楊微，賀寶霞，張斌

(鄭州大學 附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

·基礎(chǔ)研究·

松樹皮原花青素對乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移作用

楊微*，賀寶霞，張斌

(鄭州大學 附屬腫瘤醫(yī)院，河南 鄭州 450008)

目的：研究松樹皮提取物原花青素(PMBE)對人乳腺癌MCF-7細胞體外轉(zhuǎn)移及侵襲作用的影響，并初步探討其作用機制。方法：不同濃度PMBE作用于體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞，采用MTT法檢測其對細胞增殖抑制作用的影響；通過劃痕實驗檢測PMBE對細胞轉(zhuǎn)移能力的影響；體外侵襲實驗(Transwell小室)檢測PMBE對細胞侵襲能力的影響；最后應(yīng)用免疫印跡(Western-blot)方法檢測PMBE對MCF-7細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達水平的影響。結(jié)果：隨著PMBE濃度的增加，MTT法檢測結(jié)果表明，PMBE在體外對MCF-7細胞有明顯的增殖抑制作用，半數(shù)致死濃度(IC50)值為(71±2.1)μg·mL-1；PMBE質(zhì)量濃度為5、15 μg·mL-1時，細胞劃痕的閉合能力分別下降25%、36%，細胞侵襲能力下降59%、79%；PMBE能顯著抑制MCF-7細胞MMP-9蛋白的表達。結(jié)論：PMBE能有效抑制乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移，其作用機制可能與降低乳腺癌細胞運動能力有關(guān)，PMBE有潛力開發(fā)為治療乳腺癌的藥物。

馬尾松樹皮提取物；乳腺癌；體外侵襲實驗；轉(zhuǎn)移

馬尾松PinusmassonianaLamb.是我國特有的樹種，其樹皮在民間已廣泛用于治療風濕性關(guān)節(jié)痛、炎癥和癌癥[1]，其主要提取成分為原花青素(PMBE)。PMBE屬于多酚類化合物，具有多種生物活性，尤其是抗氧化和清除自由基的作用[2]。生物活性研究表明，PMBE通過誘導(dǎo)細胞凋亡對人肝癌和宮頸癌細胞產(chǎn)生抑制作用[3]；不僅具有良好的營養(yǎng)利用價值，更具有抗氧化、抗衰老、抗炎及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等活性[4-6]。

乳腺癌是威脅女性健康最常見的惡性腫瘤之一，易發(fā)生全身重要臟器的轉(zhuǎn)移，如腦轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移等。研究證實，乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移特性是導(dǎo)致患者死亡的關(guān)鍵因素[7]。因此，探索能有效抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移和侵襲的抗腫瘤藥物成為目前研究熱點。已有研究發(fā)現(xiàn)PMBE具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的作用[8-10]，然而國內(nèi)針對乳腺癌的研究較少，為充分探究PMBE對乳腺癌的抑癌作用，進行以下相關(guān)研究。

1 材料

人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞(凱基生物公司)；馬尾松樹皮提取物(中國陜西高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限公司，PMBE含量≥95%)；DMEM細胞培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(TransGen公司)；雙抗、胰酶(Gibco公司)；Transwell小室(康寧公司)；DMSO、結(jié)晶紫及甲醇(科密歐試劑公司)。細胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(Thermo公司)；超凈臺(Boxun公司)；壓力蒸氣滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司)；倒置顯微鏡(Novel公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

MCF-7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度，37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化，用于實驗。

2.2 MTT法檢測

將25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中生長良好的MCF-7細胞用0.25%胰蛋白酶細胞消化液消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至7×104個·mL-1，將MCF-7細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置37 ℃、5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后加藥，實驗組每孔加入預(yù)先以培養(yǎng)基稀釋的不同質(zhì)量濃度PMBE溶液200 μL，使PMBE終質(zhì)量濃度為0、5、10、25、50、75、100 μg·mL-1，每組設(shè)置4個復(fù)孔。作用24 h后，避光條件下每孔加入5 mg·mL-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于酶標儀上檢測各孔的吸光度值(A值)，測定波長為490 nm。

2.3 劃痕實驗檢測MCF-7細胞的遷移情況

取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打重懸為單細胞懸液，調(diào)至 2×105個·mL-1。將500 μL細胞懸液接種24 孔細胞培養(yǎng)板后過夜培養(yǎng)。待細胞長成單層即棄去培養(yǎng)液，用200 μL的槍頭在24孔板每孔中央劃出一道劃痕，洗去死細胞后顯微鏡下拍照。按實驗設(shè)計分細胞對照組、5 μg·mL-1組、15 μg·mL-1組，處理24 h后，在同一觀察點處顯微鏡拍照記錄細胞生長情況，實驗重復(fù)3次。利用軟件測量每孔多個點劃痕間距，取均值，并用處理前的距離減去處理后的距離即為24 h細胞遷移距離，數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件分析。

2.4 侵襲實驗

Transwell小室檢測細胞轉(zhuǎn)移能力，無血清培養(yǎng)基500 μL水化基底膜10 min，上室加入200 μL濃度為2×104個·mL-1的細胞懸液，下室分別加入500 μL藥物質(zhì)量濃度為0、5、15 μg·mL-1的無血清培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)箱孵育24 h后取出小室，放入500 μL 磷酸緩沖液(PBS)中清洗2次，500 μL甲醇中固定15 min，放入500 μL 0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗2次，用棉簽輕擦上室內(nèi)面的細胞，在40×視野下任取6個不同視野，計算細胞數(shù)目，取平均值。

2.5 Western blot試驗

在MCF-7細胞培養(yǎng)體系中分別加入不同濃度PMBE作用48 h后，Western blot 檢測MMP-9蛋白表達水平，各蛋白表達量由它們在膠片上顯色后的灰度與相應(yīng)β-actin 的灰度比表示。

2.6 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 PMBE對細胞增殖能力的影響

分別用0、5、10、25、50、75、100 μg·mL-1原花青素作用于乳腺癌細胞24 h后，MTT法檢測細胞增殖，發(fā)現(xiàn)PMBE能明顯抑制細胞增殖，24 h的IC50為71 μg·mL-1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且抑制作用呈濃度依賴性。5、15 μg·mL-1PMBE處理細胞后，細胞存活率分別為(84±0.05)%和(81±0.04)%，因此，在轉(zhuǎn)移和侵襲實驗中選用這兩組濃度。見圖1。

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖1 PMBE對MCF-7細胞增殖的影響

3.2 MBE對細胞遷移情況的影響

質(zhì)量濃度為5、15 μg·mL-1的PMBE作用24 h后，劃痕的愈合能力顯著低于空白對照組(P<0.05)。5、15 μg·mL-1組使MCF-7細胞愈合能力分別降低了25%和36%，此結(jié)果表明，PMBE有抑制細胞遷移的能力。見圖2。

A.MCF-7細胞被抑制0、24 h后鏡下(100×)觀察的細胞遷移情況；B.MCF-7細胞被抑制后劃痕愈合能力量化統(tǒng)計結(jié)果；與0 μg·mL-1組比較，*P<0.05,**P<0.01。圖2 原花青素對MCF-7細胞轉(zhuǎn)移的影響

3.3 PMBE對細胞侵襲能力的影響

對照組及PMBE 5、15 μg·mL-1組穿過基底膜的細胞百分數(shù)分別為100%、41%、21%。PMBE處理組的細胞侵襲能力明顯低于空白對照組(P<0.05)。 結(jié)果表明，PMBE有抑制細胞侵襲的能力。見圖3。

注：A.空白組及實驗組MCF-7細胞侵襲到Transwell膜下方鏡下(100×)的觀察結(jié)果；B.各象限細胞計數(shù)；與0 μg·mL-1組比較，**P<0.01。圖3 原花青素對MCF-7細胞侵襲能力的影響

3.4 PMBE抑制MMP-9蛋白的表達

5、15 μg·mL-1原花青素藥物組處理細胞48 h后，提取細胞總蛋白。Western-blot結(jié)果顯示，5 μg·mL-1PMBE處理組細胞MMP-9蛋白相對于對照組細胞表達下降47%；15 μg·mL-1PMBE處理組細胞MMP-9蛋白相對于對照組細胞表達下降68%。結(jié)果表明，PMBE能顯著抑制MCF-7細胞MMP-9表達變化(P<0.01，P<0.001)，減弱MCF-7細胞的侵襲能力。見圖4。

注：與對照組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖4 PMBE對MCF-7細胞MMP-9蛋白表達的影響

4 討論

研究表明，PMBE可有效抑制前列腺癌細胞的生長和增殖[11]，然而其對乳腺癌的作用罕見報道。研究首先采用 MTT方法檢測PMBE對具有高侵襲性的乳腺癌細胞MCF-7生長的抑制作用，結(jié)果說明PMBE可抑制乳腺癌細胞的生長，并且具有抑制MCF-7細胞轉(zhuǎn)移的作用，提示其可能具有應(yīng)用于治療乳腺癌的潛能。

轉(zhuǎn)移是惡性乳腺癌最重要的生物學特征[12]，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因之一，近年腫瘤轉(zhuǎn)移機制成為研究的熱點，細胞侵襲和遷移是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的必需步驟[13-14]。基底膜和細胞外基質(zhì)(ECM)的生理動態(tài)平衡是防止腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移的一道天然屏障。ECM和基底膜的降解成為腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，其中基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)起到關(guān)鍵作用[15]。MMP-2、MMP-9在患者胰腺癌中不同程度表達，在胰腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的過程中起著協(xié)同作用，具有促進基底膜和EMC分解的作用，有利于胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。研究表明多種中藥提取物物都具有抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的作用，從而發(fā)揮抗癌效果，部分是通過抑制MMP-2、MMP-9的表達實現(xiàn)的[17]。有研究證實PMBE能夠通過抑制細胞MMP-9的表達而抑制細胞轉(zhuǎn)移侵襲。本實驗在體外驗證了PMBE能抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，其作用機制可能與原花青素抑制細胞中MMP-9的表達有關(guān)。

本研究采用對細胞生長影響較低的濃度觀察了PMBE對乳腺癌細胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示其可抑制乳腺癌細胞的遷移能力。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移除了與細胞遷移能力有關(guān)之外，還與細胞穿透細胞外基質(zhì)的能力即侵襲能力相關(guān)。本研究采用侵襲實驗觀察了PMBE對乳腺癌細胞侵襲能力的影響，Western blot結(jié)果顯示其可明顯抑制乳腺癌細胞MMP-9的表達，從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的作用。綜上所述，PMBE在體外不僅可以抑制乳腺癌細胞的遷移，還可抑制細胞的侵襲，具有抑制乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的效果。

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Anti-metastaticEffectsofPinusmassonianaBarkExtractonBreastCancerCells

YANGWei*，HEBaoxia，ZHANGBin

(AffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450008，China)

Objective：To investigate the inhibitory effects ofPinusmassonianabark extract (PMBE) on tumor metastasis in breast cancer MCF-7 cellsinvitro.Methods：Effects of PMBE on the viability of breast cancer MCF-7 cells were detected by MTT assay.Breast cancer cell metastasis after exposure to PMBE were quantified by wound healing and Transwell assays，respectively.The expression of MMM-9 protein were evaluated by western blot.Results：Breast cancer cells after PMBPs treatment showed a dramatic reduction in cell viability in a dose-dependent manner，the IC50value of PMBP was (71±2.1) μg·mL-1.After cells were treated with 5 and 15 μg·mL-1PMBE，the cells invasion potentials were also decreased by 25% and 36%，the cell metastatic potentials were also decreased by 59% and 79%，respectively.Conclusion：Our findings indicated that PMBE had potential to develop as an anti-metastatic cancer drug for breast cancer patients.

Pinus massoniana bark extracts；breast cancer；Transwell；metastasis

] 楊微，碩士研究生，研究方向：抗腫瘤藥物研究；E-mail：yangwei_0515@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.009

2016-10-26)

*[