孫莉 陳路 王華貴 趙相勝 胡小許 遲洪霞 祁榮 吳偉立★

乙型腦炎病毒的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法的建立

孫莉1陳路2王華貴3趙相勝2胡小許2遲洪霞4祁榮4吳偉立3★

目的建立一種可以準確、快速、特異檢測乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的一步法實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription?quantitative real time PCR，RT?qPCR）體系。方法參照NCBI數(shù)據(jù)庫的乙腦病毒全基因組序列，經(jīng)過一致性比對分析，在乙腦病毒保守的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）區(qū)段，設計相應的特異性引物以及Taqman?MGB探針，優(yōu)化檢測體系及反應條件，建立一步法RT?qPCR方法。利用登革熱、森林腦炎病毒、腸道病毒71型（EV71）、柯薩奇病毒A16型（CoxA16）、狂犬病毒培養(yǎng)物和臨床診斷為登革熱及手足口病人的血清樣本檢測其交叉反應。選擇15例疑似腦炎癥狀的病人血清樣本，以國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準的乙腦病毒檢測試劑盒作對照試劑盒，檢測其臨床適用性。結(jié)果所建立的乙腦病毒一步法RT?qPCR檢測方法重復性試驗Ct值的變異系數(shù)CV在0.46%～0.53%之間，最低可檢出5 copies/反應樣本。檢測體系與登革熱、森林腦炎病毒等黃病毒及EV71、CoxA16、狂犬病毒培養(yǎng)物等未發(fā)現(xiàn)交叉反應；64份臨床診斷為登革熱和手足口病人的血清樣本檢測也均為陰性。15份疑似乙腦感染的病人血清樣本的檢測結(jié)果與國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的乙型腦炎病毒檢測試劑盒檢測結(jié)果一致，但本方法操作步驟更少，檢測時間更短。結(jié)論本實驗建立的乙型腦炎病毒一步法實時熒光RT?qPCR檢測方法具有較高靈敏度、特異性，可用于乙型腦炎病毒的檢測。

乙型腦炎病毒；Taqman?MGB；流行性乙型腦炎；RT?qPCR

流行性乙型腦炎又稱為日本乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒（Japanese encephali?tis virus，JEV）引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病，臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激為特征。乙腦病毒為單股正鏈RNA黃病毒（Flavivirus）。病毒RNA只含一個開放閱讀框（open redaing frame，ORF），編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（C蛋白、PrM/M蛋白、E蛋白）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5）。根據(jù)E蛋白基因序列的同源性，可將JEV分為進化關系上存在明顯差異的5個基因型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ），各基因型的分布有一定的區(qū)域性［1?2］。乙腦是亞洲最常見的一種病毒性腦炎，每年至少50 000例臨床病例，其中多數(shù)為10歲以下兒童，導致約10 000人死亡，另有約15 000例留有長期的神經(jīng)?精神性后遺癥［3］。我國是乙腦流行的高發(fā)地區(qū)，近年來雖經(jīng)對兒童實施計劃免疫接種，使發(fā)病率明顯下降，但目前發(fā)病人數(shù)仍占世界乙腦病例的80%以上。乙腦臨床上與近年高發(fā)的腸道病毒感染引起的腦炎也難以區(qū)分［4］。因此構(gòu)建快速、靈敏、準確的JEV檢測方法對控制JEV引起的急性腦炎具有重要意義。目前比較常見的乙腦診斷方法有病毒分離、血清學診斷和常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription PCR，RT?PCR）檢測。由于JEV病毒載量低，利用細胞和小鼠來分離培養(yǎng)JEV具有分離困難且工作量大，檢測時間長的缺點，臨床應用有較大局限性［5?6］。血清學診斷則存在靈敏度較低的缺點。實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（re?verse transcription?quantitative real time PCR，RT?qPCR）與上述方法相比具有特異性高、本底低、結(jié)果易分析等優(yōu)點，已經(jīng)成功應用于病原體檢測、等位基因檢測、信號傳導等研究中［7］。本研究以乙腦病毒基因組保守的3′非翻譯區(qū)（3′untransla?teel region,3′UTR）區(qū)設計引物和 Taqman?MGB探針，建立了準確、特異的JEV一步法實時檢測體系。

1 材料及方法

1.1 毒株與樣本

登革病毒1型、2型、3型、4型，森林腦炎病毒，狂犬病毒，腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71），柯薩奇病毒A16型（coxsackie virus A16，CoxA16）分離培養(yǎng)株均來自于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所。

37例臨床診斷為登革熱血清樣本由廣州疾病預防控制中心提供。27份臨床診斷為手足口病的病人血清由華北石油管理局總醫(yī)院收集。15份發(fā)熱伴有腦炎癥狀的病人急性期（發(fā)病1～5天）和恢復期血清由華北石油管理局總醫(yī)院收集。

1.2 主要試劑和儀器

病毒核酸提取試劑盒（QIAamp?Viral RNA Mini Kit）購自德國QIAGEN公司；DH5α感受態(tài)細胞、QuantOne Step qRT ?PCR Kit（Probe）（FP304）購自天根生化科技（北京）有限公司；PAR?1重組表達載體由本實驗室自主研發(fā)保存。乙型腦炎病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）、流行性乙型腦炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）來自于北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司。

StepOnePlusTMPCR熒光儀（ABI，美國），Nano?Drop 2000［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］，超聲波細胞粉碎機（JY92?II，寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 引物探針設計與合成

本研究所用的序列信息來自于NCBI Gen?Bank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），下載所有上傳的乙腦序列信息，輸入自主研發(fā)的一致性分析軟件分析得到相對保守的UTR區(qū)域序列，利用ABI軟件包Primer Express3.0設計的特異引物及Taqman?MGB探針均由上海invitrogen公司合成。其序列及標記信息分別為：RT?F（5′CCAGTCTATTCCCAGGTGTCAA3′）；RT ?R（5′GCTGTAGAGGAGGTGGAAGGAC3′）；RT?P（5′FAM?TGCGGGGTCTCCT?MGB 3′）。

1.4 參考品的構(gòu)建與定量

乙腦病毒定量參考品為體外重組構(gòu)建的乙腦病毒UTR基因假病毒，具體步驟如下：體外合成乙腦病毒UTR基因的保守區(qū)域，將該片段與表達載體pAR?1連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆，經(jīng)測序驗證序列為乙腦病毒UTR基因序列。然后將陽性菌株37℃培養(yǎng)4 h左右加入終濃度為1 mmol/L IPTG進行誘導4 h以表達假病毒RNA，3 000 r/min離心10min收集菌體，采用超聲裂解液重懸，超聲破碎（40%振幅，350 W，停5 s，超聲5 s，30個循環(huán)），8 000 r/min冷凍離心10min，收集上清并加入DNase消化，即為制備的假病毒溶液。

利用Thermo scientific Nano Drop 2000分光光度計，測定其OD值，通過公式（6.02×1023拷貝數(shù)/摩爾）×（濃度g/μL）/（MW g/mol）=copies/μL換算為拷貝數(shù)。

1.5 病毒核酸提取

采用 QIAamp?Viral RNA Mini Kit試劑盒，按照說明書進行提取RNA，提取的總RNA于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 一步法RT?qPCR

一步法反應體系嚴格按照QuantOne Step qRT?PCR Kit（Probe）使用說明書進行配制，30μL 反應體系包括 2×QuantOne Step Probe RT?qPCR Mas?ter Mix 15μL，HotMaster Taq Polymerase（2.5 U/μL）1.2μL，Quant Rtase 0.7μL，上、下游引物0.75μL，探針為 0.5μL，模板 4μL，去離子水補充到30μL體系。對RT?qPCR反應體系中引物和探針濃度進行篩選，以獲得最佳擴增效率和最好的熒光強度。默認設置40個循環(huán)，95℃變性15 s，58℃擴增45 s。檢測儀器為ABI StepOnePlusTMPCR熒光儀。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immuno?sorbent assay，ELISA）檢測

15份發(fā)熱伴有腦炎癥狀的血樣采用ELISA進行抗體IgG檢測，乙型腦炎病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）來自于北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司。雙份陽性的樣本進行倍比稀釋測定滴度變化。

1.8 重復性試驗

同一 PCR 板上以 103、104、105copies/μL 的乙腦病毒核酸為模板，各重復測定6孔，計算檢測乙腦病毒 Ct的平均值（）公式（1）和標準差（SD）公式（2），按如下公式（3）計算變異系數(shù)（CV）。

1.9 靈敏度檢測

將提取好的標準品RNA從105copies/μL開始進行10 倍系列稀釋到 104、103、102、1014 個梯度，并進一步對倍稀釋4個梯度（5、2.5、1.25、0.625）后進行熒光檢測。

1.10 特異性檢測

登革病毒1型、2型、3型、4型，森林腦炎病毒，EV71，CoxA16，狂犬病毒培養(yǎng)物提取RNA后，經(jīng)熒光PCR檢測并統(tǒng)一稀釋至1×107copies/μL，檢測是否有交叉反應。37份臨床診斷為登革熱病人的血清樣本和27份臨床診斷為手足口病人的血清樣本分別經(jīng)核酸提取后，檢測是否存在交叉反應。

對來自于華北石油管理局總醫(yī)院15例發(fā)熱病人血清樣本分別應用北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司流行性乙型腦炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）、乙型腦炎病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）和本檢測體系同時進行檢測。對來自于廣州疾病預防控制中心37例臨床診斷為登革熱血清樣本和華北石油管理局總醫(yī)院收集的27份臨床診斷為手足口病的病人血清采用本檢測體系進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 一步法熒光檢測體系的建立

在30μL的反應體系中，當上下游引物工作濃度為 10 μmol/L 加入 0.75μL，Taqman?MGB 探針工作濃度為 10 μmol/L 加入 0.5μL，退火溫度為58℃，其余反應成分及程序均按照試劑說明書配置時，能獲得最佳熒光吸收信號。建立最佳的檢測體系。

2.2 重復性檢測結(jié)果及分析

將提取定量后的假病毒RNA稀釋為103、104、105copies/μL重復測定6次，進行熒光檢測。通過計算得到：3個稀釋度樣品6個重復反應獲得的Ct值的變異系數(shù)CV在0.46%～0.53%之間，數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 一步法RT?qPCR重復性測試結(jié)果Table 1 The reproducibility test results of one?step RT?qPCR

2.3 靈敏度驗證及最低檢測限的分析

將提取定量后的假病毒RNA按10倍梯度從105稀釋至101copies/μL，并進一步對比稀釋至0.625 copies/μL，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)：從105copies/μL開始標準品稀釋到 105、104、103、102、1015 個梯度，進行熒光檢測，能得到線性關系良好的擴增曲線，見圖1。進一步對比稀釋，在濃度為5 copies/μL，重復20次，18次可以獲得熒光，見圖2，表明可以達到5 copies/μL的最低檢測限。

圖1 梯度稀釋的RNA標準品擴增曲線Figure 1 Serial dilutions RNA standard amplification curve

2.4 一步法RT?qPCR的特異性結(jié)果及分析

利用該檢測體系對登革病毒1型、2型、3型、4型，狂犬病毒，森林腦炎病毒，EV71，CoxA16病毒培養(yǎng)物進行3次重復檢測，所有擴增結(jié)果顯示均為陰性，結(jié)果見圖3。

圖2 5 copies/反應時重復檢測20次擴增曲線Figure 2 Amplification curve of 5 copies/reaction for 20 repeats

圖3 其它能夠引起腦炎的相關病毒分離培養(yǎng)物擴增曲線Figure 3 Amplification curve of other related virus isolation Cultures that can cause encephalitis

來自于廣州疾病預防控制中心37例臨床診斷為登革熱血清樣本和華北石油管理局總醫(yī)院收集的27份臨床診斷為手足口病的病人血清樣本，本檢測體系檢測結(jié)果均為陰性。

對來自于華北石油管理局總醫(yī)院15例發(fā)熱病人血清樣本分別應用2種熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR和ELISA方法同時進行檢測，檢測結(jié)果見表2。13例經(jīng)2種實時熒光PCR檢測均為乙腦病毒陽性，其對應的雙份血清ELISA抗體檢測結(jié)果顯示9例存在陽轉(zhuǎn)和4例存在4倍升高。2例樣本實時熒光PCR檢測為陰性，其中一例樣本雙份血清檢測結(jié)果均為陰性，一例樣本雙份血清結(jié)果均為陽性，但滴度無顯著改變。

表2 15例發(fā)熱病人3種方法檢測結(jié)果Table 2 The detection results of 15 fever patients by 3 methods

3 討論

JEV是一種危害嚴重的人畜共患的蟲媒病毒，主要由蚊子和較小的蜱傳播，人類通常是終末宿主，因此對人類的健康及養(yǎng)殖業(yè)有較大的威脅。國內(nèi)盡管通過大規(guī)模使用疫苗使發(fā)病率大幅度下降，但近年來乙腦疫情出現(xiàn)了重新上升的趨勢，部分地區(qū)時有暴發(fā)或流行且JEV仍是引起病毒性腦炎的主要病原［8］。病毒性腦炎的早期診斷能有效減輕免疫引起的腦組織損傷，降低后遺癥發(fā)生率及死亡率，也是治療成功的關鍵［9］。傳統(tǒng)的實驗室檢測主要采用病毒分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、腦電圖和影像學檢查的方法診斷病毒性腦炎。JEV分離培養(yǎng)是檢測的“金標準”，但由于其低通量和低靈敏性的缺點，不適合大規(guī)模臨床應用。ELISA的方法雖然也可對JEV進行檢測，但是會與其他黃病毒屬病毒（如登革病毒）出現(xiàn)交叉反應。同時上述檢測方法整個過程操作復雜，耗時長，無法起到對病毒快速診斷的作用。與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比，核酸檢測方法由于靈敏度和特異性方面的優(yōu)勢，已成為實驗和臨床診斷常用的檢測手段［10］。其中，實時熒光定量PCR技術(shù)既保持了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏度高等特點，又克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)中存在的假陽性和不能準確定量的缺點，并且具有實驗重復性好、省時省力、快速、特異性好等特點。實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)成熟應用于多種細菌及病毒性疾病的臨床診斷［11?12］。然而針對JEV 的實時熒光定量PCR 檢測方法相對較少。

本研究建立了檢測乙腦病毒的一步法RT?qP?CR檢測體系，相比于傳統(tǒng)的乙腦病毒實驗室檢測方法，該檢測方法在靈敏度、特異性以及操作方便性、時效性等方面具有極大優(yōu)勢。其重復性試驗Ct值的變異系數(shù)CV在0.46%～0.53%之間，低于研究報道的CV［13］。本研究建立的JEV檢測體系靈敏度更高，最低可以檢測到5 copies/反應的假病毒稀釋液，低于目前已報道的熒光定量PCR最低檢測限（10 copies/反應）［14］。通過檢測臨床常見的同種屬相近的及引起癥狀相似的其他病原體，相互之間不存在交叉反應。表明本研究建立的檢測體系能夠特異的對乙腦病毒進行檢測。應用本檢測體系與北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司研制的流行性乙型腦炎病毒核酸檢測試劑盒（PCR?熒光探針法）、乙型腦炎病毒抗體IgG檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）分別對15份發(fā)熱病人樣本進行檢測，對比本檢測體系與同類試劑盒的一致性、靈敏性、實用性等。發(fā)現(xiàn)本檢測體系與吉比愛PCR?熒光探針法檢測試劑盒結(jié)果一致，檢出的13例陽性樣本也與ELI?SA檢測結(jié)果吻合。其中，ELISA檢測方法較2種PCR?熒光探針方法多檢出一例陽性，后續(xù)臨床驗證排除乙腦病毒感染。表明ELISA法會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。而本研究建立的乙腦病毒一步法RT?qPCR檢測方法可以提高對乙腦病毒的檢出率和準確率，相比于ELISA檢測方法具有明顯優(yōu)勢［15?16］。

本研究建立的一步法RT?qPCR檢測體系結(jié)合應用原有RT?PCR和實時熒光PCR的優(yōu)勢，使逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR擴增過程同步進行。相對于傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄和PCR分開進行，既減少了cDNA二聚體的形成，提高擴增反應效率；同時減少操作步驟，縮短檢測時間。本檢測體系在85min內(nèi)可完成對乙腦病毒的快速檢測，比吉比愛的PCR?熒光探針法檢測試劑盒檢測時間縮短了近30min。而乙腦病毒感染的早期診斷可以有效減輕免疫引起的腦組織損傷，降低乙腦病毒感染后遺癥的發(fā)生率及死亡率。

綜上所述，本研究建立的乙腦病毒一步法RT?qPCR檢測體系具有較強的特異性和較高的敏感性，并進一步簡化了操作步驟，縮短了檢測時間，能夠?qū)崿F(xiàn)對乙腦病毒的早期快速檢測?？蔀橐夷X病毒的臨床診斷和疫情暴發(fā)時的實驗室應急診斷提供快速有效的實驗室篩查手段。

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Development of one?step RT?qPCR for detection of Japanese encephalitis virus infection

SUN Li1,CHEN Lu2,WANG Huagui3,ZHAO Xiangsheng2,HU Xiaoxu2,CHI Hongxia4,QI Rong4,WU Weili3★
(1.Clinical Laboratory of Huabei Oil Field Hospital,Renqiu,Hebei,China,062552;2.Beijing Macro&Micro?test Bio?Tech Co.,Ltd.Beijing,China,101300;3.Beijing Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences,Beijing,China,100101;4.Gastroenterology Department of Huabei Oil Field Hospital,Renqiu,Hebei,China,062552)

ObjectiveTo establish a sensitive and specific one?step reverse transcription?quantitative real time PCR(RT?qPCR)method for detection of Japanese encephalitis virus(JEV)infection.MethodsBased on the whole genome sequence of the encephalitis virus in the NCBI database,the corresponding specific primers and Taqman?MGB Probe were designed in the 3′untranslated region(UTR)of the Japanese encephalitis virus.The detection system and reaction conditions were optimized.The cross?reactivity was measured by using dengue fever virus,forest encephalitis virus,enterovirus 71(EV71),coxsackie virus A16(CoxA16),rabies virus cultures and clinical sera samples of clinically diagnosed dengue fever and hand?foot?mouth patients.15 patients with suspected encephalitis were enrolled in this study.The Japanese encephalitis virus test kit was registered by the China Food and Drug Administration(CFDA)used as a control kit to detect its clinical applicability.ResultsThe repeatability test revealed that coefficient of variation(CV)of Ct value is 0.46%～0.53%.The sensitivity attends to 5 copies/reaction.No cross?reactions were found to dengue,forst encephalitis virus,EV71,CoxA16,rabies virus.The test result of 37 dengue fever and 27 hand?foot?mouth patients were also negative.The results of present developed method to suspended patients are consistent with the CFDA approved kit while with less manual handling steps and shorted operating time.ConclusionThe developed one?step RT?qPCR method for detection of encephalitis virus infection with high sensitivity and specificity is suitable to the clinical use.

Japanese encephalitis virus;Taqman?MGB;Epidemic encephalitis type B;RT?qPCR

作者單位：1.華北石油管理局總醫(yī)院檢驗科，河北，任丘062552
2.北京宏微特斯生物科技有限公司，北京101300
3.中國科學院北京基因組研究所，北京100101
4.華北石油管理局總醫(yī)院消化科，河北，任丘062552

★通訊作者：吳偉立，E?mail：wuwl@big.ac.cn

注：孫莉和陳路為并列第一作者