曲守方 于婷 孫楠 李麗莉 陳芳 吳英松 黃杰★

?述 評?

染色體非整倍體無創(chuàng)產前檢測技術質控要點及臨床應用進展

曲守方1于婷1孫楠1李麗莉1陳芳2吳英松3黃杰1★

基于下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的染色體非整倍體無創(chuàng)產前檢測技術是產前診斷領域的重要突破，其檢測原理簡單、技術靈敏度和準確性很高，已成為目前非整倍體產前篩查發(fā)展及推廣的主要方向。但由于NGS技術檢測流程復雜，影響因素較多，需要在樣本采集、運輸、核酸提取、文庫構建、上機測序、數據分析各個關鍵節(jié)點進行質控。同時，由于其試劑成分復雜、技術難度大、社會關注度高，也需對注冊產品指標進行明確。鑒于此，本文對染色體非整倍體無創(chuàng)產前檢測技術質控要點、產品規(guī)范要求及臨床應用狀況進行簡要評述。

染色體非整倍體無創(chuàng)產前檢測；下一代測序；質控要點；產品規(guī)范

染色體非整倍體是指相對于人正常的46條染色體而言，細胞中的某一條或幾條染色體數目增加或減少，與嬰幼兒期顯著的發(fā)病率和死亡率有著密切的關系。新生兒中染色體異常的發(fā)病率為1/160，其中 21?三體綜合征（trisomy 21，T21）、18?三體綜合征（trisomy 18，T18）和 13?三體綜合征（trisomy 13，T13）是3種最主要常染色體非整倍體疾病，在新生兒中發(fā)病率分別為1/800～1/600、1/7 000～1/3 500 和 1/6 000～1/5 000［1］。針對染色體疾病的產前檢測主要以血清學篩查、羊水穿刺為主。但血清學篩查準確度較低，具有5%的假陽性率及20%～40%的漏診率；羊水穿刺雖然準確度較高，但是對孕婦具有創(chuàng)傷性，有1%的流產風險，不便于大規(guī)模的產前檢測［2?3］。1997 年，Lo 等人［4］在孕婦血漿和血清中發(fā)現了胎兒游離DNA片段，這為遺傳病的無創(chuàng)性產前基因檢測提供了理論基礎。2008年，首次通過下一代測序（next gen?eration sequencing，NGS）技術利用母親血漿游離DNA（cell?free DNA，cfDNA）進行無創(chuàng)染色體非整倍體（non?invasive prenatal testing，NIPT）檢測［5?6］，隨后大樣本研究表明該技術非常有效［7］。由于基于NGS技術的NIPT具有無創(chuàng)取樣、無流產風險、高靈敏度、高準確性（≥99%）等特點，成為目前染色體非整倍體產前篩查與診斷技術的主要手段。美國婦產科醫(yī)師協會（the American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）、美國醫(yī)學遺傳學會（the American College of Medical Ge?netics and Genomics，ACMG）、國際產前診斷學會（the International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）等多個聯盟組織正在極力推進這項技術的臨床應用［8?10］。2016 年 7月28日 ACMG發(fā)表最新聲明：NIPT是目前染色體非整倍體最敏感的檢測技術手段，沒有之一，并且能夠在不同年齡人群中替代傳統(tǒng)的三體綜合征篩查技術［11］。但由于NGS技術檢測流程復雜，影響因素較多，需要在整個實驗流程進行嚴格質控。同時，由于其試劑成分復雜、技術難度大、社會關注度高，也需明確其產品規(guī)范要求。因此，本文對NIPT的基本原理、質控要點、產品規(guī)范要求進行簡要闡述并對其在國內的發(fā)展歷程、適應癥的拓展及臨床應用現狀進行簡要評述，期望有助于促進NIPT技術和市場的規(guī)范、健康、快速、有序發(fā)展。

作者單位：1.中國食品藥品檢定研究院，北京100050
2.深圳國家基因庫，廣東，深圳518083
3.南方醫(yī)科大學檢驗與生物技術學院，廣東，廣州510515

1 基本原理

1997年，Lo等人［4］研究證實在孕婦的血漿中存在有胎兒游離DNA片段，為無創(chuàng)DNA產前檢測技術提供了依據。通過高通量測序技術可以對這些胎兒游離DNA進行檢測，利用生物信息學分析軟件系統(tǒng)對檢測結果進行分析，最終得出胎兒患有21?三體綜合征、18?三體綜合征和13?三體綜合征的風險率。首先在孕婦血漿中的游離DNA片段兩端加上通用的測序接頭，構建好可以用于測序的測序文庫。利用高通量測序儀對構建好的測序模板進行測序，最終獲得每個DNA片段的堿基序列。利用生物信息學分析軟件系統(tǒng)把這些序列定位到人類基因組參考圖譜上，計算出樣本的游離DNA序列被分配到每條染色體上的具體數值比例，當胎兒的某條染色體數目發(fā)生異常時，其對應的游離DNA序列數量會小幅增加，通過高通量測序技術和生物信息學數據分析可以檢測出這種微量變化，從而獲得染色體數目的信息，進而實現對21?三體綜合征、18?三體綜合征和13?三體綜合征進行快速的產前輔助診斷。

2 質控要點

2.1 樣品采集、運輸

2.1.1 樣品采集

NIPT檢測樣品為孕婦外周血血漿。一般采集5 mL外周靜脈全血并分離血漿。使用的采血管可根據實際情況選擇EDTA抗凝管或者Streck Cell?Free DNA BCT管。其中EDTA抗凝采血管采集后4℃保存，8 h內進行血漿分離。Streck Cell?Free DNA BCT采血管具有保護游離DNA不降解及細胞不破碎的作用，可常溫保存（18～25℃），72 h內進行血漿分離。兩步離心法分離血漿，1 600 r/min 4℃離心10min，吸取上清血漿，16 000 r/min 4℃離心10min，吸取上清血漿，立即進行游離DNA的提取或者立即放入-20℃或-80℃冰箱中保存。

2.1.2 保存與運輸

全血樣本：EDTA抗凝管的外周血在4℃條件下運輸，須在8 h內送達并及時分離血漿；Streck Cell?Free DNA BCT 采血管外周血常溫（18～25℃）運輸，72 h內送達并及時分離血漿。血漿樣本應在干冰條件下運輸，到達后及時存放于-80℃冰箱中。

2.2 游離DNA提取

一般使用200～600μL血漿提取游離DNA，保證其片段多態(tài)性有足夠的代表性。提取方法可以使用磁珠法，也可以使用離心柱法。但應在標本制備區(qū)進行并設立用于建庫的DNA質量控制標準，如規(guī)定建庫的DNA量并設立最低起始量等。一般要求濃度大于0.05 ng/μL，0.1～0.2 ng/μL為佳。

2.3 文庫制備、質控

文庫制備應當嚴格按照標準操作流程進行。多個樣本pooling時一般使用barcode對樣本進行區(qū)分，每個樣本應建立一個或一組唯一的barcode。每個barcode只能用于一個標本，但當樣本數量大于標簽barcode數時，只要不在同一個檢測run，標簽barcode都是可以重復使用的。應建立文庫檢測濃度及文庫片段分布范圍的文庫質量控制標準。一般要求文庫DNA濃度＞0.1 ng/μL且文庫長度在200～300 bp。

2.4 測序及數據分析

NIPT檢測主要應用Z檢驗（Z test）。Z檢驗是一般用于大樣本平均值差異性檢驗的方法。它是用標準正態(tài)分布的理論來推斷差異發(fā)生的概率，從而比較2個平均數的差異是否顯著。Z?值的應用條件為大樣本量以及數據符合正態(tài)分布。

對孕婦血漿游離DNA進行全基因組測序，獲取DNA片段的堿基序列；將堿基序列與人類參考基因組（hg19）進行比對得到堿基序列的確切位置；去除低質量、多匹配和非完全匹配的堿基序列；將每條染色體等分為50 kb的窗口，根據堿基序列的位置信息，計算分配到每個窗口的原始讀段數，使用局部加權回歸方法Loess對每個窗口的原始讀段數進行校正，以消除測序導致的GC偏好性。采用唯一比對的序列進行后續(xù)統(tǒng)計，獲得大樣本樣品的總有效數據（total mapped readsn）以及比對各個染色體有效數據（mapped to chromo?somenm）。為了消除不同樣本的測序數據量差異對檢測結果的影響，分別將各個染色體的有效數據除以總有效數據即獲得有效數據百分比（unique reads ratio，UR），見計算公式（1）：

其中m為染色體編號，m∈（1...22，X，Y），n為大樣本樣品數。計算大樣本樣品的UR均值及方差，見計算公式（2）：

其中m為染色體編號，m∈（1...22，X，Y），n為大樣本樣品數。

計算每個樣品各個染色體的Z值，見計算公式（3）：

其中m為染色體編號，m∈（1...22，X，Y），n為樣品數。

根據統(tǒng)計學原理，出現在Z?值為正負3以外的數值，則有99.9%的可能為陽性，因此，通常將Z?值=3定為參考值分界點。|Z?值|＞3則判斷為胎兒染色體非整倍體陽性。如果某個樣品的染色體chr21的Z?值大于3，則認為該樣品的chr21的UR顯著（α＜0.005）離群，即chr21?三體。

2.5 陰陽性質控

為了控制實驗流程的重復性或效率，保證檢測有效性，需在檢測流程中加入陰陽性質控品，并能夠監(jiān)控從樣本DNA片段到最終測序結果全過程。陰性對照品、陽性對照品濃度可根據不同測序平臺的需求確定。建議每個檢測run或測序都要進行陰陽性質控品的檢測。

3 產品規(guī)范要求

為規(guī)范胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒（高通量測序法）的產品設計開發(fā)、性能評價的診斷試劑技術指標和要求，并為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考，中國食品藥品檢定研究院制定了《基于孕婦游離DNA的胎兒染色體非整倍體檢測試劑質量控制技術評價指南（高通量測序法）》［12］。主要從測序平臺的適用性、文庫構建和測序策略、數據量控制、陰陽性符合率、嵌合和微缺失微重復檢出率、檢測限和重復性等方面提出了具體的產品規(guī)范要求。

國內下一代測序平臺主要分為以Illumina公司、華大基因公司為代表光學技術和以Thermo公司為代表半導體技術。不同測序平臺儀器大小、通量、讀長、運行時間及測序成本等特異性參數不同，應結合具體的臨床應用需求選擇合適的測序平臺并進行評估。不同的測序平臺要求的測序檢測方法和文庫構建方法也有所不同，與測序檢測方法相對應的文庫構建方法應該給予充分的考慮，特別是要求和預期用途匹配。鑒于目前高通量測序技術的復雜程度，在文庫構建、測序等技術過程中發(fā)生人為錯誤或意外的情況不能完全避免，應針對文庫構建失敗率進行限定，國家參考品中的文庫構建失敗率應不高于1%。

在母體血液中胎兒的游離DNA片段是隨機的序列而不是一個固定的序列，盡管其濃度隨著孕周增加而增加，但是其序列在每次采樣時都會有不同。在現行的國家參考品中，考慮到降低數據量可能導致假陰性和假陽性的發(fā)生，單個樣本數據量的要求是不低于3.5 M reads。采用片段化選擇的方式對樣本提取的游離DNA或文庫構建后的產物等過程中進行片段篩選，可以提高胎兒游離DNA和母體游離DNA的相對比例，但其數據量控制要求仍需進行驗證后提供合理的有效數據量控制指標。

NIPT檢測DNA除胎兒游離DNA和母體游離DNA外，可能還有病原體的游離DNA、試劑中污染物種的DNA以及來自環(huán)境的DNA等。所以應分析樣本中胎兒游離DNA的量、片段大小等特性。在現行國家參考品中，陰性參考品（其他類型染色體非整倍體和其他染色體正常陰性樣本）應不得檢出T21、T18和T13陽性。由于平均胎兒游離DNA濃度為10%左右，所以陽性參考品包括10%濃度的T21、T18和T13樣本，要求檢出率達到100%。70%胎盤異常嵌合體應全部檢出，30%異常嵌合體可為檢出或未檢出。對于胎兒微缺失微重復，大于20 Mb的微缺失微重復應能檢出，其余微缺失微重復參考品應不得檢出T21、T18和T13陽性。檢測限參考品的濃度一般為5%到3.5%。要求5%濃度檢測限參考品（包括流產組織、高GC、膽紅素和細胞系樣本）應全部檢出，3.5%濃度檢測限參考品應準確檢出不低于50%。此外，為考察試劑的重復性，應建立重復性考核指標。

4 染色體非整倍體無創(chuàng)產前檢測技術臨床應用進展

作為一個具有良好前景的新興技術，NIPT臨床應用在國內經歷了無監(jiān)管、叫停、監(jiān)管3個階段。2010年，美國Sequenom和Verinata Health等公司以第三方實驗室的形式相繼推出NIPT服務。同年北京貝瑞和康以及深圳華大基因也利用相似的技術進入無創(chuàng)產前診斷市場，隨后安諾優(yōu)達、達安基因、諾禾致源等公司相繼進入染色體非整倍體無創(chuàng)產前檢測市場。普遍采取的市場模式是由測序公司從醫(yī)院收集樣本后提供檢測服務，但相關儀器和產品尚未獲得醫(yī)療器械注冊證，市場相對混亂，也嚴重影響了該技術在醫(yī)院的推廣度和普及率。2014年2月，國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）和衛(wèi)計委針對NIPT應用初始的混亂，聯合發(fā)布《關于加強臨床使用基因測序相關產品和技術管理的通知》［13］，在全國范圍內叫停了NIPT 服務，但并非終止這項技術。2014年3月，國家衛(wèi)計委醫(yī)政醫(yī)管局開始接受高通量測序技術的臨床應用試點單位申報，并于2015年初，由國家衛(wèi)計委婦幼司下發(fā)《國家衛(wèi)生計生委婦幼司關于產前診斷機構開展高通量基因測序產前篩查與診斷臨床應用試點工作的通知》［14］，明確規(guī)定了108家產前診斷機構作為試點單位開展NIPT項目。至此，NIPT第一階段的臨床應用正式開展。同時，2014～2015年，CFDA先后批準了華大基因、中山大學達安基因股份有限公司、北京博奧晶典生物技術有限公司和北京貝瑞和康生物技術有限公司的高通量測序儀和測序試劑。NIPT的應用逐漸走上正軌。經過了NIPT項目2年多的試點運營，衛(wèi)生部門積累了NIPT項目開展、質量控制、監(jiān)管方式等方面的經驗。2016年8月8日，中國食品藥品檢定研究院發(fā)布《第二代測序技術檢測試劑質量評價通用技術指導原則》［15］。2016年10月27日，衛(wèi)計委發(fā)布了《國家衛(wèi)生計生委辦公廳關于規(guī)范有序開展孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與診斷工作的通知》［16］，正式廢止此前有關高通量基因測序產前篩查與診斷試點機構的相關規(guī)定，取消108家臨床試點單位與9家醫(yī)學檢驗所的臨床試點。這意味著，原則上所有具備相關資質的醫(yī)療機構、醫(yī)學檢驗所都可開展無創(chuàng)DNA產前篩查與診斷。2017年3月15日，中國食品藥品檢定研究院發(fā)布《基于孕婦游離DNA的胎兒染色體非整倍體檢測試劑質量控制技術評價指南（高通量測序法）》［12］，進一步對產品規(guī)范給予指導性意見。至此，國家衛(wèi)生部門對NIPT的限定性逐步放開，對NIPT在合理監(jiān)管下廣泛應用于全國起到巨大的推動作用，翻開了該技術臨床應用的新篇章。2016年中國NIPT市場推廣約200萬人份，創(chuàng)造了30億元～40億元的銷售額。在無創(chuàng)產前領域，無論是技術還是市場推廣成熟度，中國都已處于國際領先地位。

2016年10月27日，衛(wèi)計委發(fā)布的《國家衛(wèi)生計生委辦公廳關于規(guī)范有序開展孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與診斷工作的通知》中明確指出，除孕周小于12周；夫婦一方有明確染色體異常；一年內接受過異體輸血、移植手術、異體細胞治療等；胎兒超聲檢查提示有結構異常須進行產前診斷；有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患基因病高風險；孕期合并惡性腫瘤；醫(yī)師認為有明顯影響結果準確性的其他情形；這7條作為不適用情形外，孕婦或其家屬在充分知情同意情況下，皆可選擇NIPT［16］。隨著NIPT在臨床應用上的廣泛開展，NIPT在產前篩查的適應征又擴大到胎兒微缺失微重復綜合征（microdeletion/microduplication syndrome，MD）的檢測。MD是除染色體非整倍體之外的另一大引起新生兒出生缺陷的遺傳性因素，是一類由于染色體拷貝數變異（copy number variation，CNV）而致的具有復雜表型的綜合征性疾病。MD患者往往有智力發(fā)育障礙伴有或不伴結構異常。目前對MD的產前診斷多局限在已有先證者的病例或者超聲檢查異常的病例，沒有生化標志物可篩查MD。通過傳統(tǒng)的產前篩查方式，如果胎兒攜帶致病的CNV但是胎兒超聲提示未見異常，該樣本就錯失了產前診斷的機會。自從2011年首例報道應用NIPT進行MD的產前診斷后［17］，又有多篇基于NGS技術無創(chuàng)檢測MD的相關案例［17?25］。這些研究證實了NIPT 用于胎兒 MD檢測的可行性，但需要較目前NIPT方法更高的胎兒游離DNA濃度和測序深度，從經濟學角度考慮尚不適宜進行大范圍的臨床推廣。多篇研究通過改進算法提高檢測的靈敏度，從而降低微重復微缺失檢測所需的測序深度，可以在一定程度上降低成本［26?29］?；诖?，國外的 NIPT 檢測巨頭Natera、Sequenom、Verinata Health等機構擴大了NIPT的篩查范圍，開始通過臨床實驗室改進法案（clinical laboratory improvement amendments，CLIA）認證實驗室提供MD的商業(yè)檢測服務，范圍主要涉及 22q11.2微缺失（DiGeorge）、Angelman、Jacovsen、1p36 微缺失、Cri?du?chat、Prader?Willi、Langer?Giedion 和 Wolf?Hirschhorn 綜合征這幾種發(fā)病率較高的MD綜合征。國內的華大基因和貝瑞和康也分別升級了各自NIPT檢測的服務范圍，同樣也提供如22q11.2微缺失、Angelman等綜合征的檢測結果。同時國際上部分學會和組織也出臺了相關指南和共識。ACOG和ISPD在2015年針對NIPT檢測更新了指南，ACOG保守地指出對于MD的篩查尚未被臨床驗證，其靈敏性和特異性也沒有確切證據；ISPD則表示NIPT擴增檢測應當限定在研究清楚的MD綜合征范圍內，并需要結合臨床指針共同判斷。2016年7月ACMG發(fā)表最新聲明：對于已知CNVs，醫(yī)生應該在檢測之前充分告知孕婦NIPT檢測范圍會擴大至CNVs，并且CNVs檢測結果具有較高的假陽性和假陰性。但如果NIPT發(fā)現了CNVs，應該進行產前診斷驗證［11］。結合目前的研究進展和指南建議，用NIPT的方法檢測5 Mb以上且具有較為明確臨床意義的CNV具有一定可行性，但仍缺乏大規(guī)模前瞻性的CNV臨床檢測數據，用于商業(yè)化的臨床篩查應慎重使用。

5 小結與展望

政策支持和超高的靈敏度使NIPT成為染色體非整倍體臨床篩查的主要技術手段。2016年NIPT全國檢測數量約200萬人次，普及率10%左右。其在大中城市的普及率已大于15%，并有較快的增長率。部分發(fā)達地區(qū)甚至已經提出利用該技術來基本消滅唐氏綜合征。但是，我們還應看到NIPT項目的普及仍有巨大的提升空間，并存在明顯的不均衡。偏遠地區(qū)的NIPT檢測無論是就檢測數量還是地區(qū)覆蓋率而言，與發(fā)達地區(qū)相比均有明顯的差距。即使NIPT價格呈逐年下降的趨勢，但相對于傳統(tǒng)的唐篩項目而言，檢測價格仍處于較高水平。并且因為NIPT檢測費用并未納入醫(yī)療保險，對于全國絕大多數地區(qū)，尤其是縣級市及下屬區(qū)、鎮(zhèn)及農村的家庭而言，其檢測費用過于昂貴，在無政府補貼的情況下，大部分家庭尚不傾向于進行NIPT檢測。同時全國能夠開展NIPT檢查項目的醫(yī)療機構仍處于剛剛放開的階段，大部分醫(yī)療機構在醫(yī)療環(huán)境和醫(yī)療人員技術要求上尚不能滿足臨床需求。由此，積極提升醫(yī)療人員技術水平、大力提高無創(chuàng)產前篩查的總體普及率、盡量減少不同地區(qū)檢測水平的不均衡性，對降低出生缺陷率、提高整體優(yōu)生優(yōu)育水平十分重要。

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Quality control and clinical application of non?invasive prenatal test for chromosomal aneuploidy

QU Shoufang1，YU Ting1，SUN Nan1，LI Lili1，CHEN Fang2，WU Yingsong3，HUANG Jie1★
（1.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing，China，100050；2.China National Genebank，Shenzhen，Guangdong,China，518083；3.School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Non?invasive prenatal testing(NIPT)for fetal aneuploidies by next generation sequencing of maternal plasma DNA is a developing,innovative technology.This technology is highly sensitive and specific and has been validated in multiple clinical trials.NIPT has been recommended as the priorities for fetal aneuploidy by several professional societies.However,in consideration of the complicated workflow and many influencing factors,quality control throughout the entire process,such as sample collection and transportation,cfDNA isolation,library construction,sequencing,data analysis,is essential.Likewise,because of complex reagent ingredients,difficult technical requirements and high social concerns,it is also necessary to define the product performance criteria.In view of this,the issue of quality control,specifications and the progress of the clinical application progress of NIPT based on NGS technology will be briefly commented in this paper.

NIPT;NGS;Quality control points;Product specification

廣州市重大科技攻關項目（2014Y2?00220）

★通訊作者：黃杰，E?mail：jhuang5522@126.com