周昱岐+張映城+魏品康

[摘要] 目的 探討消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（CCSCs）凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。 方法 采用無(wú)血清培養(yǎng)法由HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)CCSCs，通過檢測(cè)CCSCs標(biāo)志物CD44進(jìn)行鑒定。消痰散結(jié)方浸膏凍干粉末溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液中，制備消痰散結(jié)方保存液。以不同濃度消痰散結(jié)方（0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL）作用CCSCs 72 h，Annexin-V/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各濃度消痰散結(jié)方對(duì)CCSCs的影響。Western blot檢測(cè)藥物干預(yù)后Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 HCT116細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)下成球生長(zhǎng)，CCSCs中CD44+細(xì)胞占（49.69±1.89）%。消痰散結(jié)方可誘導(dǎo)CCSCs，其凋亡率與對(duì)照組（0 mg/mL）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），其凋亡效應(yīng)呈濃度依賴性。消痰散結(jié)方作用后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱，以0.5、1.0 mg/mL兩組濃度效應(yīng)更為顯著。 結(jié)論 從HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞成功誘導(dǎo)富集CCSCs，消痰散結(jié)方能劑量依賴性地誘導(dǎo)CCSCs，其機(jī)制可能與促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)、抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 消痰散結(jié)方；結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞；凋亡；Bax蛋白；Bcl-2蛋白

[中圖分類號(hào)] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）08（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate effect of Xiaotan Sanjie Recipe on apoptosis of colon cancer stem-like cells （CCSCs） and its related mechanism. Methods The CCSCs were induced from colon cancer cell line HCTl16 in serum-free medium. The expressions of CD44 were detected to identify CCSCs. The lyophilized powder of Xiaotan Sanjie Recipe Extract was dissolved in cell culture fluid， so as to make preserving fluid of Xiaotan Sanjie Recipe. CCSCs were treated with different concentrations of Xiaotan Sanjie Recipe （0.125， 0.25， 0.5， 1.0 mg/mL） for 72 h. The effects of different concentrations of Xiaotan Sanjie Recipe for CCSCs were detected by Annexin-V/PI staining combined with flow cytometry. The expression changes of Bax， Bcl-2 protein after drug intervention were detected by Western blot. Results HCT116 cells formed cancer stem cell spheres in serum-free medium. The proportion of CD44 cells in cell spheres was （49.69±1.89）%. Xiaotan Sanjie Recipe could induce the cell apoptosis， the apoptosis rate was statistically significant different compared with the control group （0 mg/mL） （P < 0.05）， the apoptotic effects showed concentration-dependent. After application of Xiaotan Sanjie Recipe， the expression of pro-apoptotic protein Bax of Bcl-2 family was increased， meanwhile the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was decreased. The effect was more pronounced in 0.5 mg/mL and 1.0 mg/mL concentration groups. Conclusion CCSCs are successfully induced from HCT116 colon cancer cell line. Xiaotan Sanjie Recipe can induce CCSCs in a dose-dependent manner， the mechanism may be related to the increased expression of pro-apoptotic protein Bax and decreased expression of anti-apoptotic protein Bcl-2.

[Key words] Xiaotan Sanjie Recipe； Colon cancer stem-like cells； Apoptosis； Bax protein； Bcl-2 protein

結(jié)直腸癌每年有120萬(wàn)新發(fā)病例和60萬(wàn)死亡病例[1]。我國(guó)晚期結(jié)直腸癌即使行根治性切除后5年生存率為40%～50%[2]。結(jié)腸癌干細(xì)胞突變于正常的結(jié)腸隱窩干細(xì)胞[3]，具有自我更新、高度增殖潛能[4]、高致瘤性[5]、強(qiáng)耐藥性[6]及多向分化的特點(diǎn)，因此有效殺傷腫瘤干細(xì)胞的藥物及靶點(diǎn)，成為腫瘤研究中的一個(gè)重要方向。中藥復(fù)方消痰散結(jié)方是著名腫瘤專家魏品康教授的臨床驗(yàn)方，臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)療效明確[7-8]。本研究將腫瘤干細(xì)胞研究與中藥復(fù)方消痰散結(jié)方結(jié)腸癌研究相結(jié)合，旨在進(jìn)一步探索消痰散結(jié)方是否能成為清除腫瘤干細(xì)胞的靶向藥物。endprint

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

HCT116人結(jié)直腸癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)條件37℃、5%CO2；培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 pg/mL鏈霉素的McCoy′s 5A培養(yǎng)基；用含0.01% EDTA的0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物

消痰散結(jié)方由天南星、法半夏、全蝎、蜈蚣、雞內(nèi)金、茯苓、山慈菇、蚤休、枳實(shí)、陳皮、白芥子、炙甘草12味中藥組成，中藥飲片購(gòu)自上海雷允上公司，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院制劑室水蒸醇提法制備浸膏，原藥材濃度為3.35 g/mL。消痰散結(jié)方凍干粉末保存液制備[9]：將消痰散結(jié)方浸膏在超凈水中稀釋5倍，16 000 r/min，離心半徑20 cm，離心10 min，取上清液，-80℃制備凍干粉末，稱重，溶解在細(xì)胞培養(yǎng)液中制備保存液，0.22 μm膜過濾，保存液藥物濃度為10 mg/mL（原藥材濃度為0.22 g/mL）。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（奧地利PAA Laboratories GmbH公司）；McCoy′s 5A培養(yǎng)基、Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium（DMEM）/F12培養(yǎng)基；B27supplement（均為美國(guó)GIBCO公司）；表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國(guó)PeproTech公司）。鼠抗人GAPDH一抗（美國(guó)Proteintech，貨號(hào)60004-1-Ig），兔抗人Bcl-2一抗（美國(guó)SAB，貨號(hào)#35342）、兔抗人Bax一抗（美國(guó)SAB，貨號(hào)#34260），Annexin-V/FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（美國(guó)BD公司，Cat No.556547）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scientific公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司，TS100）；Model Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，EPICS-XL型）。

1.4 HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

取HCT116細(xì)胞接種于含20 μL/L EGF及20 μL/L bFGF的無(wú)菌無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基（serum free medium，SFM）中，最終細(xì)胞數(shù)為4×103/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第3、5、7天在倒置顯微鏡下觀察和拍攝，待細(xì)胞完全貼壁形態(tài)改變時(shí)，停止培養(yǎng)。將PE標(biāo)記的CD44抗體加入細(xì)胞懸液中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44表達(dá)情況。

1.5 細(xì)胞分組與干預(yù)方法

各實(shí)驗(yàn)組加入消痰散結(jié)方保存液，使藥物終濃度為0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中藥物作用72 h。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.6.1 Annexin-V/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μL 0.25%胰酶（不含EDTA），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化3～5 min，中止消化反應(yīng)移至流式管中，1500 r/min×5 min離心，按9∶1的比例用PBS稀釋試劑盒中緩沖液（10×），沉淀細(xì)胞內(nèi)加入緩沖液（1×），檢測(cè)管中加入試劑盒中FITC Annexin-V 3.8 μL，室溫反應(yīng)10 min，加入試劑盒中碘化丙啶3.8 μL，加入120 μL緩沖液（1×）。檢測(cè)細(xì)胞凋亡，以FITC熒光信號(hào)讀數(shù)為橫坐標(biāo)，PI熒光信號(hào)讀數(shù)為縱坐標(biāo)。

1.6.2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl-2） 細(xì)胞裂解后按產(chǎn)品說(shuō)明用BCA法測(cè)定蛋白濃度，等量的蛋白樣品（40 μg）經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉2 h，GAPDH一抗按1∶5000稀釋，Bax、Bcl-2一抗按1∶1000稀釋，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次后，加入1∶2000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠或羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST再次洗滌3次，加入ECL發(fā)光底物，在WB凝膠成像系統(tǒng)中成像、攝圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，Levene法檢驗(yàn)方差齊性，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCT116結(jié)腸癌干細(xì)胞富集培養(yǎng)及鑒定

置于SFM培養(yǎng)后，HCT116細(xì)胞呈卵圓形，且聚集成球，于培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。同時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（CCSCs）表面標(biāo)志物CD44表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CD44+占（49.69±1.89）%，成功富集了CCSCs。見圖1～2。

2.2 消痰散結(jié)方誘導(dǎo)結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡

消痰散結(jié)方作用于CCSCs 72 h的IC50是0.25 mg/mL，故取以下4個(gè)濃度：0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL，作用CCSCs 72 h后，Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，從0.125 mg/mL濃度起，消痰散結(jié)方即誘導(dǎo)CCSCs凋亡，其凋亡率與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；隨著藥物作用濃度增高，細(xì)胞凋亡率也逐漸增高（P < 0.01），效應(yīng)呈濃度依賴型。見圖3～4。

2.3 消痰散結(jié)方對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

消痰散結(jié)方作用于CCSCs 72 h，WB檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，消痰散結(jié)方作用后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱，以0.5 mg/mL及1.0 mg/mL濃度組更為顯著。見圖5。endprint

3 討論

結(jié)腸癌屬中醫(yī)學(xué)的“腸積”“鎖肛痔”等病的范疇。筆者所在學(xué)科為國(guó)家中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)學(xué)科，長(zhǎng)期致力于中西醫(yī)結(jié)合防治消化道腫瘤，總結(jié)臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)：發(fā)生腸癌的三大外因（外感濕熱、飲食不節(jié)、情志所傷），其本質(zhì)皆可歸結(jié)于“痰”。第一，外感濕熱，導(dǎo)致水濕困脾，脾失健運(yùn)，則濕聚為痰，內(nèi)外之痰濕日久不去，發(fā)為腸癌。第二，現(xiàn)代人多食膏粱厚味，日久損傷脾胃，滋生痰濕，痰濕不去化熱，下迫大腸，與腸中之糟粕交阻搏擊，日久成塊。第三，情志所傷所愿不遂，肝氣郁結(jié)，肝木太過克伐脾土，脾失健運(yùn)，水濕內(nèi)生，郁而化熱，痰熱合邪，下迫大腸，誘生腸癌[10-11]。基于此，我們制訂消痰散結(jié)法為治療腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的主要法則，消痰散結(jié)方為其代表方，方以法半夏、天南星辛溫苦燥，善消痰燥濕共為君，蜈蚣、全蝎等解毒散結(jié)通絡(luò)共為臣，陳皮理氣和胃、雞內(nèi)金助胃之消導(dǎo)而為佐，炙甘草溫中健脾，調(diào)和諸藥為使，運(yùn)用于臨床實(shí)踐證實(shí)，消痰散結(jié)法是治療晚期腸癌的有效方法之一[7-8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，消痰散結(jié)方可顯著抑制腸癌HCT116親代細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，并且阻滯其細(xì)胞周期[12-13]。

腸癌干細(xì)胞突變于正常的結(jié)腸隱窩干細(xì)胞，故其具有干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的雙重特性，被認(rèn)為具有腫瘤發(fā)生能力的腫瘤細(xì)胞亞群[5]。無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)法為目前常用的分離腫瘤干細(xì)胞的體外研究方法，來(lái)源于用“干細(xì)胞培養(yǎng)基”篩選神經(jīng)干細(xì)胞的方法，原理是良性腫瘤細(xì)胞和已分化癌細(xì)胞在“無(wú)血清超低黏附”培養(yǎng)條件下，會(huì)因?yàn)槿狈I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和失巢凋亡而死亡，只有未分化癌細(xì)胞能夠在其中存活、增殖，形成懸浮集群并最終形成球體[14]。它既是體外CCSCs的識(shí)別方法，又是CCSCs的富集方法[15]，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)分選HCT116細(xì)胞的腸癌干細(xì)胞，并通過流式檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44，進(jìn)行驗(yàn)證。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，采用Ad-CD44-shRNA方法敲低HCT-116細(xì)胞的CD44表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲顯著減少，細(xì)胞凋亡增加[16]。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用消痰散結(jié)方凍干粉溶解液作用于腸癌干細(xì)胞，觀察到消痰散結(jié)方對(duì)腸癌干細(xì)胞有促凋亡作用，并且凋亡率隨作用濃度升高而增加。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)控異常、引起細(xì)胞過度積累是導(dǎo)致癌癥發(fā)生的機(jī)制之一[17]。Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[18]，據(jù)功能不同Bcl-2家族分為促凋亡蛋白（如Bax）和抑凋亡蛋白（如Bcl-2），基礎(chǔ)研究顯示，Bax、Bcl-2對(duì)腫瘤干細(xì)胞增殖有明確的作用[19-20]。消痰散結(jié)方體外作用腸癌干細(xì)胞后，促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱，并呈濃度依賴性，消痰散結(jié)方誘導(dǎo)結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡的機(jī)制與對(duì)Bcl-2蛋白家族的調(diào)控相關(guān)。

綜上所述，本研究提示從HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出CCSCs，消痰散結(jié)方能劑量依賴性地誘導(dǎo)CCSCs凋亡，其機(jī)制可能與促凋亡蛋白Bax表達(dá)增強(qiáng)、抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減弱相關(guān)，為闡明消痰散結(jié)方抗結(jié)腸癌的分子靶點(diǎn)提供了一定依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-19 本文編輯：張瑜杰）endprint