analysis was performed on a ZORBAX Eclipse XDB-C18column with an acetonitrile-water gradient elution.Time of flight mass spectrometer (TOF/MS) was applied for qualitative analysis under negative ion mode.Based on the accurate molecular weight，MS and MS2information of TOF/MS detection and the compound list established previously，the possible metabolites of STE were identified.Results：Nine metabolites were detected in the rat urine：pyrogallol (M1)，urolithin B (M2)，methyl-urolithin C (M3)，urolithin A (M4)，methyl-urolithin A (M5)，urolithin C-clucuronidation (M6)，dimethy-EA (M7)，urolithin M5 (M8)，gallic acid (M9).M9 was the prototype drug.Conclusion：Tannins fromS.officinalisset off I phase metabolic reactions first to generate weak polarity metabolites such as urolithins after enteringinvivo，then the II phase reaction were happened to combined with glucuronide to increase its polarity，so as to excrete out through urine，which further clarifies the function mechanism of tannins fromS.officinalis.

Tannins；SanguisorbaofficinalisL.；metabolites；urolithins；HPLC-MS

] 周本宏，博士，教授，主任藥師，研究方向：中藥及天然藥物活性成分；E-mail：benhongzh@whu.edu.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.011

2016-08-20)

*[