陳錦龍 呂剛，2 張優(yōu) 符瑞佳 尹飛飛，2★

一種基于液相基因芯片技術(shù)對甲型和乙型流感病毒分型檢測方法的建立

陳錦龍1呂剛1，2張優(yōu)1符瑞佳1尹飛飛1，2★

目的建立能夠?qū)仔土鞲胁《荆╥nfluenza virus A，INFA）和乙型流感病毒（influenza virus B，INFB）進(jìn)行區(qū)分的液相基因芯片技術(shù)，為甲型和乙型流感病毒的分型提供一種高通量、高靈敏度的檢測和鑒定方法。方法從NCBI的GenBank下載具有代表性的流感病毒基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件BioEdit進(jìn)行序列比對，分別設(shè)計針對INFA和INFB的簡并引物和特異性探針，將設(shè)計好的引物和探針與GenBank中所有的基因序列進(jìn)行比對，以驗證其特異性。經(jīng)探針合成、懸浮液相芯片制備和檢測條件的優(yōu)化獲得用于甲型和乙型流感病毒分型的液相基因芯片。結(jié)果所檢測INFA和INFB均可獲得特異性雜交信號，非特異性雜交信號不明顯，將2種病毒混合，模擬混合病毒感染也可以得到相應(yīng)的特異性雜交信號。靈敏度評估結(jié)果表明INFA的檢測靈敏度為1～10空斑形成單位（plaque forming unit，pfu），而INFB為10～100 pfu。將本方法用于檢測11份臨床樣本，其結(jié)果與熒光定量分型逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase?polymerase chain reaction，RT?PCR）檢測方法的結(jié)果一致。結(jié)論本研究初步建立了INFA和INFB的液相基因芯片檢測技術(shù)，可用于流感病毒的初步篩查和鑒定，并且可以進(jìn)行混合感染樣本的檢測，為流感病毒的分型和鑒定提供了一種新的手段。

甲型流感病毒；乙型流感病毒；液相基因芯片；病毒分型檢測

流感病毒的感染是世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。根據(jù)核衣殼蛋白和基質(zhì)蛋白的同源性，流感病毒分為甲、乙和丙型［1?2］。甲型流感病毒（influenza virus A，INFA）抗原性易發(fā)生變異，可以進(jìn)一步分為 H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亞型，多次引起世界范圍的大流行。乙型流感病毒（influ?enza virus B，INFB）只在局部引起小范圍的流行，丙型流感病毒只引起人類不明顯的或輕微的上呼吸道感染，很少造成流行［3］。準(zhǔn)確有效的流感病毒檢測和分型方法對于臨床采取及時有效的治療方式和控制流感的傳播具有重要的意義。但是目前對于流感病毒的檢測臨床上主要采用實時熒光定量PCR，其缺點為檢測靶標(biāo)單一，對多靶標(biāo)檢測易出現(xiàn)假陽性結(jié)果［4?5］。而液相基因芯片作為一種新興檢測技術(shù)，利用多標(biāo)志物并行檢測從而提高了檢測通量［6］。本研究建立了一種能夠?qū)仔秃鸵倚土鞲胁《具M(jìn)行檢測和分型的液相基因芯片技術(shù)，為流感病毒的篩查和流行病學(xué)本底調(diào)查提供重要的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與病毒株

本檢測所用流感病毒株包括甲型流感病毒H1N1（A/PR/8/34，ATCC?VR95）和 H3N2（A/Victo?ria/210/2009型），乙型流感病毒（B/Lee/40，ATCC?VR101）。所有流感病毒在Vero?E6細(xì)胞系中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。病毒的增殖于中科院武漢病毒研究所BSL?2生物安全實驗室進(jìn)行。

1.1.2 所需試劑

M?MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司（美國），Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司，報告分子Streptavidin?phycoerythrin購于Molecular Probes公司（美國），雜交緩沖液TMAC和微球購自Luminex公司（美國）。病毒RNA提取試劑盒QIAamp viral RNAmini kit購自Qiagen公司（美國）。

1.2 方法

1.2.1 病毒的增殖培養(yǎng)和核酸提取

將病毒接種于Vero?E6細(xì)胞系，在含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）情況，當(dāng) 90%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，收集病毒培養(yǎng)液，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)病毒RNA提取試劑盒的說明書提取病毒核酸。

1.2.2 簡并引物和特異性探針的設(shè)計合成

在GenBank下載具有代表性的甲型流感病毒和乙型流感病毒全基因組序列各100條以上，利用BioEdit（版本7.0）軟件進(jìn)行序列同源性比對分析，在此基礎(chǔ)上設(shè)計簡并引物，并在簡并引物的范圍內(nèi)設(shè)計特異性探針。初步設(shè)計的引物和探針經(jīng)過Blast比對分析進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化設(shè)計。正向引物進(jìn)行生物素（Biotin）修飾，探針進(jìn)行氨基化和C12修飾。所有引物和探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司（中國）合成。

1.2.3 芯片制備

根據(jù)Luminex公司的說明書，將檢測探針通過共價交聯(lián)的方式偶聯(lián)在微球上。4種檢測探針分別偶聯(lián)到不同編號的微球上，以利于多重檢測。

1.2.4 病毒RT?PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

按照M?MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系組成如下：cDNA 模板 5μL，20 μmol/L 上下游引物各 1μL，10×PCR 緩沖液 5μL，10 mol/L dNTP 1μL，加水補(bǔ)至 50μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，57℃復(fù)性30 s，72℃擴(kuò)增30 s擴(kuò)增，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min，降溫至4℃。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物至96孔PCR管，向管內(nèi)加入用1.5×TMAC雜交液稀釋的4種微球至終濃度150 個/μL，加入12μL TE，空白對照管加入 17μL TE，混勻后于 95℃變性 5min、55℃雜交15min，加入報告分子55℃繼續(xù)孵育5min后用Luminex 200系統(tǒng)檢測。

1.2.5 敏感性評估

將H1N1、H3N2和INFB梯度稀釋，獲得100000、10 000、1 000、100和10 pfu/mL的病毒濃度，各取0.5 mL提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄后取1/5做模板進(jìn)行液相基因芯片檢測，即各檢測模板量為10 000、1 000、100、10和1 pfu。

1.2.6 特異性和重復(fù)性檢測

所有樣本分別進(jìn)行3次核酸提取、PCR擴(kuò)增和液相芯片檢測，以檢測芯片的重復(fù)性。通過DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測每對引物的PCR產(chǎn)物的條帶是否為特異性。

1.2.7 模擬混合病毒感染的檢測

將1 000 pfu的H1N1、H3N2和INFB病毒溶液兩兩組合，模擬H1N1和H3N2、H1N1和INFB、H3N2和INFB混合感染的樣本，分別提取RNA并反轉(zhuǎn)錄，對模板進(jìn)行液相基因芯片檢測。

1.2.8 檢測方法的初步應(yīng)用

對本實驗室收集和保存的11份臨床樣本，用本文建立的液相基因芯片方法進(jìn)行檢測，同時以H1N1、H3N2和INFB病毒培養(yǎng)液做為陽性對照，并與熒光定量分型RT?PCR方法（上海之江生物科技股份有限公司）進(jìn)行比較，評價本方法的可靠性及臨床實用性。

2 結(jié)果

2.1 引物的設(shè)計合成及特異性檢測

針對流感病毒型特異性基因M基因分別設(shè)計針對流感病毒甲型和乙型的引物和探針［4?5］，所設(shè)計合成的引物和探針序列如表1。為便于液相基因芯片的優(yōu)化，針對甲型和乙型流感病毒分別設(shè)計2組引物和探針，進(jìn)行后繼系列評價比較。病毒RNA提取后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板，利用設(shè)計合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，引物對INFA?F1/INFA?R1、INFA?F2/INFA?R2、INFB?F1/INFB?R1和 INFB?F2/INFB?R2分別擴(kuò)增出304 bp、359 bp、453 bp和300 bp的特異性條帶且無明顯非特異性條帶產(chǎn)生。

表1 用于甲型和乙型流感病毒分型的引物和探針Table 1 The primers and probes used for the typing of INFA and INFB

2.2 不同液相基因芯片檢測效果的比較

分別利用各引物和探針進(jìn)行PCR和液相基因芯片檢測，比較不同的液相基因芯片的檢測結(jié)果。結(jié)果如表2所示，利用引物對INFA?F1/INFA?R1進(jìn)行PCR并用探針I(yè)NFA?P1制備液相基因芯片檢測，陽性樣本H1N1和H3N2的平均熒光值分別為890和785，陰性樣本乙型流感病毒平均熒光值為150，陰性對照結(jié)果為28；利用引物對INFA?F2/IN?FA?R2進(jìn)行PCR并用探針I(yè)NFA?P2制備液相基因芯片檢測，陽性樣本H1N1和H3N2的平均熒光值分別為1 800和1 980，陰性樣本乙型流感病毒平均熒光值為98，陰性對照結(jié)果為43。2種液相基因芯片比較，引物對INFA?F2/INFA?R2和探針I(yè)NFA?P2制備液相基因芯片效果較好。利用引物對INFB?F1/INFB?R1進(jìn)行PCR 并用探針 INFB?P1制備液相基因芯片檢測，陽性樣本乙型流感病毒平均熒光值為1 540，陰性樣本H1N1和H3N2的平均熒光值分別為91和87，陰性對照結(jié)果為59；利用引物對INFB?F2/INFB?R2進(jìn)行PCR并用探針I(yè)NFB?P2制備液相基因芯片檢測，陽性樣本INFB平均熒光值為687，陰性樣本H1N1和H3N2的平均熒光值分別為149和205，陰性對照結(jié)果為60。2種液相基因芯片比較，引物對INFB?F1/INFB?R1和探針I(yè)NFB?P1制備液相基因芯片效果較好。

圖1 引物特異性檢測Figure 1 The specificity test of the primers

表2 不同液相基因芯片平均熒光值的比較Table 2 The comparison of the median fluorescence intensity of different microbead?based liquid assay

2.3 液相基因芯片檢測的敏感性的評估

分別對引物對INFA?F2/INFA?R2和探針I(yè)NFA?P2制備的液相基因芯片和引物對INFB?F1/INFB?R1和探針I(yè)NFB?P1制備的液相基因芯片進(jìn)行敏感性評估，結(jié)果如圖2所示，INFA的液相基因芯片檢測靈敏度為1～10空斑形成單位（plaque forming unit，pfu），而INFB的液相基因芯片檢測靈敏度為10～100 pfu。

圖2 液相基因芯片檢測敏感性評估Figure 2 Evaluation of the sensitivity of the assay

2.4 液相基因芯片檢測的特異性和重復(fù)性

所有樣本分別進(jìn)行3次核酸提取、PCR擴(kuò)增和液相基因芯片檢測，各樣本所用病毒量均為100 pfu，結(jié)果如圖3所示，3次檢測實驗的定性結(jié)果完全正確，而且探針間也沒有交叉反應(yīng)，表明該方法具有良好的特異性和可重復(fù)性。

圖3 液相基因芯片特異性和重復(fù)性檢測結(jié)果Figure 3 Results of the specificity and reproducibility test of the microbead?based liquid assay

2.5 模擬混合病毒感染的檢測評估

將H1N1、H3N2和INFB病毒溶液兩兩組合模擬混合病毒感染，對樣本進(jìn)行液相基因芯片檢測，結(jié)果如圖4所示，2種INFA病毒、H1N1和INFB、H3N2和INFB分別混合檢測，都能特異性檢測到相應(yīng)樣本，說明本檢測方法能夠進(jìn)行混合種類病毒感染的檢測。

圖4 模擬混合病毒檢測結(jié)果Figure 4 The results of the detection of mixed viruses

2.6 臨床樣本的檢測結(jié)果

檢測的11份臨床樣本中，10份為INFA，1份為INFB，H1N1和H3N2病毒培養(yǎng)液檢測結(jié)果為INFA，乙型流感病毒培養(yǎng)液檢測結(jié)果為INFB，陰性對照檢測結(jié)果為無病毒。其結(jié)果與熒光定量分型RT?PCR方法的結(jié)果一致，見表3。

表3 臨床樣本檢測結(jié)果Table 3 The results of clinical samples

3 討論

由流感病毒引起的流感是一種世界范圍內(nèi)的傳染性疾病，具有傳染性強(qiáng)、傳播快、潛伏期短、發(fā)病率高等特點，對公共衛(wèi)生和人們身體健康帶來重大威脅。流感的主要表現(xiàn)癥狀為高熱、肌痛、咳嗽、流涕等，可伴有嚴(yán)重的肺炎，甚至可能引起心臟、腎臟等多種重要器官衰竭而導(dǎo)致死亡。對人類危害巨大的季節(jié)性流感主要是由甲型流感病毒引起，而乙型流感病毒只在局部引起小范圍的流行，由于各型流感病毒所致疾病的治療和防控策略不同，建立流感病毒分型的快速檢測方法，對于流感的早期診斷和制定有效防治策略有重要意義［7］。本研究針對甲型和乙型流感病毒的保守基因M基因的核苷酸序列設(shè)計特異性引物和探針，用于甲型和乙型流感病毒的分型，經(jīng)過優(yōu)化選擇所設(shè)計的液相基因芯片具有很好的重復(fù)性和特異性。通過將分型探針偶聯(lián)在不同種類微球上，建立多重檢測體系，可在一個反應(yīng)中同時診斷甲型和乙型流感病毒，檢測96個樣本所需時間為5.5 h，從采樣到分型檢測獲得結(jié)果可以在一天內(nèi)完成，而傳統(tǒng)的流感病毒分離培養(yǎng)需要3～5天的時間［8］。液相基因芯片體系由熒光染料編碼的微球構(gòu)成，每種微球上偶聯(lián)有針對目的核苷酸區(qū)段的探針分子，與帶有報告分子藻紅蛋白的多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雜交，當(dāng)微球通過Luminex檢測儀，檢測結(jié)果通過熒光值直接判讀，其特異性引物和針對目的核苷酸的探針設(shè)計雙重保證檢測特異性。所以本研究建立的基于液相基因芯片的流感病毒分型檢測方法較基于抗原?抗體免疫反應(yīng)的流感病毒酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme?linked immuno?sorbent assay，ELISA）檢測方法，有效避免了抗原抗體交叉反應(yīng)的干擾［9］。同時由于液相基因芯片對流感病毒分型的基礎(chǔ)是核酸分子的雜交，其檢測的基礎(chǔ)是PCR產(chǎn)物和探針之間的互補(bǔ)程度，而且每個反應(yīng)結(jié)果的平均熒光值是100個微球上的熒光值的平均值，相當(dāng)于100次反應(yīng)的平均結(jié)果，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確［10］。近年來很多實驗室建立了用于流感病毒分型的多重?zé)晒釸T?PCR方法，目前被廣泛用于流感病毒的分型［11?14］。本研究采用多重PCR和液相基因芯片技術(shù)相結(jié)合的方法，克服了多重?zé)晒鈾z測方法設(shè)計難度高的弊端，在一次反應(yīng)中能同時對甲型和乙型流感病毒進(jìn)行分型檢測，有利于流感病毒的快速鑒定和診斷。

本研究對檢測引物、探針序列及多重PCR條件、雜交條件進(jìn)行多次優(yōu)化，選取陽性和陰性探針檢測熒光值差異最明顯、檢測靈敏度相對較高的條件建立流感病毒分型的液相基因芯片，對標(biāo)準(zhǔn)品病毒和11份臨床樣本的檢測結(jié)果，陽性探針對應(yīng)的平均熒光值均大于1 000，而陰性探針和陰性對照對應(yīng)的平均熒光值均小于100，較目前應(yīng)用較多的將大于陰性對照平均熒光值的2倍作為陽性結(jié)果判斷依據(jù)更為明確［15］。本方法檢測靈敏度為 1～100 pfu，與Beck等［16］報道的利用熒光定量RT?PCR分型方法敏感性相當(dāng)。

本項目建立的方法和流感病毒熒光定量RT?PCR分型方法相比，檢測結(jié)果與其具有較高的一致性，但在高通量檢測方面具有明顯的優(yōu)勢。因?qū)嶒灄l件的限制，本實驗檢測的臨床樣本數(shù)量較少，未來研究中要擴(kuò)大樣本量來對實驗可靠性進(jìn)行評價。該液相基因芯片檢測方法的建立，對流感病毒的臨床診斷分型和流感病毒的預(yù)防控制具有一定的意義。

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Development of a method for detecting type influenza virus A and B based on liquid?phase gene chip technology

CHEN Jinlong1，LV Gang1，2，ZHANG You1，F(xiàn)U Ruijia1，YIN Feifei1，2★
（1.Department of Microbiology，Hainan Medical University，Haikou，Hainan，China，571199；2.Key Laboratory of Translation Medicine Tropical Diseases，Hainan Medical University，Haikou，Hainan，China，571199）

ObjectiveTo develop a microbead?based liquid assay for rapid and high throughput detection and the typing of influenza virus A and B(INFA,INFB).MethodsRepresentative sequences has been downloaded from the GenBank database and aligned with BioEdit software.Specific primers and probes have been designed based on conserved sequences.The specificity of the primers and probes has been tested by blast of them with all the gene sequences in the GenBank database.The microbead?based liquid assay was developed by covalent linkage of the probes and microbeads.ResultsSpecific signals of mean fluorescent intensity have been observed in all of the tested samples.Very low signals have been obtain for non?specific samples.Mixture of both influenza virus A and B can obtain their positive signal respectively.The sensitivityof the method for INFA is 1～10 pfu and 10～100 pfu for INFB.11 clinical samples were detected using this method and the results were consistent with the detection results of real time reverse transcriptase?polymerase chain reaction(RT?PCR).ConclusionThe microbead?based liquid assay developed in this study for the typing of influenza virus A and B can be used for the detection and typing of influenza viruses.The assay provides a new method for the detection of the viruses.

Influenza virus A;Influenza virus B;Microbead?based liquid assay;Virus typing

作者單位：1.海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南，?？?71199
2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化重點實驗室，海南，?？?71199

國家自然科學(xué)基金課題（31460017，81672072）；海南省重點研發(fā)計劃項目（ZDYF2017091）；海南省自然科學(xué)基金項目（20158287）；海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（Hnkyzx2014?08，Hnky2017ZD?16）

★通訊作者：尹飛飛，E?mail：yinfeifeiff@163.com